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作者：李颖迪华北理工大学

学位级别：硕士

目的采用C57BL/6小鼠进行动物实验,在验证本课题组前期研究结果的基础上,探讨pi3k/akt/hif-1α糖酵解信号通路在不同因素所致肺纤维化发生发展过程中的作用及其机制,为探索肺纤维化的精准治疗方案奠定理论基础。方法使用浓度200 mg/m L... 详细信息

目的采用C57BL/6小鼠进行动物实验,在验证本课题组前期研究结果的基础上,探讨pi3k/akt/hif-1α糖酵解信号通路在不同因素所致肺纤维化发生发展过程中的作用及其机制,为探索肺纤维化的精准治疗方案奠定理论基础。方法使用浓度200 mg/m L二氧化硅(Si O2)悬浊液、剂量为4 mg/kg博来霉素(BLM)构建矽肺模型和特发性肺纤维化模型。使用pi3k抑制剂(LY294002)、hif-1α抑制剂2-甲氧雌二醇(2-ME2)进行干预。72只小鼠随机分配至各组,每组6只。Si O2实验组包括6组,分别是对照组、模型组、LY294002早期/晚期干预组、2-ME2早期/晚期干预组。BLM实验组分为6组,分别是对照组、模型组、LY294002早期/晚期干预组、2-ME2早期/晚期干预组,共12组。早期干预组造模第2天开始;BLM晚期抑制剂干预组从第22天开始,Si O2晚期抑制剂干预组从第29天开始。BLM实验组持续42天;Si O2实验组持续56天。HE和VG染色检测肺组织病理变化。免疫组化与Western blot检测肺组织中通路指标磷脂酰肌醇3-激酶(pi3k)、磷酸化蛋白激酶B(p-akt)及缺氧诱导因子1α(hif-1α)表达水平。Western blot法检测肺组织中糖酵解关键酶己糖激酶1(Hk1)、乳酸脱氢酶(LDHA)蛋白表达水平。试剂盒检测血清中糖酵解关键酶丙酮酸激酶(Pk)活性及代谢产物丙酮酸、乳酸(LD)含量。免疫组化检测肺组织中炎症因子白介素6(IL-6)、转化生长因子β(TGF-β)及肿瘤坏死因子α(TNF-α)含量。免疫组化检测肺组织中Ⅲ型胶原蛋白(CollagenⅢ),试剂盒检测羟脯氨酸(HYP)含量。结果***造模实验:各组实验小鼠一般情况、脏器系数及肺功能无明显差异。HE与VG染色结果显示,BLM模型组的肺组织结构严重破坏、大量炎症细胞浸润及胶原沉积。给予LY294002、2-ME2后肺组织结构破坏程度下降、炎症细胞浸润及胶原沉积减少。免疫组化、Western blot和试剂盒检测结果显示,与对照组相比,模型组信号通路相关因子pi3k、p-akt及hif-1α表达水平明显升高;糖酵解关键酶LDHA、Pk和糖酵解代谢产物LD、丙酮酸的含量明显升高;炎症因子TNF-α、TGF-β和IL-6含量明显上升。给予LY294002、2-ME2后,与模型组相比,pi3k、p-akt及hif-1α表达水平都存在不同程度降低;糖酵解关键酶LDHA、Pk和糖酵解代谢产物LD、丙酮酸的含量都存在不同程度降低;炎症因子TNF-α、TGF-β和IL-6含量都存在不同程度下降。早期抑制剂干预对糖酵解因子、炎症因子以及纤维化因子的影响效果比晚期抑制剂更明显。说明pi3k/akt/hif-1α糖酵解信号通路在博来霉素所致肺纤维化的发生发展过程中起到影响糖代谢方式、炎症情况及肺组织纤维化进程的作用。*** O2造模实验:各组实验小鼠一般情况、脏器系数及肺功能无明显差异。HE与VG染色结果显示,Si O2模型组的肺组织结构严重破坏并逐渐结节、大量炎症细胞浸润及胶原沉积。给予LY294002、2-ME2后肺组织结构破坏程度下降、炎症细胞浸润及胶原沉积减少。免疫组化、Western blot和试剂盒检测结果显示,与对照组相比,模型组信号通路相关因子pi3k、p-akt及hif-1α表达水平明显升高;糖酵解关键酶Hk1、LDHA、Pk和糖酵解代谢产物LD含量明显升高;炎症因子TNF-α、TGF-β和IL-6含量明显上升。给予LY294002、2-ME2后,与模型组相比,各组小鼠肺组织中pi3k、p-akt及hif-1α表达水平都存在不同程度降低;糖酵解关键酶Hk1、LDHA、Pk和糖酵解代谢产物LD的含量都存在不同程度降低;炎症因子TNF-α、TGF-β和IL-6含量都存在不同程度下降。早期抑制剂干预对糖酵解因子、炎症因子以及纤维化因子的影响效果比晚期抑制剂更明显。说明pi3k/akt/hif-1α糖酵解信号通路在二氧化硅所致肺纤维化的发生发展过程中起到影响糖代谢方式、炎症情况及肺组织纤维化进程的作用。3.上述特发性肺纤维化和矽肺两种模型的实验结果显示,抑制pi3k/akt/hif-1α信号通路,都能够改善糖酵解、炎症和肺纤维化的情况。不同的是抑制该信号通路后,对糖酵解、炎症和肺纤维化产生影响的因子和程度有所不同,这可能与BLM和Si O2所引起的肺纤维化机制有所不同。上述研究结果为研究BLM和Si O2致肺纤维化的发病机制提供了新的思路和科学依据。结论pi3k/akt/hif-1α糖酵解信号通路在肺纤维化过程中起到了调控枢纽作用,抑制该通路关键因子的表达可以减缓BLM和Si O2所诱导的小鼠肺纤维化进程。图30幅;表14个

关键词： pi3k/akt/hif-1α LY294002 2-ME2 肺纤维化糖酵解

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左卡尼汀通过影响pi3k/akt/hif-1α通路减轻模拟高原环境下大鼠睾丸损伤

左卡尼汀通过影响PI3K/Akt/HIF-1α通路减轻模拟高原环境下大鼠睾...

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作者：周昕甘肃中医药大学

学位级别：硕士

目的:通过低压低氧动物舱建立模拟高原环境下雄性大鼠生殖系统的损伤模型,观察低压低氧环境及左卡尼汀的干预对大鼠睾丸形态的影响,比较各组间大鼠睾丸组织中pi3k、akt、hif-1α蛋白及m RNA水平的表达差异,探讨左卡尼汀是否通过影响pi3k... 详细信息

目的:通过低压低氧动物舱建立模拟高原环境下雄性大鼠生殖系统的损伤模型,观察低压低氧环境及左卡尼汀的干预对大鼠睾丸形态的影响,比较各组间大鼠睾丸组织中pi3k、akt、hif-1α蛋白及m RNA水平的表达差异,探讨左卡尼汀是否通过影响pi3k/akt/hif-1α通路发挥预防及保护作用。方法:将60只SPF级生殖系统发育完善的Wistar大鼠分为4组:正常对照组、低压低氧组、低压低氧生理盐水组、低压低氧左卡尼汀组。除正常对照组外,余下3组均置于低压氧舱内,设置模拟海拔高度为6000m。左卡尼汀按照100mg/kg剂量腹腔注射给药,生理盐水按照同体积注射,每天1次,共14d。给药期满后处死大鼠,HE染色观察各组睾丸组织病理形态变化。采用免疫组化和蛋白印迹法测定各组大鼠睾丸组织中pi3k、akt、hif-1α蛋白表达水平。荧光定量PCR法检测大鼠睾丸组织中pi3k、akt、hif-1α的m RNA水平。结果:正常对照组大鼠的睾丸形态无明显异常,低压低氧组及低压低氧生理盐水组大鼠的睾丸形态损伤明显,生精小管管腔内细胞层数减少并可见空泡化。低压低氧左卡尼汀组大鼠睾丸组织中生精小管管腔内细胞层数相比低压低氧生理盐水组有明显的改善,空泡面积也明显减少。与正常对照组相比,低压低氧组、低压低氧生理盐水组、低压低氧左卡尼汀组大鼠睾丸组织中pi3k、akt、hif-1α蛋白的表达水平显著升高（P＜0.05或P＜0.01）,与低压低氧生理盐水组相比,低压低氧左卡尼汀组大鼠睾丸组织中pi3k、akt、hif-1α蛋白表达水平显著升高（P＜0.05或P＜0.01）。与正常对照组相比,低压低氧组、低压低氧生理盐水组、低压低氧左卡尼汀组大鼠睾丸组织中pi3k、akt、hif-1αm RNA水平显著升高（P＜0.01）,与低压低氧生理盐水组相比,低压低氧左卡尼汀组大鼠睾丸组织中pi3k、akt、hif-1α的m RNA水平显著升高（P＜0.01）。结论:1.左卡尼汀干预可明显改善低压低氧环境下大鼠睾丸组织的病理形态。2.左卡尼汀干预可上调低压低氧环境下大鼠睾丸组织中pi3k、akt、hif-1α蛋白及m RNA的表达水平。

关键词：左卡尼汀低压低氧睾丸 pi3k/akt/hif-1α

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红景天苷通过pi3k/akt/hif-1α途径减弱急性低压低氧诱导的心肌损伤的机制研究

红景天苷通过PI3K/Akt/HIF-1α途径减弱急性低压低氧诱导的心肌损...

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作者：杨立霞甘肃中医药大学

学位级别：硕士

目的:观察红景天苷对急性低压低氧诱导的大鼠的死亡数、体重指数、血气参数、心脏组织病理学变化,检测炎症因子TNF-α和IL-6的水平及检测大鼠心脏组织中p-pi3k(Tyr607),总的pi3k,p-akt(Thr308),总的akt以及hif-1α蛋白的表达,探讨红景... 详细信息

目的:观察红景天苷对急性低压低氧诱导的大鼠的死亡数、体重指数、血气参数、心脏组织病理学变化,检测炎症因子TNF-α和IL-6的水平及检测大鼠心脏组织中p-pi3k(Tyr607),总的pi3k,p-akt(Thr308),总的akt以及hif-1α蛋白的表达,探讨红景天苷对急性低压低氧诱导的大鼠的心肌损伤的作用及其潜在的分子机制。方法:60只成年雄性Wistar大鼠随机分为6组:正常对照组、红景天苷组、5000m低压低氧组、5000m红景天苷组、8000m低压低氧组,8000m红景天苷组。各红景天苷组分别给予40mg/(kg.d)的红景天苷灌胃,余各组给予等剂量的生理盐水灌胃,持续时间为3天,各大鼠预处理后按照预先设定好的目标海拔急性暴露于大型低压氧舱24h。模型建立后,计算和检测大鼠的死亡数、体重指数及血气参数。Hematoxylin-Eosin(HE)染色观察心脏组织的病理形态学变化;酶联免疫反应实验检测心脏组织炎症因子即肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)和白介素-6(Interleukin-6,IL-6)的水平;免疫组织化学检测缺氧诱导因子-1α(Hypoxia-inducible factor-1α,hif-1α)的表达。大鼠心脏组织中p-pi3k(Tyr607),总的pi3k,p-akt(Thr308),总的akt以及hif-1α蛋白的表达用Western blot(WB)的方法检测。结果:1.正常对照组、红景天苷组、5000m低压低氧组、5000m红景天苷组、8000m红景天苷组无死亡大鼠,8000m低压低氧组中死亡6只大鼠;各组大鼠的体重指数无明显统计学差异;血气分析参数结果中,pH和乳酸的水平在各组中无明显统计学差异(p>0.05);与5000m、8000m低压低氧组比较,红景天苷预处理组恢复了二氧化碳分压(carbon dioxide partial pressure,pCO2),氧分压(oxygen partial pressure,pO2)和氧饱和度(oxygen saturation,sO2)的水平(pkg.d)的红景天苷预处理明显降低了炎症因子TNF-α和IL-6的水平,差异均有统计学意义(P3.与正常组比较,5000m、8000m低压低氧组大鼠的心脏组织出现了明显的心肌细胞的水肿、变性、坏死及炎性细胞(特别是中性粒细胞)的浸润,红景天苷预处理部分恢复了大鼠心脏组织的病理形态学改变。4.与正常组比较,5000m、8000m低压低氧环境可诱导大鼠心脏组织中p-pi3k(Tyr607)、p-akt(Thr308)以及hif-1α蛋白的表达(P1),40mg/(kg.d)的红景天苷预处理显著增加了p-pi3k(Tyr607)、p-akt(Thr308)以及hif-1α蛋白的表达(P1)。结论:1.红景天苷预处理可改善低压低氧诱导的大鼠的心脏组织的病理形态学改变,减轻大鼠的炎症反应。2.红景天苷预处理可恢复大鼠腹主动脉中pCO2、pO2和sO2的水平。3.红景天苷预处理可上调大鼠心脏组织中p-pi3k(Tyr607)、p-akt(Thr308)以及hif-1α蛋白的表达。

关键词：红景天苷炎症低压低氧 pi3k/akt/hif-1α

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右美托咪定通过pi3k/akt/hif-1α信号通路减轻梗阻性黄疸大鼠肺损伤

右美托咪定通过PI3K/Akt/HIF-1α信号通路减轻梗阻性黄疸大鼠肺损...

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作者：史鸾媛内蒙古医科大学

学位级别：硕士

目的:评价磷脂酰肌醇3-激酶-丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶-缺氧诱导因子-1α(phosphatidylinositol 3-kinase-protein-ser-ine-threonine kinases-hypoxia inducible factor-1α,pi3k/akt/hif-1α)信号通路在右美托咪定减轻梗阻性黄疸大鼠肺损伤中的作用。方法:清洁级健康雄性Wistar大鼠共40只,体质量22070g,7周龄,采用随机数字表法分为4组(n=10):假手术组(Sham组)、梗阻性黄疸组(OJ组)、OJ+右美托咪定组(D组)、OJ+右美托咪定+LY294002组(DL组)。Sham组仅游离胆总管,其余组均行双重结扎并离断胆总管的方法制备梗阻性黄疸大鼠模型。Sham组和OJ组于术后72h采集颈动脉血样2ml并取左侧肺上叶组织3份。D组于造模72h后经腹缓慢注射右美托咪定100ug·kg,DL组于造模72h后经尾静脉缓慢泵入LY294002 0.3mg·kg后腹腔缓慢注射右美100ug·kg。D组和DL组待腹腔注射右美3h后采集颈动脉血样2ml及左肺上叶组织3份。留取肺组织样本1.5cm×1.5cm×0.3cm,行HE染色观察肺组织病理学变化;Western-blot法检测磷酸化akt(p-akt)及hif-1α蛋白表达水平;RT-PCR法检测肺组织akt mRNA及hif-1αmRNA的表达。通过ELISA法测量血清肿瘤坏死因子(TNF-α)和白介素-6(IL-6)。结果:D组肺组织病理学损伤较OJ组和DL组减轻;与S组比较,OJ组hif-1α、p-akt、akt mRNA、hif-1αmRNA表达上调;与OJ组比较,D组hif-1α、p-akt、akt mRNA、hif-1αmRNA表达上调,DL组hif-1α、p-akt、akt mRNA、hif-1αmRNA表达无明显差异;与D组比较,DL组hif-1α、p-akt、akt mRNA、hif-1αmRNA表达下降。关于血清中炎症因子表达,与S组比较,OJ组、D组IL-6、TNF-α表达上调;与OJ组比较,D组和DL组IL-6、TNF-α表达下降;与D组比较,DL组IL-6、TNF-α表达上调。结论:右美托咪定部分通过pi3k/akt/hif-1α信号通路减轻梗阻性黄疸大鼠肺损伤;右美托咪定可减少梗阻性黄疸大鼠炎症因子IL-6和TNF-α的表达。

关键词： pi3k/akt/hif-1α 梗阻性黄疸右美托咪定肺

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缺氧通过pi3k/akt/hif-1α轴上调GPX4增强胶质母细胞瘤对铁死亡抵抗的机制研究

缺氧通过PI3K/AKT/HIF-1α轴上调GPX4增强胶质母细胞瘤对铁死亡抵...

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作者：郭常法山东大学

学位级别：硕士

研究背景:胶质瘤(glioma)是大脑中最常见的原发性肿瘤,占中枢神经系统(central nervous system,CNS)恶性肿瘤的81%。它们通常起源于胶质细胞或前体细胞,并发展为星形细胞瘤、少突胶质细胞瘤、室管膜瘤和少突星形细胞瘤。胶质母细胞瘤(gl... 详细信息

研究背景:胶质瘤(glioma)是大脑中最常见的原发性肿瘤,占中枢神经系统(central nervous system,CNS)恶性肿瘤的81%。它们通常起源于胶质细胞或前体细胞,并发展为星形细胞瘤、少突胶质细胞瘤、室管膜瘤和少突星形细胞瘤。胶质母细胞瘤(glioblastoma,GBM)作为原发性脑肿瘤中最致命的一种肿瘤,在胶质瘤中占50%,具有侵袭性强,复发率高,治疗抵抗并且临床预后差的特点。尽管在胶质母细胞瘤生物学研究方面取得了进展以及在其外科手术、化疗和放疗等治疗方法取得了进步,但其预后不良,5年生存率只有4.3%。铁死亡(ferroptosis)是一种非凋亡氧化性细胞死亡,近年来被认为是一种潜在的抗癌机制。Erastin作为一种铁死亡激活剂,在肿瘤治疗方面具有潜在作用。肿瘤微环境通常表现出缺氧的特点,缺氧对肿瘤的放疗和化疗抵抗均有重要影响,但缺氧与Erastin抵抗之间的关系在胶质母细胞瘤中尚未研究。研究目的:本研究旨在探讨缺氧和Erastin抵抗之间的关系,并通过体内、体外实验阐述其潜在的分子机制,同时为胶质母细胞瘤的治疗提供一种新的思路。研究方法:在生物信息学数据库癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas,TCGA)中检测缺氧诱导因子 1α(Hypoxia inducible factor 1α,hif-1α)和谷胱甘肽过氧化物酶4(Glutathione peroxidase,GPX4)表达的相关性,并通过ChIP-qPCR实验验证数据库的结果。通过丙二醛(malondialdehyde,MDA)测定实验和C11-BODIPY荧光探针检测细胞脂质过氧化物水平。通过 Western Blot 检测磷脂酰肌醇 3-激酶(Phosphatidylinositol 3-kinase,pi3k)、蛋白激酶B(Protein kinase B,akt)、hif-1α和GPX4的蛋白表达水平。通过细胞计数试剂盒-8(Cell Counting kit,CCk-8)实验、克隆形成实验、TUNEL(TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling)染色和流式细胞凋亡实验测定hif-1α抑制剂PX-478和Erastin联合应用对胶质母细胞瘤细胞的治疗效果。构建皮下异种移植瘤和原位异种移植瘤小鼠模型,验证PX-478和Erastin联合应用在体内对胶质母细胞瘤的治疗效果。研究结果:1.缺氧16小时显著增加U87和U251细胞对Erastin诱导铁死亡的抵抗。为后续实验确定了细胞在缺氧条件下培养的时间。***4作为缺氧的潜在效应分子,缺氧通过上调GPX4增强U87和U251细胞对Erastin的抵抗。缺氧通过激活pi3k/akt/hif-1α通路增加GPX4的表达,添加akt抑制剂Mk-2206或hif-1α抑制剂PX-478等药物,显著逆转缺氧条件下GPX4表达的增加。***-1α的表达与GPX4的表达呈正相关,并且hif-1α在-131位点至1位点与GPX4启动子区域直接结合并促进GPX4转录。***-1α抑制剂PX-478诱导U87和U251细胞脂质过氧化,但不能直接诱导细胞死亡。然而,PX-478与Erastin联合使用可显著增强Erastin对U87和U251细胞的杀伤作用。体内实验,PX-478和Erastin联合应用对皮下异种移植瘤和原位异种移植瘤小鼠模型的抗肿瘤活性具有协同强化作用。研究结论:缺氧可通过激活pi3k/akt/hif-1α通路并通过转录调控的方式促进GPX4的表达,增强胶质母细胞瘤细胞对Erastin诱导铁死亡的抵抗能力。在体内、外实验中,hif-1α抑制剂PX-478和Erastin联合应用对胶质母细胞瘤细胞杀伤具有协同作用,为胶质母细胞瘤临床治疗提供一种新思路。

关键词：胶质母细胞瘤铁死亡缺氧 GPX4 pi3k/akt/hif-1α

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黑骨藤追风活络胶囊对类风湿关节炎大鼠pi3k/akt/hif-1α轴的影响

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中国现代药物应用 2021年第8期15卷 250-252页

作者：陈日裕南方医科大学南海医院重症医学科 528244

目的探讨黑骨藤追风活络胶囊对类风湿关节炎大鼠pi3k/akt/hif-1α轴的影响。方法本次试验选取雄性SD大鼠若干只,并随机分为空白组和造模组,其中造模成功的SD大鼠为造模组,将该组实验对象分为模型组、黑骨藤追风活络胶囊组以及黑骨藤追... 详细信息

目的探讨黑骨藤追风活络胶囊对类风湿关节炎大鼠pi3k/akt/hif-1α轴的影响。方法本次试验选取雄性SD大鼠若干只,并随机分为空白组和造模组,其中造模成功的SD大鼠为造模组,将该组实验对象分为模型组、黑骨藤追风活络胶囊组以及黑骨藤追风活络胶囊联合pi3k抑制剂给药组,每组SD大鼠有8只。空白组大鼠按照其身体重量每日灌胃生理盐水,模型组、胶囊组、联合给药组每日灌胃给药羧甲基纤维素钠配制的混悬液,持续5周。对比对类风湿关节炎大鼠pi3k/akt/hif-1α轴的影响。结果治疗后1、2、3、4、5周,黑骨藤追风活络胶囊组、黑骨藤追风活络胶囊联合pi3k抑制剂给药组的足踢趾肿胀程度均低于本组治疗前,且均低于模型组,差异均具有统计学意义(P3、Cytochrome-C蛋白表达分别为(0.365±0.108)、(0.226±0.085)、(0.157±0.035)显著高于空白组的(0.049±0.032)、(0.029±0.033)、(0.079±0.054),差异具有统计学意义(Ppi3k抑制剂给药组大鼠的脾脏Caspase-1、Caspase-3、Cytochrome-C蛋白表达低于模型组,差异具有统计学意义(Ppi3k、p-akt、hif-1α、Bax、Bcl-2蛋白表达显著高于空白组,差异具有统计学意义(Ppi3k抑制剂给药组大鼠的滑膜组织p-pi3k、p-akt、hif-1α、Bcl-2蛋白表达明显低于模型组,而Bax蛋白表达明显高于模型组,差异具有统计学意义(Ppi3k/akt/hif-1α信号通路的表达,引发多种细胞和蛋白调节。

关键词：黑骨藤追风活络胶囊类风湿关节炎大鼠 pi3k/akt/hif-1α 影响

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活性维生素D对糖尿病溃疡创面愈合的影响及机制研究

活性维生素D对糖尿病溃疡创面愈合的影响及机制研究

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作者：马一鸣苏州大学

学位级别：硕士

背景:糖尿病足溃疡是糖尿病的一种严重并发症,是引起糖尿病患者非外伤性截肢和致死的主要原因,目前临床常规治疗方法效果有限。维生素D是一种人体必需营养素,近年来其在调节钙磷代谢之外的非经典作用受到广泛关注。据报道,维生素D对免... 详细信息

背景:糖尿病足溃疡是糖尿病的一种严重并发症,是引起糖尿病患者非外伤性截肢和致死的主要原因,目前临床常规治疗方法效果有限。维生素D是一种人体必需营养素,近年来其在调节钙磷代谢之外的非经典作用受到广泛关注。据报道,维生素D对免疫紊乱、炎症以及感染等多种糖尿病足溃疡难愈因素具有调节作用。因此,探讨维生素D对糖尿病溃疡创面愈合的影响及可能机制具有重要的科学意义,可为糖尿病足溃疡防治工作提供理论依据。目的:本研究拟开展动物实验和细胞实验,探讨活性维生素D补充对糖尿病溃疡创面愈合的影响,以及血管新生在其中可能发挥的作用,为维生素D防治糖尿病足溃疡提供基础资料。方法:本研究分为以下三个部分:(1)活性维生素D干预对糖尿病溃疡模型小鼠创面愈合的改善作用3-5周龄雄性C57BL/6J小鼠随机分为对照组(CON组)和糖尿病造模组。采用高脂饲料喂养8周联合链脲佐菌素(Streptozotocin,STZ)腹腔注射的方法构建糖尿病小鼠模型。第9周模型构建成功后,将糖尿病造模组小鼠分为糖尿病溃疡对照组(DM组)、低剂量活性维生素D干预组[LVD组,1,25(OH)2D3剂量:500 ng/kg]和高剂量活性维生素D干预组[HVD组,1,25(OH)2D3剂量:1000 ng/kg]。第13周构建糖尿病溃疡创面模型,从创面模型构建当天开始,LVD组和HVD组小鼠每日腹腔注射相应剂量活性维生素D,于创面愈合第4、7、14天分批处死小鼠,收取皮肤创缘组织,检测指标如下:1)定期监测小鼠随机血糖(Random blood glucose,RBG)、空腹血糖(Fasting blood glucose,FBG)、体重和24小时饮水量。2)每日观察创面愈合状态,计算创面愈合率,评估宏观创面愈合情况。3)利用H&E染色和Masson染色观察组织学变化和胶原纤维沉积情况,评估微观创面愈合情况。4)通过Western blot和RT-qPCR实验检测创缘组织维生素D受体(Vitamin D receptor,VDR)和晚期糖基化终末产物受体(Receptor for advanced glycation end products,RAGE)的表达水平。(2)活性维生素D干预对糖尿病溃疡模型小鼠创面愈合不同阶段的影响为进一步研究活性维生素D干预对糖尿病溃疡模型小鼠创面愈合过程中炎症、血管内皮功能、血管新生和血管成熟的作用,本研究对创面愈合不同天数收取的样本进行如下指标检测:1)炎症:针对创面愈合第4天的样本,首先通过H&E染色观察创面中心炎细胞浸润状态;随后采用免疫组化法观察创缘组织CD68和CD206表达情况;最后使用RT-qPCR实验检测创缘组织M1型和M2型巨噬细胞相关细胞因子表达水平,其中M1型巨噬细胞相关细胞因子包括诱导型一氧化氮合酶(Induciblenitric oxide synthase,iNOS)、白介素 1β(Interleukin 1β,IL-1β)和肿瘤坏死因子-α(Tumornecrosis factor-α,TNF-α),M2 型则包括精氨酸酶 1(Arginase 1,Arg1)和白介素 10(Interleukin 10,IL-10)。2)血管内皮功能:采用免疫组化、Western blot或RT-qPCR实验检测第7天创缘组织中内皮型一氧化氮合酶(Endothelial nitric oxide synthase,eNOS)、内皮素-1(Endothelin-1,ET-1)和血管细胞粘附分子-1(Vascular cell adhesion molecule-1,VCAM-1)的表达水平。3)血管新生:首先通过免疫组化法检测第7天创缘组织血管新生标志物CD31表达情况;随后采用Western blot或RT-qPCR实验检测第7、14天创缘组织血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)、血管内皮生长因子受体2(Vascular endothelial growth factor receptor 2,VEGFR2)、血小板衍生生长因子(Platelet derived growth factor,PDGF)、血小板衍生生长因子受体 β(Platelet derived growth factorreceptorβ,PDGFRβ)、碱性成纤维细胞生长因子(Basic fibroblast growth factor,bFGF)、表皮生长因子受体(Epidermal growth factor receptor,EGFR)和缺氧诱导因子 1 α(Hypoxia-inducible factor 1 α,hif-1 α)的表达水平。4)血管成熟:利用免疫组化法观察第14天创缘组织血管成熟

关键词：维生素D 糖尿病足溃疡创面愈合血管新生 pi3k/akt/hif-1α

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乳腺癌MCF-7耐放射细胞亚株的建立及其抗拒机制的研究

乳腺癌MCF-7耐放射细胞亚株的建立及其抗拒机制的研究

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作者：向晶南华大学

学位级别：硕士

目的：乳腺癌放射治疗的个体差异性较大，常出现放疗抵抗的情况。研究乳腺癌放疗抵抗现象发生的分子生物学机制对于逆转肿瘤细胞的耐放射性、提高放疗效果具有非常重要的意义。本实验探索诱导并建立人乳腺癌耐放射细胞亚株的体外实验... 详细信息

目的：乳腺癌放射治疗的个体差异性较大，常出现放疗抵抗的情况。研究乳腺癌放疗抵抗现象发生的分子生物学机制对于逆转肿瘤细胞的耐放射性、提高放疗效果具有非常重要的意义。本实验探索诱导并建立人乳腺癌耐放射细胞亚株的体外实验方法及其放射抗拒性的初步机制。方法: 以人乳腺癌MCF-7细胞株为实验对象，通过体外细胞培养，应用X-射线对人乳腺癌细胞株MCF-7进行梯度递增的诱导照射，得到MCF-7耐放射细胞亚株：MCF-7R。随后观察其细胞形态学、细胞周期与凋亡及放射敏感性的变化，并与乳腺癌亲本株MCF-7比较。扫描电镜和透射电镜对比观察亲本株与耐放射细胞亚株细胞内部的超微结构;流式细胞仪(flow cytometry, FCM)FCM检测其细胞周期与凋亡;集落形成实验检测其放射敏感性，并计算存活分数，单击多靶模型拟合细胞存活曲线。以6GyX-射线分别照射亲本株MCF-7与耐放射细胞亚株MCF-7R，Western blot法分别检测MCF-7，MCF-7R，MCF-7+6Gy，MCF-7R+6Gy4组的pakt、hif-1α蛋白表达，探讨乳腺癌产生放射抗拒性的初步机制。结果：与乳腺癌亲本株MCF-7相比，耐放射细胞亚株MCF-7R细胞形态学、细胞周期分布与凋亡率及放射敏感性均出现明显改变。 1.电镜学显示耐放射细胞亚株MCF-7R外形及细胞器均出现明显改变。 2.细胞周期分布结果显示：G0/G1期百分比由52.81±0.14升高至57.65±1.09(p33.39±0.12降低至32.92±0.04(p3.32±0.2降到9.43±0.11，统计学上有显著差异(p3±0.22升到7.35±0.41(p3.准域剂量Dq值由2.261升高至3.695(p34(p34%，统计学上有显著差异(pakt、hif-1α蛋白的表达高于亲本株MCF-7，差异有统计意义(pakt、hif-1α蛋白表达明显增高（Pakt、hif-1α蛋白表达差别无显著性（P>0.05）。结论： 1.小剂量梯度增加照射诱导法能较好地建立MCF-7R乳腺癌耐放射细胞亚株。 2.乳腺癌耐放射机制与pi3k/akt通路相关联，并可能通过pi3k/akt的下游因子hif-1α介导。

关键词：乳腺肿瘤细胞株放射抗拒 pi3k/akt/hif-1α

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复方阿胶浆低聚糖组分对胃癌前病变的改善作用及机制研究

复方阿胶浆低聚糖组分对胃癌前病变的改善作用及机制研究

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作者：闫巧兰州大学

学位级别：硕士

复方阿胶浆具有“补气养血”之功效,在辅助抗癌、改善贫血和升高白细胞等方面疗效显著,其组方药材党参、红参和熟地黄中均含有含量较高的低聚糖成分,已被证明具有调节免疫、抗肿瘤、抗氧化及抗炎等活性。因此,我们提出低聚糖可能是复方... 详细信息

复方阿胶浆具有“补气养血”之功效,在辅助抗癌、改善贫血和升高白细胞等方面疗效显著,其组方药材党参、红参和熟地黄中均含有含量较高的低聚糖成分,已被证明具有调节免疫、抗肿瘤、抗氧化及抗炎等活性。因此,我们提出低聚糖可能是复方阿胶浆的重要活性成分。为了证实这一假说,我们必须选择一个合适的疾病模型。胃癌前病变(precancerous lesions of gastric cancer,PLGC)的发展过程中伴随着过度炎症反应、氧化应激损伤以及肿瘤细胞的异常增殖等诸多病变,需要消耗大量能量,导致组织供氧不足,形成缺氧微环境。缺氧会抑制正常细胞分裂甚至导致细胞死亡,加剧胃黏膜损伤;而肿瘤细胞的缺氧会促进其大量增殖、侵袭和转移,产生缺氧耐受。PLGC的过程主要是一个脾虚气滞→脾胃亏虚→气虚血瘀→气血亏虚的演进过程,正好对症复方阿胶浆“补气养血”的功效。因此,本论文首先根据胃炎癌转化的生存环境,分析了复方阿胶浆低聚糖(FEJO)对缺氧条件下胃黏膜上皮细胞(GES-1)和胃癌细胞(AGS)的影响,在细胞水平上证实了FEJO对胃黏膜保护作用和对胃癌细胞的凋亡及相关机制的影响。其次,采用灌胃N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍(N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine,MNNG)和40%乙醇并结合饥饱饮食的方法诱导PLGC动物模型,从整体动物、组织、细胞、分子层面研究了FEJO对PLGC的改善作用及机制。最后,在确证低聚糖为复方阿胶浆重要活性成分的基础上,为了阐明复方阿胶浆中哪味药材或者哪个药对的低聚糖发挥最为重要的作用,将复方阿胶浆拆方为党参红参熟地组、红参熟地组及党参组,研究各组方药物配伍组合物低聚糖对PLGC的改善作用及机制,并分析各自对该作用的贡献。具体研究内容如下:(1)复方阿胶浆低聚糖对PLGC的改善作用及机制研究细胞实验:缺氧环境会影响GES-1和AGS细胞的增殖,构建缺氧环境下的胃黏膜损伤模型,有助于我们探讨药物对胃黏膜或者PLGC的保护作用及机制。在缺氧条件下培养GES-1和AGS细胞并采用FEJO干预48 h后发现,FEJO能提高缺氧条件下GES-1细胞存活率,增加GES-1细胞Bcl-2/Bax比值并降低caspase-3蛋白水平,促进pi3k和p-akt而抑制hif-1α蛋白表达。同时发现FEJO能降低缺氧条件下AGS细胞存活率,降低AGS细胞Bcl-2/Bax比值并增加caspase-3蛋白水平,抑制pi3k、p-akt及hif-1α蛋白表达。表明FEJO可抑制缺氧诱导的GES-1细胞损伤并促进胃癌细胞凋亡,其作用机制可能与调节pi3k/akt/hif-1α信号通路的异常激活有关。动物实验:PLGC模型与中医理论体系的气血双虚存在着显著的关联关系。为了证实低聚糖是复方阿胶浆的重要活性成分,我们采用灌胃MNNG和40%乙醇并结合饥饱饮食的方法构建了PLGC模型,70只大鼠随机分为6组,即正常组、正常动物给予FEJO高剂量组、模型组、阳性对照组、FEJO低剂量和高剂量治疗组。研究发现FEJO低、高剂量均能显著逆转PLGC大鼠的体重降低,减轻胃黏膜萎缩、肠上皮化生和不典型增生程度,并增加红细胞计数和血红蛋白含量,降低血小板计数和血小板/淋巴细胞比值。FEJO能够升高血清PGⅠ/PGⅡ比值和G-17水平;降低IL-1β、IL-6及TNF-α水平;增强SOD和GSH-Px活性并降低MDA含量;降低胃黏膜组织Bcl-2/Bax比值和增加caspase-3蛋白水平,并抑制pi3k、p-akt及hif-1α蛋白表达。通过LC-MS/MS代谢组学技术检测大鼠血清代谢谱发现,FEJO可下调PLGC大鼠血清甘油磷酸胆碱、2-酮戊二酸、乳酸、富马酸及牛磺鹅去氧胆酸5个代谢物水平,上调组氨酸、甜菜碱、瓜氨酸、精氨酸、脯氨酸、泛酸、牛磺胆酸、柠檬酸及1-棕榈酰甘油磷酸胆碱9个代谢物水平,涉及三羧酸循环、精氨酸和脯氨酸代谢、甘油磷脂代谢、糖酵解及牛磺酸和亚牛磺酸代谢5条关键代谢通路。表明FEJO可能通过抑制炎症、抗氧化、促进细胞凋亡以及调节机体代谢紊乱改善PLGC,其作用机制与抑制pi3k/akt/hif-1α信号通路的过度激活有关。(2)复方阿胶浆组方药物配伍组合物低聚糖对PLGC的改善作用及机制研究为了证实复方阿胶浆配伍相关的各组分低聚糖成分对治疗作用的贡献,我们进一步将复方阿胶浆全方拆分为党参红参熟地、红参熟地、党参,探讨了复方阿胶浆组方药物配伍组合物低聚糖对PLGC大鼠的改善作用及机制。细胞实验:实验方法同实验(1),研究发现党参红参熟地低聚糖(DHSO)、红参熟地低聚糖(HSO)和党参低聚糖(DO)均能提高缺氧条件下GES-1细胞存活率,增加GES-1细胞Bcl-2/Bax比值并降低caspase-3蛋白水平,

关键词：复方阿胶浆低聚糖胃癌前病变 pi3k/akt/hif-1α 代谢组学

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