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eEF1A2和pi3k-akt信号途径的相关基因在宫颈癌中表达的意义

eEF1A2和PI3K-Akt信号途径的相关基因在宫颈癌中表达的意义

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作者：潘欢石河子大学

学位级别：硕士

目的:探讨真核翻译延伸因子1A2(eukaryotic translation elongation factor 1 alpha 2,eEF1A2)与pi3k-akt信号转导途径相关基因在宫颈癌组织中m RNA和蛋白质的表达水平,阐明eEF1A2、pi3k、akt和HPV16 L1基因表达与宫颈癌发生与发展的关... 详细信息

目的:探讨真核翻译延伸因子1A2(eukaryotic translation elongation factor 1 alpha 2,eEF1A2)与pi3k-akt信号转导途径相关基因在宫颈癌组织中m RNA和蛋白质的表达水平,阐明eEF1A2、pi3k、akt和HPV16 L1基因表达与宫颈癌发生与发展的关系,为防治宫颈癌奠定基础。方法:1、收集宫颈癌患者72例,宫颈上皮瘤样病变患者46例和慢性宫颈炎患者40例石蜡组织标本用于免疫组织化学实验。2、收集新鲜宫颈癌组织和宫颈正常组织标本各10例,用于q RT-PCR实验,选择β-actin为内参基因,采用实时荧光定量PCR(q RT-PCR)方法检测eEF1A2、pi3k、akt基因的m RNA表达水平。采用免疫组织化学SP方法检测eEF1A2、pi3k、p-akt和HPV16 L1在宫颈癌组织、CIN组织和慢性宫颈炎组织中的蛋白质表达状况。3、培养He La、Si Ha两种宫颈癌细胞以及人脐静脉上皮细胞,用Western Blot方法检测eEF1A2、pi3k、p-akt蛋白在宫颈癌细胞以及正常上皮细胞中的表达差异。4、采用SPSS17.0统计学软件对数据进行统计学处理,以Ppi3k、akt基因在宫颈癌组织的m RNA表达水平均较正常宫颈组织明显升高。3、免疫组织化学结果显示eEF1A2、pi3k、p-akt蛋白质在宫颈癌组织中的表达量分别为46.6%、31.9%、62.2%,而慢性宫颈炎组织的表达量分别为21.2%、21.1%、16.7%。结果显示,宫颈癌组织中eEF1A2、pi3k、p-akt蛋白质的表达量明显高于慢性宫颈炎组织,差异均具有统计学意义(Ppi3k、p-akt蛋白质在宫颈癌细胞中表达量分别为9.90、15.65、73.72,明显高于正常上皮细胞。结论:HPV16 L1蛋白质在宫颈原位癌开始表达减少,宫颈浸润癌表达减少更明显,可能用于诊断CINII和CINIII或CINII和宫颈癌。eEF1A2基因的表达升高与pi3k-akt信号通路的相关基因表达升高一致,可以推测它们在宫颈癌的发生发展中起着一定的作用。

关键词：宫颈癌 eEF1A2基因 pi3k-akt信号途径 HPV16 L1蛋白质基因表达

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重组hS100A6的原核表达及其对人骨肉瘤细胞143B的生物学作用和机制探讨

重组hS100A6的原核表达及其对人骨肉瘤细胞143B的生物学作用和机...

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作者：邹正渝重庆医科大学

学位级别：硕士

研究背景与目的骨肉瘤是发病率约为骨恶性肿瘤的40%左右，仅次于软骨肉瘤，发病的机理尚不明了。骨肉瘤好发于青少年，恶性程度高，局部浸润、早期转移和复发的倾向高，预后极差。由于骨肉瘤早期转移率高，早期诊断及早期治疗成为治愈... 详细信息

研究背景与目的骨肉瘤是发病率约为骨恶性肿瘤的40%左右，仅次于软骨肉瘤，发病的机理尚不明了。骨肉瘤好发于青少年，恶性程度高，局部浸润、早期转移和复发的倾向高，预后极差。由于骨肉瘤早期转移率高，早期诊断及早期治疗成为治愈该瘤的关键。 S100家族是一类酸性的，分子量较小，能与钙结合的蛋白质，该家族目前报道发现至少有25个成员，该家族成员结构比较保守，都具有EF-手型结构，能与游离钙或者靶蛋白结合后产生多种生理学作用，如：参与细胞增殖与凋亡，调节酶活性或者经蛋白质的磷酸化等参与多种信号途径等。该家族中有21个成员的基因定位在稳定性较差、易发生染色体重排的人染色体1q21上，故大量的文献报道S100家族与多种高发性肿瘤，如骨肉瘤、卵巢癌、乳腺癌等关系密切。本课题拟研究重组hS100A6对人骨肉瘤细胞143B增殖、迁移、侵袭等方面的影响，并探讨重组hS100A6对该细胞中Wnt/β-catenin及pi3k-akt信号途径的影响，从而为骨肉瘤发生发展的分子机制的深入研究奠定基础。方法 1.质粒pGST-GST-HRV3C-hS100A6的构建与鉴定：以pHAHA-hS100A6为模板，高保真PCR扩增携带HRV3C酶切位点编码序列的hS100A6基因片段，插入至原核表达载体pGST-moluc，构建pGST-HRV3C-hS100A6;将该质粒经氯化钙法转入宿主大肠杆菌BL21，增菌后提取质粒作限制性内切酶的双酶切以鉴定构建的重组质粒，最后做测序鉴定。 2.重组hS100A6的制备与鉴定：扩增含重组质粒pGST-HRV3C-hS100A6的BL21，利用异丙基-β-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导其表达融合蛋白，然后冰浴超声裂菌，谷胱甘肽-琼脂糖4B球珠（Glutathione Sepharose4B beads）分离纯化出融合蛋白GST-HRV3C-hS100A6，经GST-HRV3C蛋白酶4℃酶切过夜，再用谷胱甘肽-琼脂糖4B球珠清除体系中的GST-HRV3C蛋白酶和被切下的GST标签。十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE）和Western-blot鉴定重组蛋白，应用分光光度仪对重组蛋白进行蛋白定量，0.22μm滤膜过滤除菌后分装，-80℃保存备用。 3.分别用不同浓度的重组hS100A6（1μg/ml、10μg/ml、30μg/ml、60μg/ml、90μg/ml）处理细胞，MTT法检测其对细胞增殖的影响;选择合适浓度作为后续实验的干预浓度，随后用MTT法、transwell小室（带或不带基质胶）和Hoechst33258染色检测重组hS100A6对143B细胞增殖、侵袭、迁移和凋亡的影响。 *** blot检测重组hS100A6对人骨肉瘤细胞143B的β-catenin水平、pi3k-akt信号途径标志蛋白p-akt（Ser473）及其下游蛋白GSk3β的磷酸化水平的影响;再运用信号途径抑制剂抑制该信号途径活性，再观察重组hS100A6对细胞增殖、迁移、侵袭及凋亡的影响。结果 1.构建的pGST-HRV3C-hS100A6质粒，经双酶切鉴定和测序分析证实是正确的;转化后的菌株经IPTG诱导能够表达相对分子质量约36kDa的蛋白质;经纯化、超滤置换缓冲液和GST-HRV3C酶切，再用琼脂糖4B球珠去除GST-HRV3C和GST标签;得到相对分子质量约10.5kDa的蛋白质（重组hS100A6），经Quantityone软件检测其纯度达93.2%;Western Blot显示S100A6单克隆抗体可以对该蛋白特异识别;该蛋白产量约为4mg/L菌液。 2.浓度依赖MTT显示：在浓度范围内（1μg/ml到90μg/ml）：30μg/ml的重组hS100A6能明显促进143B细胞的增殖，而90μg/ml的重组S100A6则抑制其增殖（P0.05）。本课题拟对其促骨肉瘤作用进行研究，故选用30μg/ml作为后续实验的干预浓度。 3. hS100A6对143B细胞的作用：1）MTT显示重组hS100A6处理143B细胞后从第二天起到第五天，实验组的A492nm值较对照组分别增加56.9%，41.4%，39.3%，72.4%（P0.05），提示hS100A6有促进143B细胞增殖的作用，且有一定程度的时间依赖性;2）Transwell（带基质胶）侵袭实验显示24h穿过小室膜的实验组细胞数较对照组增加145.1％(P0.05)，提示S100A6具有促进143B细胞侵袭能力的作用;3）Transwell（不带基质胶）迁移实验显示实验组24小时穿膜细胞较对照组增加270.3%（P0.05），提示hS100

关键词： S100A6 骨肉瘤肿瘤促进 Wnt/β-catenin信号途径 pi3k-akt信号途径

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