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Hey1上调GRB2激活pi3k/akt信号途径促进黑色素瘤细胞的迀移和侵袭

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Hey1上调GRB2激活PI3K/AKT信号途径促进黑色素瘤细胞的迀移和侵袭

作者：蒲以欢重庆医科大学

学位级别：硕士

目的:含有YRPW基序1的Hes相关家族b HLH转录因子（Hey1）被认为是Notch信号通路的靶基因,有越来越多的研究证据都在表明Notch信号通路在恶性黑色素瘤的多种细胞生物学过程起重要的调节作用。Hey1作为Notch信号的靶基因,并是广泛的转录因... 详细信息

目的:含有YRPW基序1的Hes相关家族b HLH转录因子（Hey1）被认为是Notch信号通路的靶基因,有越来越多的研究证据都在表明Notch信号通路在恶性黑色素瘤的多种细胞生物学过程起重要的调节作用。Hey1作为Notch信号的靶基因,并是广泛的转录因子,在多种肿瘤如乳腺癌、卵巢癌、骨肉瘤等的发生发展中都起着重要作用,但其在黑色素瘤细胞中的作用及其机制却被忽视。检测Hey1对黑素瘤细胞的生物学功能影响及探讨其可能的潜在作用机制是本研究的主要目的所在。方法:我们使用生物信息学工具、免疫组织化学和western blot分析方法来评估黑色素瘤中Hey1的表达情况;细胞体外和裸鼠体内实验用于确定Hey1对黑色素瘤恶性行为的影响;高通量测序方法用于检测干扰Hey1后的黑素瘤细胞差异表达基因,kEGG通路富集被用于分析差异基因参与的信号通路;免疫荧光法用于检测Hey1和GRB2在黑素瘤中的共表达情况;Western blot被用于检测干扰或过表达Hey1后,上皮-间叶转化过程（EMT）中的相关蛋白、基质金属蛋白酶（MMPs）以及GRB2/pi3k/akt信号途径中关键信号分子蛋白表达水平发生了怎样的改变。结果:Hey1在黑素瘤组织以及黑素瘤细胞系中的表达水平均明显上调。在细胞实验中,干扰Hey1显著抑制了黑素瘤细胞的体外迁移和侵袭过程,同时涉及上皮-间叶转化过程的E-cadherin表达量增高,N-cadherin、Vimentin、Snail表达量降低,另外基质金属蛋白酶MMP2、MMP7和MMP9表达量也同时降低,而Hey1过表达组结果呈现与Hey1干扰组相反的趋势。随后,在体外异种移植动物模型中,与对照组相比,Hey1干扰组的原位肿瘤体积明显减小,未查见肺转移瘤;而Hey1过表达组原位肿瘤体积明显增大,肺转移瘤数量多体积更大。最后,高通量测序鉴定出干扰Hey1的A375细胞中总共232个差异编码基因,kEGG富集结果提示GRB2/pi3k/akt有显著差异,我们通过Western blot进行了验证,在两组结果中,akt、pi3k蛋白水平变化不显著,但干扰组中GRB2、p-pi3k、p-akt（ser308）、P-P21蛋白水平显著降低,而过表达组中GRB2、p-pi3k、p-akt（ser308）、P-P21蛋白水平显著增高。结论:Hey1可以促进黑色素瘤的侵袭和转移过程,但其作用可能并不局限于我们当前的研究结果。此外,Hey1被认为是NOTCH信号的效应因子,但本研究表明Hey1可以通过上调GRB2激活pi3k/akt信号途径,使其中的关键信号分子的蛋白表达水平。由此,我们推测Hey1有可能在Notch信号途径与其他信号途径的相互串扰过程中起着重要的介导作用。

关键词：黑素瘤 Hey1 GRB2 pi3k/akt信号途径迁移和侵袭

TIPE通过激活pi3k/akt信号途径调节DcR3的表达并促进结直肠癌增殖和迁移

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TIPE通过激活PI3K/AKT信号途径调节DcR3的表达并促进结直肠癌增殖...

作者：钟梦雅厦门大学

学位级别：硕士

背景:结直肠癌(CRC)目前是全球第四大致命癌症,严重危害了人类的健康。虽然手术、化学治疗、放射治疗和分子靶向治疗在当前结直肠癌治疗中有一定的作用,但患者的治愈率和存活率仍然较低,因此,对于结直肠癌的基础研究迫在眉睫。肿瘤坏死... 详细信息

背景:结直肠癌(CRC)目前是全球第四大致命癌症,严重危害了人类的健康。虽然手术、化学治疗、放射治疗和分子靶向治疗在当前结直肠癌治疗中有一定的作用,但患者的治愈率和存活率仍然较低,因此,对于结直肠癌的基础研究迫在眉睫。肿瘤坏死因子诱导蛋白8(TIPE)在结直肠癌中高表达。我们前期的研究证实TIPE可以调节VEGFR2的表达促进CRC的血管生成及转移。诱骗受体3(DcR3)是一种可溶性分泌蛋白,通过拮抗FasL诱导的细胞凋亡促进肿瘤发生。我们前期研究证实DcR3在胃癌中高表达并与TIPE正相关。TIPE与DcR3的关系不清楚,为此,本研究我们将探讨TIPE是否可以调控DcR3的表达以及具体的分子机制。方法:利用生物信息学和组织芯片技术检测分析TIPE和DcR3在CRC中的表达模式及相关性。检测TIPE和DcR3在结肠癌细胞中的表达。通过ELISA检测收集到的CRC患者血浆中DcR3分泌。双荧光素酶报告基因分析TIPE和DcR3之间的相互作用。外源改变TIPE表达并分析其功能以及对DcR3分泌的影响。使用LPS刺激TIPE过表达的HCT116细胞并检测DcR3的分泌及信号通路,使用相应的抑制剂确定参与的调控分子。结果:我们发现TIPE和DcR3在结直肠癌患者中高表达,二者表达呈正相关。TIPE和DcR3的高表达与结直肠癌患者的预后不良相关。癌症患者的血浆中DcR3高表达。体外细胞实验证实HCT116细胞株的TIPE和DcR3高表达。双荧光素酶标记表明TIPE过表达能够增强DcR3启动子的转录活性。LPS刺激TIPE过表达的HCT116细胞证实pi3k/akt信号传导途径激活,进而调节DcR3表达来促进细胞增殖和迁移,抑制细胞凋亡。组织微阵列分析进一步表明TIPE和DcR3在结直肠癌标本中表达上调,TIPE的表达与结直肠癌转移和患者预后不良呈正相关。结论:TIPE和DcR3在结直肠癌中高表达,与患者预后不良相关。TIPE通过激活结直肠癌中的pi3k/akt信号传导途径调节DcR3的表达,从而促进细胞增殖和迁移,抑制细胞凋亡。这可能对结直肠癌的治疗或预后有着较好的临床意义和应用前景。

关键词： TIPE DcR3 结直肠癌 pi3k/akt信号途径

***诱导PTEN/pi3k/akt信号途径抑制胃粘膜上皮细胞生长的研究

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***诱导PTEN/PI3K/Akt信号途径抑制胃粘膜上皮细胞生长的研究

作者：洪军波南昌大学

学位级别：硕士

目的:有关幽门螺杆菌(Helicobacter Pylori,***)感染与PTEN/pi3k/akt信号途径在胃粘膜相关疾病发生发展中的关系目前尚未见报道。本研究拟用***培养上清液作用胃上皮细胞,观察***对胃上皮细胞PTEN/pi3k/akt信号途径的影响,探讨***是否... 详细信息

目的:有关幽门螺杆菌(Helicobacter Pylori,***)感染与PTEN/pi3k/akt信号途径在胃粘膜相关疾病发生发展中的关系目前尚未见报道。本研究拟用***培养上清液作用胃上皮细胞,观察***对胃上皮细胞PTEN/pi3k/akt信号途径的影响,探讨***是否通过该信号途径诱导胃粘膜上皮的细胞凋亡和细胞周期的变化,引起胃粘膜上皮的损伤,而导致胃部疾病的发生,从而为***相关疾病的防治提供新思路。方法:1.根据预实验四唑盐(MTT)比色法结果,我们分组如下:GES-1细胞随机分为:实验组(A、B、C组)给予***培养上清液作用,浓度分别为0.6、0.3、0.15mg/ml;阴性对照组(D组)和空白对照组(E组),分别给予***培养液和DMEM液处理。2. MTT比色法用于检测GES-1细胞存活率;流式细胞术检测细胞凋亡和细胞周期;RT-PCR检测PTEN mRNA;免疫细胞化学检测PTEN蛋白的表达;Western Blot检测磷酸化akt的表达。结果:1. ***培养上清液能以时间和浓度依赖的方式抑制GES-1细胞生长。24h后,A组GES-1细胞存活率显著低于B、C、D组(P0.05);48h和72小时后,A组和B组的GES-1细胞存活率显著低于C和D组(P0.05);同时,A组GES-1细胞存活率在24h,48h和72h间均具有显著差异(P0.05);48h后,A、B组GES-1细胞凋亡显著高于C、D组(P0.05);同时,A组GES-1细胞凋亡在48h显著高于24h(P0.05);同时,A组GES-1细胞G0-G1期比例在48h显著高于24h(P0.05);同时,A组GES-1细胞PTEN蛋白表达在48h显著高于24h(Pakt表达下降。24h后,A组磷酸化akt表达显著低于D组(Pakt表达显著低于C、D组(P0.05);同时,A组GES-1细胞磷酸化akt表达在48h显著低于24h(Pakt表达间存在负相关。***培养上清液作用GES-1细胞48h后,各组细胞周期G0-G1期GES-1细胞比例,细胞凋亡和存活率间存在负相关(r=-0.7790.874,Pakt表达间存在负相关(r=-0.931,Pakt的磷酸化。3. ***培养上清液可能通过影响PTEN/ pi3k /akt信号途径诱导细胞凋亡,抑制细胞增殖,这可能是其损伤胃黏膜,进而引起***相关疾病的机制之一。

关键词： H.pylori PTEN pi3k/akt信号途径 GES-1 生长抑制细胞凋亡

受体诱导一氧化碳经pi3 k/akt信号途径抑制冷缺血再灌注诱导的移植心细胞凋亡

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中华实验外科杂志 2010年第9期27卷 1218-1221页

作者：张松林孙宗全冯剑锷吴龙于利王国华华中科技大学同济医学院附属协和医院心血管外科武汉430022

目的观察受体诱导一氧化碳（CO）对移植心冷缺血再灌注（I/R）损伤中细胞凋亡的影响,并探讨其机制.方法以BALB/C小鼠建立同系移植心冷I/R损伤模型.受体麻醉前3 h以二氯甲烷（MC）500 mg/kg灌胃诱导CO（MC组,n=12）,或橄榄油灌胃（IR组... 详细信息

目的观察受体诱导一氧化碳（CO）对移植心冷缺血再灌注（I/R）损伤中细胞凋亡的影响,并探讨其机制.方法以BALB/C小鼠建立同系移植心冷I/R损伤模型.受体麻醉前3 h以二氯甲烷（MC）500 mg/kg灌胃诱导CO（MC组,n=12）,或橄榄油灌胃（IR组,n=12）;在MC组的基础上受体在移植心恢复血供前1 h腹腔注射pi3k抑制剂LY294002（40 mg/kg,LY组,n=10）或二甲亚砜（DMSO组,n=10）;检测移植后3、24 h移植心细胞凋亡指数（AI）、磷酸化akt（p-akt）蛋白、bcl-2与bax蛋白表达比值;设正常对照组（N组,n=5）.结果受体以MC灌胃后血液中碳氧血红蛋白（COHb）浓度与心肌组织CO含量均在3 h达到峰值,分别为（9.82±0.84）%和（2.25±0.08）pmol/mg;与IR组比较,MC组明显降低移植心AI[3 h：（8.65±2.01）%比（19.28±4.94）%,P＜0.01;24 h：（5.82±2.36）%比（10.54±3.66）%,P＜0.05]、激活akt蛋白（3 h：P＜0.01;24 h：P＜0.05）、上调bcl-2/bax比值（3 h：1.97±0.16比0.46±0.07,P＜0.01;24 h：1.89±0.10比0.51±0.04,P＜0.01）;与MC组比较,LY组明显增加AI[3 h：（17.95±4.92）%,P＜0.01;24 h：（9.75±3.14）%;P＜0.01]、抑制akt蛋白激活（P＜0.01）、下调bcl-2/bax比值（3 h：0.47±0.06,P＜0.01;24 h：0.52±0.03,P＜0.01）;DMSO组与MC组的各个指标差异无统计学意义（P＞0.05）.结论受体诱导C0能明显抑制冷I/R诱导的移植心细胞凋亡,其机制可能与通过pi3k/akt信号途径上调bcl-2/bax比值有关.

关键词：心脏移植一氧化碳 pi3k/akt信号途径缺血再灌注损伤

萝卜硫素及其衍生物BSFN通过激活pi3k/akt途径诱导SH-SY5Y细胞凋亡

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中国药学杂志 2014年第20期49卷 1813-1819页

作者：任杰蒋何菲赵娟许园元祁燕杰胡昆常州大学制药与生命科学学院江苏常州213164

目的研究萝卜硫素(SFN)及其衍生物(BSFN)对SH-SY5Y细胞的增殖抑制活性及通过pi3k/akt途径探讨其抗肿瘤作用机制。方法四甲基偶氮唑蓝比色法测定其对SH-SY5Y细胞增殖抑制率;通过免疫荧光法、流式细胞术、蛋白质印迹法对其进行抗癌机制研... 详细信息

目的研究萝卜硫素(SFN)及其衍生物(BSFN)对SH-SY5Y细胞的增殖抑制活性及通过pi3k/akt途径探讨其抗肿瘤作用机制。方法四甲基偶氮唑蓝比色法测定其对SH-SY5Y细胞增殖抑制率;通过免疫荧光法、流式细胞术、蛋白质印迹法对其进行抗癌机制研究。结果四甲基偶氮唑蓝结果显示,萝卜硫素和萝卜硫素衍生物处理细胞72 h的IC50值分别为13.27和5.21μmol·L-1,且呈现时间剂量依赖性;Hoechst33258染色荧光显微镜观察发现,萝卜硫素、萝卜硫素衍生物能诱导SHSY5Y细胞核形态学改变,部分细胞呈现典型的凋亡形态学特征;AnnexinⅤ-FITC/pi荧光双染结果亦证实萝卜硫素、萝卜硫素衍生物可以诱导SH-SY5Y细胞发生凋亡;DApi和DCFH-DA染色流式细胞术分析显示,萝卜硫素衍生物诱导SH-SY5Y细胞S期阻滞、细胞活性氧产生增加,且较萝卜硫素作用明显;蛋白质印迹分析发现萝卜硫素和萝卜硫素衍生物能调节pi3k/akt途径中凋亡相关蛋白的表达,同时检测细胞内Nrf2与keap-1蛋白表达,发现Nrf2蛋白表达增加,keap-1蛋白表达减少。结论萝卜硫素衍生物通过pi3k/akt信号途径诱导SH-SY5Y细胞凋亡和S期阻滞,且作用优于萝卜硫素,可能成为一种新型的抗癌药物。

关键词：萝卜硫素萝卜硫素衍生物 SH-SY5Y细胞细胞凋亡 pi3k/akt信号途径

辛伐他汀对高糖高脂诱导人骨髓间充质干细胞凋亡的影响

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中国组织工程研究与临床康复 2011年第23期15卷 4207-4210页

作者：赵婕李华青李晶薛国芳陈彦齐凯董敏王惠珍牛勃山西医科大学第二医院山西省太原市030001 山西省晋中市第二医院山西省晋中市030008 山西医科大学生化教研室山西省太原市030001 首都儿科研究所生物技术室北京市100020

背景:研究表明,他汀类药物能够促进骨髓间充质干细胞的增殖与黏附能力,抑制高糖高脂培养下骨髓间充质干细胞的凋亡。目的:观察辛伐他汀对高糖高脂诱导条件下人骨髓间充质干细胞凋亡的影响。方法:将0.001,0.01,0.1,1.0μmol/L辛伐他汀分... 详细信息

背景:研究表明,他汀类药物能够促进骨髓间充质干细胞的增殖与黏附能力,抑制高糖高脂培养下骨髓间充质干细胞的凋亡。目的:观察辛伐他汀对高糖高脂诱导条件下人骨髓间充质干细胞凋亡的影响。方法:将0.001,0.01,0.1,1.0μmol/L辛伐他汀分别与高糖高脂诱导条件下人骨髓间充质干细胞培养48h,以正常培养骨髓间充质干细胞及高糖高脂诱导条件下培养的骨髓间充质干细胞为对照。倒置显微镜下观察细胞形态,MTT法比较不同浓度辛伐他汀对高糖高脂环境下骨髓间充质干细胞存活率的影响,应用流式细胞术检测细胞凋亡,加入pi3k/akt信号转导通路抑制剂LY294002后辛伐他汀对骨髓间充质干细胞凋亡的影响。结果与结论:与高糖高脂诱导组比较,辛伐他汀0.01,0.1,1.0μmol/L组骨髓间充质干细胞存活率均升高(Ppi3k/akt信号途径有关。

关键词：辛伐他汀骨髓间充质干细胞凋亡 pi3k/akt信号途径

pi3k/akt通路在低氧环境下对结肠癌细胞HIF-1α及糖酵解的作用

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华中科技大学学报（医学版） 2018年第2期47卷 203-206页

作者：周晓黎舒磊廖艳石拓梅智谋杨家耀时昭红武汉市第一医院消化内科武汉430022

目的探讨缺氧环境培养下,阻断磷脂酰肌醇-3激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,pi3k)/丝氨酸苏氨酸激酶(serine-threoninekinase,akt)信号途径后结肠癌细胞中缺氧诱导因子(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)及糖酵解相关蛋白葡萄糖转运蛋白(glucose transporter 1,GLUT-l)和乳酸脱氢酶A(lactate dehydrogenase A,LDH-A)的表达,分析pi3k/akt信号通路与结肠癌细胞糖酵解之间的关系。方法选择人结肠癌SW480细胞予以缺氧环境培养,分为4组:缺氧对照组、pi3k抑制剂组、akt抑制剂组、pi3k+akt抑制剂组,培养时间为24h。采用RT-PCR和Western blot法检测各组结肠癌细胞HIF-1α及糖酵解相关基因(GLUT-1,LDH-A)的表达。比色法测定各组结肠癌细胞培养上清液中的乳酸浓度。结果与缺氧对照组相比较,pi3k抑制剂组和akt抑制剂组结肠癌细胞中HIF-1α、GLUT-1、LDH-A表达下降(均Ppi3k+akt抑制剂组与缺氧对照组及单项抑制剂组相比,各项指标下降明显(Ppi3k/akt信号途径,结肠癌细胞中HIF-1α表达下调,并可导致糖酵解相关基因GLUT-1、LDH-A的表达下降,提示pi3k/akt信号途径参与了结肠癌细胞的糖酵解过程。

关键词： pi3k/akt信号途径结肠癌糖酵解

PTEN与食管鳞状细胞癌血管生成的关系及机制

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PTEN与食管鳞状细胞癌血管生成的关系及机制

作者：杨琛擘郑州大学

学位级别：硕士

背景与目的食管鳞状细胞癌（esophageal squamous cell carcinoma,ESCC）是发病率和死亡率最高的上消化道肿瘤之一。2019年中国肿瘤登记年报显示,食管癌排在中国人口恶性肿瘤发病率第六位,因食管癌去世18.8万例,在中国人口恶性肿瘤致死... 详细信息

背景与目的食管鳞状细胞癌（esophageal squamous cell carcinoma,ESCC）是发病率和死亡率最高的上消化道肿瘤之一。2019年中国肿瘤登记年报显示,食管癌排在中国人口恶性肿瘤发病率第六位,因食管癌去世18.8万例,在中国人口恶性肿瘤致死率中排第四位。尽管目前针对ESCC已开发出多种治疗模式,但其预后仍然不理想,主要原因是ESCC具有较强的浸润转移能力,在肿瘤早期就能够形成微血管以促进癌细胞转移。因此探究ESCC的血管生成机制对于食管癌治疗模式的创新和改善患者预后具有重要意义。磷酸酶和张力蛋白同源物（phosphatase and tensin homolog,PTEN）是一个众所周知的抑癌基因,研究证实PTEN在恶性肿瘤中存在染色体区域异常、基因突变,是pi3k/akt信号通路中重要的负性调控因子,与肿瘤发生、发展、侵袭密切相关。巨噬细胞是肿瘤微环境中浸润数量最多、所占比例最大的的免疫效应细胞,肿瘤微环境中的巨噬细胞被称为肿瘤相关巨噬细胞（tumor associated macrophages,TAM）,TAM对肿瘤的发生发展具有重要作用。已有研究证实在胃癌、胰腺癌、肺癌中,PTEN能够诱导TAM的极化,促进肿瘤血管生成,激活免疫抑制,有利于肿瘤细胞迁移和侵袭。上述研究主要集中于腺癌,而我国食管癌90%以上为鳞癌,目前缺少ESCC中PTEN与TAM极化,以及与血管生成的关系研究。前期研究发现M2型巨噬细胞在ESCC组织中高密度浸润,与食管癌浸润深度、淋巴结转移和TNM分期相关,能够通过分泌VEGF-A和VEGF-C促进肿瘤血管和淋巴管生成。针对前期研究成果,本研究进一步探究PTEN诱导TAM极化,影响肿瘤血管生成的作用和机制。第一部分通过免疫组织化学染色法,探究PTEN表达与M1/M2型巨噬细胞的相关性,以及与血管生成的关系;第二部分在食管癌EC9706细胞系中过表达和沉默PTEN,收集上清液作为条件培养基培养M1型巨噬细胞,然后再收集巨噬细胞的培养基作为条件培养基培养食管癌相关血管内皮细胞（tumor endothelial cell,TEC）,验证不同条件培养基培养的TEC细胞增殖、迁移、侵袭、成管和分泌VEGF能力,探讨PTEN诱导TAM的极化对血管生成的影响,为进一步探讨ESCC浸润转移提供理论依据。方法1组织样本验证PTEN蛋白表达与TAM浸润数量的相关性,以及与血管生成的关系收集郑州大学第一附属医院病理科于2018年至2020年间49例经手术切除的ESCC组织和癌旁食管黏膜正常组织。所有患者术前均未经放化疗和免疫治疗。免疫组织化学法检测CD16、CD163、CD31、PTEN、pi3k和p-akt蛋白表达。2探究PTEN对M1型巨噬细胞极化的影响2.1调节EC9706细胞内PTEN的表达并鉴定利用PTEN过表达质粒（PTEN-p EX1）和靶向PTEN小干扰RNA（PTEN-si RNA）转染EC9706细胞,荧光显微镜观察转染情况,q RT-PCR和Western blot方法检测PTEN过表达或沉默效果,收集细胞上清液制备为巨噬细胞条件培养基。2.2 TAM的诱导与鉴定将THP-1细胞分化为M1型巨噬细胞,用收集的巨噬细胞条件培养基培养48 h。观察细胞形态,通过免疫细胞化学染色法对巨噬细胞表型进行鉴定。更换完全培养基培养48 h,收集细胞上清液制备为TEC条件培养基。2.3诱导M1型巨噬细胞向M2型极化的机制探讨收集条件培养基诱导后的巨噬细胞,提取RNA与蛋白质,q RT-PCR和Western blot方法检测巨噬细胞内pi3k和akt表达。2.4极化为M2型巨噬细胞影响肿瘤微环境中VEGF的含量测定用完全培养基培养诱导后的巨噬细胞48 h,收集细胞上清液,利用ELISA法检测上清液中的VEGF含量。3诱导TEC细胞及功能鉴定收集EC9706细胞上清液制备为VEC条件培养基,培养VEC细胞48 h后获得TEC。利用CCk-8、划痕实验、Transwell侵袭实验、q RT-PCR检测不同内皮细胞的增殖、迁移、侵袭能力和肿瘤相关内皮细胞标志物。用完全培养基培养诱导后的内皮细胞48 h,收集细胞上清液,利用ELISA法检测上清液中的VEGF含量。4调节PTEN表达后诱导M1型巨噬细胞极化对食管癌相关血管内皮细胞功能的影响TEC条件培养基培养TEC细胞48 h。转染PTEN-p EX1标记为p EX1组,转染PTEN-si RNA标记为si RNA组,单纯EC9706上清液标记为NC组。利用CCk-8、划痕实验、Transwell侵袭实验、成管实验检测各组TEC细胞的增殖、迁移、侵袭、成管能力。用完全培养基培养诱导后的TEC细胞48 h,收集细胞上清液,利用ELISA法检测上清液中

关键词：食管鳞状细胞癌肿瘤相关巨噬细胞 PTEN pi3k/akt信号途径血管生成

脱氢表雄酮对支气管上皮细胞上皮间质转化的作用及机制

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脱氢表雄酮对支气管上皮细胞上皮间质转化的作用及机制

作者：徐礼中南大学

学位级别：硕士

目的：采用转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1, TGF-β1)诱导人支气管上皮细胞株16HBE-14。构建上皮-间质转化(Epithelial-Mesenchymal Transition, EMT)模型,观察脱氢表雄酮(Dehydroepiandrosterone,DHEA)对TGF-β1诱导的EMT的作用,并探讨其具体机制。方法：1.将16HBE-14。用含有5%胎牛血清的MEM培养基培养,5ng/ml TGF-β1作用16HBE-14o72h,观察细胞的形态变化,采用Western Blot(WB)检测E一钙粘素(***)、α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)表达。2.给予不同浓度(1μM、10μM、100μM)DHEA预处理细胞24h,后加入TGF-β1干预72h,检测方法同1。3.设DHEA100(DHEA终浓度为100μM)+TGF-β1组和TGF-β1组,在不同时间点(0、0.5h、1h、2h)采用WB检测两组细胞p-akt及akt的变化过程。4.分别予雄激素受体(androgen receptor,AR)拮抗剂氟他胺、pi3k抑制剂LY294002(LY)或pi3k激动剂IGF-1预处理细胞,设八组,分别为(1)无处理组;(2)TGF-β1组;(3)DHEA100+TGF-β1组;(4)DHEA100+TGF-β1+氟他胺组;(5)TGF-β1+LY组;(6)TGF-β1+IGF-1组;(7)TGF-β1+DHEA100+LY组;(8)TGF-β1+DHEA100+IGF-1组,TGF-β1共同干预1h后立即收集细胞,WB检测各组细胞p-akt及akt的变化。各组细胞加入TGF-β1培养72h后立即收集细胞,WB检测各组细胞E-cadherin.α-SMA表达。结果：1. TGF-β1作用72h后,细胞鹅卵石外观变为梭形,细胞间连接疏松。E-cadherin表达下降;α-SMA表达增强。2.不同浓度DHEA对TGF-β1诱导EMT均有抑制作用,且呈浓度依赖性,100μMDHEA抑制作用最强。3. TGF-β1组、DHEA100+TGF-β1组均在TGF-β1处理后,p-akt蛋白表达增加,1h达到高峰。DHEA抑制p-akt蛋白表达,akt蛋白表达无明显差异(P>0.05)。4.氟他胺可减轻DHEA对p-akt蛋白表达及EMT过程的抑制作用。***可进一步降低p-akt蛋白表达及EMT过程;IGF-1促进p-akt蛋白表达及EMT发生。结论：1. TGF-β1能诱导16HBE-14o发生EMT。2. DHEA对TGF-β1诱导的EMT有抑制作用,且呈浓度依赖性。3. DHEA通过AR而发挥对TGF-β1诱导的EMT的抑制作用。4. DHEA对EMT的抑制作用与pi3k/akt信号途径有关。

关键词： 16HBE-14o 上皮-间质转变脱氢表雄酮转化生长因子-β1 pi3k/akt信号途径