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人源TDRD蛋白Tudor结构域识别不同甲基化修饰piwi蛋白的特异性研究

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人源TDRD蛋白Tudor结构域识别不同甲基化修饰PIWI蛋白的特异性研究

作者：甘冰华中师范大学

学位级别：硕士

piRNA(piwi-interacting RNA)是庞大的非编码RNA家族的成员之一,一般与 piwi(P-element-induced wimpy testis)蛋白特异性结合形成 piRISC(piRNA-induced silencing complex)复合物进而参与正常配子发育和繁殖的转录调控。研究表明piwi蛋白的N端多存在精氨酸甲基化修饰,此修饰为TDRDs(Tudor domain containing proteins)提供了结合位点,而TDRDs-piwi之间的相互作用是piwi正常发挥其生物学功能的关键前提,因此研究两者之间的互作是非常有价值的。目前关于TDRDs与piwi蛋白之间的相互作用的研究已经越来越深入,但是仍然存在许多空白亟待弥补。前期研究发现,TDRDs含有特异的Tudor功能结构域,可以识别甲基化精氨酸修饰。目前,人源TDRDs蛋白家族已鉴定13个TDRD蛋白,其中,TDRD2、TDRD3、SND1(staphylococcal nuclease domain-containing 1)这三种蛋白Tudor结构域识别piwi蛋白的特异性及分子机理已经被阐述,而其他的TDRDs蛋白识别piwi蛋白的特异性及结构基础却知之甚少,仅有研究证明它们可能与piwi蛋白相互作用,但是作用位点和识别机理还需要进一步研究。基于SND1等Tudor结构域蛋白的结构信息和piwi蛋白结合机制,我们猜测其余未解析出蛋白结构的TDRD蛋白可能与SND1等蛋白具有相同的结合机制,即这些TDRD蛋白的某个或者某几个Tudor结构域中含有一个由芳香族氨基酸构成的芳香槽,甲基化精氨酸修饰的piwi蛋白可以通过甲基基团与芳香族氨基酸之间的相互作用插入芳香槽中以实现二者的结合。于是,本论文首先对人源TDRDs蛋白家族成员中所有的Tudor结构域氨基酸序列进行多重序列比对,发现这些Tudor结构域中或多或少都具有部分与SND1中形成芳香槽有关的保守氨基酸残基。因此,综合氨基酸序列比对的结果及前人的研究,本论文选取了有一定研究基础的TDRD1、TDRD2、TDRD4、TDRD7和TDRD9五种蛋白作为研究对象,这五种蛋白中包括了三种不同保守性的Tudor结构域,具有一定代表意义。我们首先根据序列比对结果针对以上五种蛋白中的Tudor结构域中的保守氨基酸残基设计突变体,并通过基因重组成功构建了 29种突变体的表达载体,经表达纯化后得到了突变体和野生型的可溶性蛋白总计30种。我们利用荧光偏振分析(Fluorescence Polarization Assay,FP)检测这些可溶性蛋白与不同甲基化精氨酸修饰的piwiL1(piwi-like protein 1)多肽的结合情况,基于FP的实验结果筛选部分蛋白进行蛋白结晶和同源建模,并结合三方面的结果来共同分析TDRD蛋白与不同甲基化精氨酸修饰的piwiL1多肽的结合机制。结果表明,TDRD1、TDRD1和TDRD1都更倾向于结合对称双甲基化精氨酸(SDMA)修饰的piwiL1多肽,且结合机制与SND1类似,但是TDRD1结合能力最弱,原因可能是因为TDRD1不具备完整的芳香槽;TDRD4中仅有TDRD4显示出了较强的结合甲基化精氨酸修饰piwiL1多肽的能力,但是它更倾向于结合不对称双甲基化精氨酸(ADMA)修饰的piwiL1多肽,同样,TDRD9也更偏好结合ADMA修饰的piwiL1多肽,但是两者中TDRD4的结合能力相较而言更强,TDRD4可能通过芳香槽与甲基基团的相互作用来结合ADMA修饰的piwiL1多肽,而TDRD9的结合机制则可能与TDRD4不同,可能存在某种特别的结合机制。同时,本论文还进行了 Tudor结构域蛋白与piwi蛋白的共结晶实验,但最终我们没有获得复合物晶体。在此实验基础下,我们利用合作者制备的TDRD2的Fab抗体与TDRD2的Tudor结构域进行了共结晶实验,并成功的获得并解析了TDRD2-Fab的复合物结构。此方法为我们进一步研究Tudor结构域及其他蛋白的结构奠定了基础。

关键词： piwi蛋白 TDRD蛋白 Tudor结构域荧光偏振分析结晶

piwi蛋白与基因的表达调控及其在肿瘤中的作用

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国际妇产科学杂志 2014年第5期41卷 558-561页

作者：张红丽凌斌冯定庆安徽医科大学附属省立医院妇产科合肥230001 中日友好医院妇产科安徽医科大学附属省立医院安徽省分子医学重点实验室合肥230001

piwi蛋白是Argonaute蛋白家族的一类,正常情况下可表达于不同物种的雄性睾丸组织中,主要与piwi相关RNA(piRNA)相互作用,导致转座子基因的沉默,保护生殖干细胞基因组的稳定性和完整性,对生殖干细胞的自我更新、配子和胚胎的发育具有重要... 详细信息

piwi蛋白是Argonaute蛋白家族的一类,正常情况下可表达于不同物种的雄性睾丸组织中,主要与piwi相关RNA(piRNA)相互作用,导致转座子基因的沉默,保护生殖干细胞基因组的稳定性和完整性,对生殖干细胞的自我更新、配子和胚胎的发育具有重要的作用。另外,在人类多种肿瘤组织如胃癌、乳腺癌、宫颈癌中发现有piwi蛋白表达,同时在肿瘤干细胞中也有piwi蛋白的表达,抑制其表达可通过多种不同机制抑制肿瘤细胞的增殖和凋亡,说明piwi蛋白与肿瘤的发生发展有关。现就piwi蛋白调控基因表达及其与肿瘤发生发展的关系作一综述。

关键词：肿瘤干细胞肿瘤干细胞 piwi蛋白

piRNA与piwi蛋白家族功能的研究进展

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医学综述 2013年第17期19卷 3075-3077页

作者：李跃波冯定庆凌斌安徽医科大学附属省立医院分子医学实验室合肥230001

生物体中的RNA可以分为编码RNA和非编码RNA两大类,非编码RNA中存在许多小分子RNA,它们组成了细胞中的RNA调控网络。近年来在哺乳动物的睾丸内发现了一种新型的非编码小分子RNA-piRNA,这种小分子RNA与Argonaute家族中的piwi蛋白成员相结... 详细信息

生物体中的RNA可以分为编码RNA和非编码RNA两大类,非编码RNA中存在许多小分子RNA,它们组成了细胞中的RNA调控网络。近年来在哺乳动物的睾丸内发现了一种新型的非编码小分子RNA-piRNA,这种小分子RNA与Argonaute家族中的piwi蛋白成员相结合才能发挥调控作用。两者共同参与基因表达和调控、蛋白质翻译、配子发生等生物学过程,对生物的生长发育产生了深远的影响。该文对piRNA和piwi蛋白的结构、特性以及相互作用进行综述。

关键词： Argonaute家族 piwi蛋白小分子RNA

piRNA在小鼠雄性生殖系统中的起源与功能

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中华男科学杂志 2016年第8期22卷 746-750页

作者：张玲韩晓冬南京大学医学院免疫与生殖生物学实验室&生命分析化学国家重点实验室江苏南京210093 南京大学医学院江苏省医学分子技术重点实验室江苏南京210093

piwi相互作用RNA（pi RNA）是2006年新发现的一种24-32个碱基长度的非编码小RNA。pi RNA与生殖特异的piwi蛋白结合,在生殖系统的发育中起重要作用。雄性小鼠的生殖系统中,基因组中pi RNA簇和转座子区域转录出pi RNA前体,pi RNA前体出核... 详细信息

piwi相互作用RNA（pi RNA）是2006年新发现的一种24-32个碱基长度的非编码小RNA。pi RNA与生殖特异的piwi蛋白结合,在生殖系统的发育中起重要作用。雄性小鼠的生殖系统中,基因组中pi RNA簇和转座子区域转录出pi RNA前体,pi RNA前体出核后在初级生成途径和次级生成途径下生成成熟的pi RNA。成熟pi RNA首先能够沉默逆转座子转录出的RNA,降低转座子的活跃度,从而维持基因稳定,维持生殖细胞的正常发育。另外pi RNA还具有调节基因表达的功能,在转录水平和转录后水平上参与精子发生。

关键词： piwi相互作用RNA piwi蛋白初级生成途径次级生成途径雄性生殖系统小鼠

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piRNA通路与精子发生的研究进展

中华男科学杂志 2016年第10期22卷 923-927页

作者：毛军张贤生安徽医科大学第一附属医院泌尿外科安徽合肥230022

与piwi蛋白相互作用的RNA(piRNA)是一类动物生殖系细胞特异性表达的小分子非编码RNA。本文从piRNA分子、piwi蛋白及其他相关蛋白3个方面系统概括了piRNA通路。发现piRNA通路不仅通过抑制转座子机制,还可以通过调控翻译、生殖系干细胞的... 详细信息

与piwi蛋白相互作用的RNA(piRNA)是一类动物生殖系细胞特异性表达的小分子非编码RNA。本文从piRNA分子、piwi蛋白及其他相关蛋白3个方面系统概括了piRNA通路。发现piRNA通路不仅通过抑制转座子机制,还可以通过调控翻译、生殖系干细胞的维护、RNA的降解、基因防御等方面来影响精子发生。因此对piRNA通路在精子发生中的最新研究进展进行了综述。

关键词：精子发生 piRNA piwi蛋白 piRNA通路男性不育

非编码RNAs在人牙髓干细胞中的调控作用及机制

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中国组织工程研究 2020年第7期24卷 1130-1137页

作者：任春梅刘玉芳许诺邵苗苗何建亚李晓杰大连医科大学口腔医学院辽宁省大连市116044 大连医科大学中山学院辽宁省大连市116000

背景:人牙髓干细胞是一种重要的口腔间充质干细胞,具有很强增殖和多向分化能力。随着人类基因组计划的不断深入,人们逐渐意识到功能性非编码RNAs在调节基因表达方面有着至关重要的作用。目的:对非编码RNAs在人牙髓干细胞中的研究进展进... 详细信息

背景:人牙髓干细胞是一种重要的口腔间充质干细胞,具有很强增殖和多向分化能力。随着人类基因组计划的不断深入,人们逐渐意识到功能性非编码RNAs在调节基因表达方面有着至关重要的作用。目的:对非编码RNAs在人牙髓干细胞中的研究进展进行论述。方法:由第一作者以“ncRNAs,human dental pulp stem cell,regenerative medicine”为英文关键词,以“长链非编码RNAs,人牙髓干细胞,再生医学”为中文关键词,检索2005至2019年期间收录在PubMed、Medline、中国知网、万方等数据库中的文献,排除与文章研究目的无关及重复性的文献,纳入符合标准的71篇文献进行综述。结果与结论:目前普遍认为,非编码RNAs可以作为特定细胞状态的信号,为临床提供预后价值,甚至为患者提供治疗选择。随着再生医学应用的不断发展,人牙髓干细胞将越来越受到关注,研究非编码RNAs与人牙髓干细胞的关系,将为人牙髓干细胞的临床应用研究寻觅了一条新的途径。

关键词：非编码RNAs 人牙髓干细胞组织再生人类基因组计划转录 microRNAs lncRNAs piwi蛋白

piRNA的形成及其在雌性动物中生物学功能研究进展

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畜牧兽医学报 2017年第10期48卷 1785-1795页

作者：李春艳任春环刘秋月胡文萍王翔宇曹晓涵张子军狄冉储明星中国农业科学院北京畜牧兽医研究所农业部动物遗传育种与繁殖重点实验室北京100193 安徽农业大学动物科技学院合肥230036

piRNA是继siRNA和miRNA之后发现的一类新型非编码小RNA,其与piwi蛋白协同作用参与piRNA通路,保护动物生殖细胞的遗传信息免受分子寄生虫如转座子的有害影响。近年来,人们对piRNA发生过程的相关蛋白及生物学作用做了研究,发现多种piwi亚... 详细信息

piRNA是继siRNA和miRNA之后发现的一类新型非编码小RNA,其与piwi蛋白协同作用参与piRNA通路,保护动物生殖细胞的遗传信息免受分子寄生虫如转座子的有害影响。近年来,人们对piRNA发生过程的相关蛋白及生物学作用做了研究,发现多种piwi亚家族蛋白能与piRNA结合形成piwi-piRNA复合体,通过表观遗传调控参与生殖细胞形成与发育、生殖干细胞分化、性别决定等生物学功能。本文主要围绕piRNA的形成及特点、piwi-piRNA复合体发挥生物学作用的方式、piRNA在雌性动物中的生物学功能这3个方面对近期的研究进展进行综述,为深入探究piRNA调控雌性动物繁殖机制提供参考。

关键词： piRNA piwi蛋白表观遗传调控雌性动物

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piRNA在卵巢癌中的研究进展

中国肿瘤生物治疗杂志 2020年第4期27卷 452-456页

作者：严莹(综述) 阳志军(审阅) 广西医科大学附属肿瘤医院妇科区域高发肿瘤早期防治研究教育部重点实验室广西南宁530021

piwi蛋白相互作用RNA(piwi-interacting RNA,piRNA)及piwi蛋白通过表观遗传沉默影响肿瘤的发生发展,并与恶性肿瘤的增殖、侵袭、转移和预后不良密切相关,是潜在的新型肿瘤标志物和预后判断因子。卵巢癌是妇科三大恶性肿瘤之一,晚期易复... 详细信息

piwi蛋白相互作用RNA(piwi-interacting RNA,piRNA)及piwi蛋白通过表观遗传沉默影响肿瘤的发生发展,并与恶性肿瘤的增殖、侵袭、转移和预后不良密切相关,是潜在的新型肿瘤标志物和预后判断因子。卵巢癌是妇科三大恶性肿瘤之一,晚期易复发转移、产生耐药和病死率高,目前仍缺乏有效的早期肿瘤标志物和诊断方法。近年有研究表明,piRNA和piwi蛋白在卵巢癌中呈异常表达,通过转录后机制参与调控卵巢癌的发生发展。本文主要从piRNA的生物学特性、在肿瘤中表观遗传沉默的相关机制和piRNA在卵巢癌中的作用及其机制最新研究进展进行综述,为研究早期诊断卵巢癌的分子标志物提供参考依据。

关键词： piwi蛋白相互作用RNA(piRNA) piwi蛋白卵巢癌侵袭转移预后标志物

piwiL2蛋白在肝门部胆管癌组织和细胞株中的表达及临床意义

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中华肝胆外科杂志 2014年第4期20卷 280-283页

作者：温松奇熊小凡杨光耀杨康俞亚红丁志强游建陈勇军华中科技大学同济医学院附属普爱医院肝胆胰疝外科武汉430000

目的研究piwiL2在肝门部胆管癌组织和细胞株中的表达及其与临床病理特征和根治性切除术预后的关系。方法采用免疫组织化学方法检测41例肝门部胆管癌和10例正常胆管组织中piwiL2的表达；蛋白印迹和细胞免疫荧光技术检测人胆管癌细胞系QBC... 详细信息

目的研究piwiL2在肝门部胆管癌组织和细胞株中的表达及其与临床病理特征和根治性切除术预后的关系。方法采用免疫组织化学方法检测41例肝门部胆管癌和10例正常胆管组织中piwiL2的表达；蛋白印迹和细胞免疫荧光技术检测人胆管癌细胞系QBC939和人正常胆管上皮细胞HIBEpic株中piwiL2的表达。采用Kaplan—Meier法对胆管癌根治术后患者进行生存期的单因素及多因素分析。结果piwiL2在肝门部胆管癌和QBC939细胞中的表达明显高于对照组织和HIBEpie细胞（P〈0．05）；piwiL2在低、中分化胆管腺癌的表达明显高于高分化腺癌（P〈0．05）。单因素生存分析显示根治术后piwiL2高表达的生存期较短（P〈0．05）。多因素分析显示piwiL2的表达水平是影响胆管癌根治术预后的独立危险因素（P〈0．05）。结论piwiL2在肝门部胆管癌组织和细胞系中表达上调，其表达水平与肿瘤分期及分化程度相关，是影响肝门部胆管癌根治切除预后的独立危险因素。

关键词： piwi蛋白 piwiL2 肝门部胆管癌预后危险因素