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pi3-k/akt shRNA对大鼠Thy-1肾炎增生病变的影响

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PI3-k/Akt shRNA对大鼠Thy-1肾炎增生病变的影响

作者：张艳南京医科大学

学位级别：硕士

第一部分pi3-k/akt shRNA真核表达质粒的构建及鉴定目的:构建并鉴定针对pi3-k/akt基因的特异性短发卡RNA(shRNA)真核表达载体,探讨沉默大鼠肾组织内pi3-k/akt基因对Thy-1肾炎(Thy-1 N)增生病变的影响。方法:用DNA重组技术将针对大鼠pi3... 详细信息

第一部分pi3-k/akt shRNA真核表达质粒的构建及鉴定目的:构建并鉴定针对pi3-k/akt基因的特异性短发卡RNA(shRNA)真核表达载体,探讨沉默大鼠肾组织内pi3-k/akt基因对Thy-1肾炎(Thy-1 N)增生病变的影响。方法:用DNA重组技术将针对大鼠pi3-k/akt基因不同位点所设计的8对shRNA序列克隆到真核表达质粒pGenesil-1中。在酶切分析及序列测定后,用脂质体转染至大鼠GMCs中,Western blotting检测蛋白的相对表达量来筛选最佳沉默效率的shRNA。结果:限制性酶切及核酸序列分析表明,重组质粒构建正确。Western blotting证实,在多种重组质粒中,以shpik3c3-2、shakt1-4具有最佳的沉默效率。结论:成功构建了pi3-k/akt shRNA的真核表达质粒,该结果为进一步体内研究沉默pi3-k/akt信号通路基因对Thy-1 N病变的抑制作用奠定了实验基础。第二部分沉默pi3-k/akt信号通路对Thy-1 N增生病变的影响目的:探讨用发夹状小干涉RNA(shRNA)沉默大鼠肾组织内pi3-k/akt基因对Thy-1N增生病变的影响。方法:用水流动力学注射法将shpik3c3-2、shakt1-4导入大鼠Thy-1 N肾组织,以Real-time PCR检测大鼠肾皮质中血小板反应蛋白-1(Thrombospondin-1,Tsp-1)、转化生长因子-beta 1(Transforming growth factor-β,TGF-β)、细胞周期蛋白(cyclinD)和纤维连接蛋白(Fibronectin,FN)mRNA丰度,Western blotting和免疫组化检测P-akt、T-akt、Tsp-1、TGF-β、cyclin D和FN蛋白表达水平。此外,实验还观察了大鼠肾脏组织病理学及24h尿蛋白的变化。结果:将shpik3c3-2、shakt1-4导入Thy-1 N大鼠肾组织后,发现大鼠肾皮质中P-akt和T-akt蛋白表达水平均明显减低,同时,Tsp-1、TGF-β、cyclin D和FN mRNA和蛋白表达水平也显著下调。大鼠肾皮质的组织病理学检查显示,肾小球内系膜细胞增生及细胞外基质过度积聚现象显著减轻。24h尿蛋白分泌也明显降低。结论:沉默Thy-1 N大鼠肾组织内pi3-k/akt基因,能够抑制Tsp-1、TGF-β的合成,减轻Thy-1 N增生病变。提示,pi3-k/akt信号分子有望成为今后治疗人类系膜增生性肾炎的一个靶点。

关键词： Thy-1肾炎(Thy-1 N) pi3-k/akt shRNA 肾小球系膜细胞(GMCs) 血小板反应蛋白-1(Tsp-1) 转化生长因子-beta1(TGF-β1) 细胞周期蛋白(cyclin D2) 纤维连接蛋白(FN)

电针刺激对大鼠脑缺血再灌注后pi3-k/akt通路的影响

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中国康复医学杂志 2009年第6期24卷 502-504页

作者：陈东风赖真张少君姚灿坤林婉娟暨南大学第二临床医学院深圳市人民医院理疗科深圳518020 暨南大学第二临床医学院深圳市人民医院中医科

目的:研究电针刺激百会和大椎两穴对脑缺血再灌注大鼠脑神经细胞凋亡的影响,并通过对皮质及纹状体缺血周围区pi3-k和akt的检测,进一步探讨电针刺激减少神经细胞凋亡的分子机制。方法:雄性SD大鼠,采用Zea Longa线栓法制备大鼠大脑中动脉... 详细信息

目的:研究电针刺激百会和大椎两穴对脑缺血再灌注大鼠脑神经细胞凋亡的影响,并通过对皮质及纹状体缺血周围区pi3-k和akt的检测,进一步探讨电针刺激减少神经细胞凋亡的分子机制。方法:雄性SD大鼠,采用Zea Longa线栓法制备大鼠大脑中动脉闭塞(MCAO)模型,缺血3h后再灌注。分为假手术组、模型组、电针组,分别于手术前12h、手术前30min、手术后每隔12h针刺百会、大椎穴1min,再通以电针治疗仪予疏密波治疗15min,直到48h后最后一批大鼠被处死;术后分第12、24、48小时三个时间点,采用神经功能评分观察神经功能缺损恢复程度;TUNEL法观察凋亡的情况;免疫组化观察皮质及纹状体缺血周围区pi3k和akt表达强度。结果:神经功能评分显示电针组恢复明显优于模型组(Ppi3k和akt免疫阳性细胞表达水平明显增高:模型组平均阳性细胞数显著低于电针组(Ppi3-k/akt信号通路的表达。

关键词：电针脑缺血再灌注凋亡 pi3-k/akt

柴胡三参胶囊对BMSCs分化为心肌细胞过程中pi3-k/akt信号通路的干预

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柴胡三参胶囊对BMSCs分化为心肌细胞过程中PI3-K/Akt信号通路的干...

作者：赵吉锐湖南中医药大学

学位级别：硕士

目的:研究柴胡三参胶囊含药血清对骨髓间充质干细胞分化为心肌细胞过程中pi3-k/akt信号通路的影响,探讨其对骨髓间充质干细胞分化为心肌细胞的干预机制,为柴胡三参胶囊的临床运用提供理论依据并为进一步研究拓宽思路。方法:将P代骨髓间... 详细信息

目的:研究柴胡三参胶囊含药血清对骨髓间充质干细胞分化为心肌细胞过程中pi3-k/akt信号通路的影响,探讨其对骨髓间充质干细胞分化为心肌细胞的干预机制,为柴胡三参胶囊的临床运用提供理论依据并为进一步研究拓宽思路。方法:将P代骨髓间充质干细胞随机分为四组,分别为BMP-2组、BMP-2+含药血清组、含药血清组及空白血清组,以MTT法检测BMSCs增殖情况,确定最佳浓度及最佳时间;加入相应浓度的诱导剂及血清,诱导至最佳时间,以Western blotting法检测各组细胞内akt蛋白表达水平;以RT-PCR法检测各组细胞内GATA-4、β-MHC m RNA表达情况。结果:MTT法检测骨髓间充质干细胞增殖实验结果显示:柴胡三参胶囊含药血清浓度在20%、诱导时间在24h条件下增殖最明显;诱导实验结果显示:与空白血清组相比,BMP-2组、BMP-2+含药血清组、含药血清组akt、GATA-4、β-MHC表达水平均明显升高,差异有显著统计学意义(P0.05)。结论:柴胡三参胶囊具有促进骨髓间充质干细胞增殖的作用,且能够通过作用于pi3-k/akt信号通路诱导骨髓间充质干细胞向心肌细胞定向分化。

关键词：柴胡三参胶囊心律失常 pi3-k/akt 骨髓间充质干细胞心肌细胞

柴胡三参胶囊含药血清对骨髓间充质干细胞分化为心肌细胞过程中pi3-k/akt信号通路干预

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辽宁中医药大学学报 2018年第8期20卷 15-18页

作者：刘建和赵吉锐雷娄芳杨成龙曾英王敏湖南中医药大学第一附属医院湖南长沙410007 湖南省重点实验室中西医结合心脑疾病防治实验室湖南长沙410007 湖南中医药大学湖南长沙410208

目的：研究柴胡三参胶囊含药血清对骨髓间充质干细胞分化为心肌细胞过程中pi3-k/akt信号通路的影响,探讨其抗心律失常机制与pi3-k/akt信号转导通路的相关性。方法：将P3代骨髓间充质干细胞随机分为4组,分别为BMP-2组、BMP-2＋含药血清... 详细信息

目的：研究柴胡三参胶囊含药血清对骨髓间充质干细胞分化为心肌细胞过程中pi3-k/akt信号通路的影响,探讨其抗心律失常机制与pi3-k/akt信号转导通路的相关性。方法：将P3代骨髓间充质干细胞随机分为4组,分别为BMP-2组、BMP-2＋含药血清组、含药血清组及空白血清组,以MTT法测BMSCs增殖情况,确定最佳浓度及最佳时间;加入相应浓度的诱导剂及血清,诱导至最佳时间,Western blotting法检测各组细胞内akt蛋白表达水平;RT-PCR法检测各组细胞内GATA-4、β-MHC m RNA表达情况。结果：与空白血清组相比,BMP-2组、BMP-2＋含药血清组、含药血清组akt、GATA-4、β-MHC表达水平均明显升高,统计学具有明显差异（P〈0.01）;与BMP-2组相比,BMP-2＋含药血清组表达水平升高（P〈0.05）,与含药血清组相比,BMP-2＋含药血清组表达水平升高（P〈0.05）;BMP-2组与含药血清组比较,差异无统计学意义（P〉0.05）。结论：柴胡三参胶囊能够通过作用于pi3-k/akt信号通路诱导骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化。

关键词：柴胡三参胶囊心律失常 pi3-k/akt 骨髓间充质干细胞心肌细胞

微囊藻毒素-LR通过pi3k/akt信号通路促进黑色素瘤细胞侵袭和肿瘤转移

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微囊藻毒素-LR通过PI3K/AKT信号通路促进黑色素瘤细胞侵袭和肿瘤...

作者：许鹏飞南京医科大学

学位级别：硕士

目的：微囊藻毒素MC-LR是蓝藻分泌的一种七环肽次级代谢产物,越来越多的证据表明,微囊藻毒素-LR可以促进人类肿瘤发生。而我们之前的研究已经证明微囊藻毒素-LR可以促进黑色素瘤细胞系MDA-MB-435的侵袭,但是进一步的分子机制并不是十分... 详细信息

目的：微囊藻毒素MC-LR是蓝藻分泌的一种七环肽次级代谢产物,越来越多的证据表明,微囊藻毒素-LR可以促进人类肿瘤发生。而我们之前的研究已经证明微囊藻毒素-LR可以促进黑色素瘤细胞系MDA-MB-435的侵袭,但是进一步的分子机制并不是十分清楚。本研究旨在通过体外和体内实验证明微囊藻毒素-LR促进黑色素瘤细胞侵袭的分子机制。方法：1、Western blot方法检测不同浓度的微囊藻毒素-LR(0,5,12.5,25,50nM)处理黑色素瘤细胞系MDA-MB-435,pakt/akt蛋白表达变化以及负向调节pi3-k/akt信号通路的PTEN蛋白表达情况。2、进一步通过添加pi3-k/akt抑制剂LY294002,荧光素酶报告基因方法检测LY294002是否逆转了MMP-2/-9的启动子活性;Western blot方法在蛋白水平检测微囊藻毒素-LR促进的MMP-2/-9的过表达是否被逆转;通过transwell方法检测微囊藻毒素-LR促进的肿瘤侵袭是否被逆转。3、用siRNA干扰akt表达,通过transwell实验检测微囊藻毒素-LR促进的肿瘤侵袭是否被逆转。4、在裸鼠水平上通过皮下注射肿瘤细胞系MDA-MB-435后给予微囊藻毒素-LR灌胃处理(0,0.001,0.01,0.1mg/kg/d)。每周测量一次肿瘤大小和裸鼠体重。5、通过免疫组织化学的方法检测MDA-MB-435肿瘤中MMP-2／-9以及pi3-k/akt信号通路中较重要的蛋白pakt的表达情况。6、通过H&E染色检测裸鼠肺组织中MDA-MB-435肿瘤转移情况。结果：1、Western blot方法检测发现微囊藻毒素-LR浓度>25nnM时,显著促进了pakt/akt的表达;负向调节蛋白PTEN,在25nM微囊藻毒素-LR处理下表达量最低,而在50nM微囊藻毒素-LR反而升高。2、我们进一步通过LY294002处理后,微囊藻毒素-LR促进的MMP-2/-9启动子活性以及蛋白过表达都被有效的逆转了;Transwell方法发现MDA-MB-435细胞侵袭能力也被逆转了。3、akt干扰后,微囊藻毒素-LR促进的MDA-MB-435细胞侵袭能力被逆转。4、体内试验发现通过给予裸鼠微囊藻毒素-LR灌胃处理后肿瘤的体积和重量并没有明显的区别。5、免疫组织化学方法检测发现微囊藻毒素-LR在0.01mg/kg/d浓度下有效的促进了MMP-2/--9的过表达,同时也促进了pi3-k/akt信号通路中最重要的蛋白pakt的表达。6、H&E染色结果表明微囊藻毒素-LR处理后促进了裸鼠肺肿瘤结节数,说明微囊藻毒素-LR在体内促进了MDA-MB-435肿瘤的肺转移。结论：微囊藻毒素-LR通过pi3-k/akt信号通路促进了MMP-2/-9的过表达进而促进了MDA-MB-435细胞侵袭转移,

关键词：微囊藻毒素-LR pi3-k/akt MMP-2/-9 侵袭转移

乙酰葛根素对脑缺血再灌注后神经细胞凋亡的影响及机制研究

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中国实验方剂学杂志 2011年第11期17卷 213-216页

作者：刘必旺王坤芳梁志刚刘亚明侯栋宇山西中医学院太原030024 山西中医学院第二中医院太原030024

目的:探讨脑缺血再灌注后乙酰葛根素的脑保护作用及其机制。方法:线栓法制作脑缺血再灌注模型,为假手术组、脑缺血再灌注组、胞磷胆碱组(0.6 mg·kg-1)、乙酰葛根素低、中、高剂量(10,50,250 mg·kg-1)i,g 10 d干预组。采用TUNEL法检测... 详细信息

目的:探讨脑缺血再灌注后乙酰葛根素的脑保护作用及其机制。方法:线栓法制作脑缺血再灌注模型,为假手术组、脑缺血再灌注组、胞磷胆碱组(0.6 mg·kg-1)、乙酰葛根素低、中、高剂量(10,50,250 mg·kg-1)i,g 10 d干预组。采用TUNEL法检测脑组织细胞凋亡情况,采用免疫组化方法观测各组大鼠脑内pi3-k(磷脂酰肌醇-3-激酶)和akt(丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶)的表达情况并进行神经功能缺损评分。结果:乙酰葛根素3个剂量组神经功能评分比模型组显著改善(Ppi3-k和akt表达显著升高(Ppi3-k/akt信号通路可能是乙酰葛根素减少神经细胞凋亡、起到神经保护作用的机制之一。

关键词：乙酰葛根素脑缺血再灌注凋亡 pi3-k/akt

高强度间歇运动对自发性高血压模型大鼠病理性心脏肥大的影响及机制

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中国组织工程研究 2020年第23期24卷 3708-3715页

作者：袁国强秦永生彭朋郑州航空工业管理学院体育部河南省郑州市450015 中国人民武装警察部队后勤学院卫生勤务系天津市300309

背景:规律运动具有健康促进效应,中低强度持续有氧运动已成为高血压等慢性病患者一级和二级预防的重要策略,然而高强度间歇运动的效果尚存在争议。目的:观察高强度间歇运动对自发性高血压大鼠病理性心脏肥大的作用并探讨其可能机制。方... 详细信息

背景:规律运动具有健康促进效应,中低强度持续有氧运动已成为高血压等慢性病患者一级和二级预防的重要策略,然而高强度间歇运动的效果尚存在争议。目的:观察高强度间歇运动对自发性高血压大鼠病理性心脏肥大的作用并探讨其可能机制。方法:30只雄性自发性高血压大鼠随机分为对照组和运动组,同时将15只Wistar-kyoto大鼠作为正常血压组。正常血压组和对照组大鼠保持安静状态,运动组进行8周高强度间歇运动。实验后利用无创血压仪测定血压,超声心动术检测心脏结构与功能,苏木精-伊红染色获取心肌细胞横截面积,RT-PCR法检测胚胎基因——心房钠尿肽和脑钠尿肽的mRNA表达量,Western blot法检测pi3-k、akt、CnAβ和NFATc3的蛋白表达量。结果与结论:①与正常血压组比较,对照组血压升高(P3/t-NFATc3比值降低(Ppi3-k(p110α)蛋白和p-akt/t-akt比值无显著变化(P>0.05);②与对照组比较,运动组收缩压下降(Ppi3-k(p110α)蛋白和p-akt/t-akt比值升高(P3/t-NFATc3比值无显著变化(P>0.05);③结果表明,8周高强度间歇运动激活pi3-k/akt信号转导途径诱导自发性高血压大鼠由病理性心脏肥大向生理性肥大转变并改善心功能,但并未对Cn/NFAT途径产生抑制效应。

关键词：高强度间歇运动高血压心脏肥大大鼠信号转导途径 pi3-k/akt Cn/NFAT

骨髓间充质干细胞分泌基质细胞衍生因子1保护心肌细胞

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中国组织工程研究 2013年第6期17卷 963-968页

作者：毛洪波邹赛唐俊明杨建业王家宁孔霞郭凌郧郑飞张蕾黄永章湖北省竹溪县人民医院内科湖北省竹溪县442300 湖北医药学院附属人民医院临床医学研究所湖北省十堰市442000 湖北医药学院生理学教研室湖北省十堰市442000

背景:有研究显示表达CXCR4的干细胞能够沿着基质细胞衍生因子1的浓度梯度迁移到心肌梗死部位再生心肌和血管而改善心脏的功能。目的:探索间充质干细胞通过其分泌的基质细胞衍生因子1对心肌细胞的保护作用。方法:收集培养2d的间充质干细... 详细信息

背景:有研究显示表达CXCR4的干细胞能够沿着基质细胞衍生因子1的浓度梯度迁移到心肌梗死部位再生心肌和血管而改善心脏的功能。目的:探索间充质干细胞通过其分泌的基质细胞衍生因子1对心肌细胞的保护作用。方法:收集培养2d的间充质干细胞条件培养基。在缺氧条件,利用基质细胞衍生因子1受体CXCR4阻断剂AMD3100或pi3-k/akt途径阻断剂LY294002预处理H9C2细胞后,利用AnnexinV/pi双标法流式细胞术分析间充质干细胞条件培养基作用下H9C2细胞凋亡的变化;Westernblotting分析H9C2细胞磷酸化akt蛋白的表达;RT-PCR分析间充质干细胞基质细胞衍生因子1的表达。结果与结论:RT-PCR结果显示间充质干细胞表达基质细胞衍生因子1,Westernblotting结果显示间充质干细胞条件培养基增加了H9C2细胞磷酸化akt蛋白的水平。AnnexinV/pi分析发现间充质干细胞条件培养基明显降低了H9C2细胞缺氧复氧后的凋亡,且这种抗凋亡作用能被CXCR4阻断剂AMD3100或pi3-k/akt途径阻断剂LY294002所阻断。说明间充质干细胞通过其分泌的基质细胞衍生因子1通过激活pi3-k/akt途径保护H9C2细胞,增加H9C2细胞的幸存能力。

关键词：干细胞骨髓干细胞间充质干细胞 H9 C2细胞心肌细胞心肌梗死基质细胞源衍生因子1 凋亡 pi3-k/akt 国家自然科学基金干细胞图片文章

大黄素对白血病细胞株U937增殖、凋亡的影响及机制探讨

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大黄素对白血病细胞株U937增殖、凋亡的影响及机制探讨

作者：连晓岚福建医科大学

学位级别：硕士

目的①研究中药大黄素(Emodin)对人髓系白血病U937细胞株增殖、凋亡的影响。②观察对U937细胞增殖、凋亡相关基因及蛋白表达的影响,探讨其作用机制。③大黄素作用后对细胞pi3k/akt信号转导通路中蛋白表达的变化。方法应用MTT法绘制细... 详细信息

目的①研究中药大黄素(Emodin)对人髓系白血病U937细胞株增殖、凋亡的影响。②观察对U937细胞增殖、凋亡相关基因及蛋白表达的影响,探讨其作用机制。③大黄素作用后对细胞pi3k/akt信号转导通路中蛋白表达的变化。方法应用MTT法绘制细胞生长曲线;克隆形成试验观察大黄素对U937细胞增殖的影响;AO-EB荧光染色、线粒体膜电位检测、DNA倍体分析及DNA凝胶电泳分析细胞凋亡及周期变化;流式细胞术测定大黄素作用前后caspase-3活性变化;RT-PCR检测大黄素作用前后Bcl-2、Bax、h-TERT、pim-2、c-myc、TGF-β1、survivin、P21、Mcl-1、野生型P53基因mRNA表达水平的变化,蛋白印迹法(Western-Blot)检测Bcl-2、Bax、h-TERT、cyclinD1、procaspase-3和PARP蛋白以及akt、pakt、NF-κB(p65)和pNF-κB(pp65)蛋白表达水平的变化。结果细胞生长曲线及克隆形成实验结果显示大黄素能抑制U937细胞增殖,作用72小时的半数抑制浓度(IC50)约为30μM;U937细胞核内浓缩聚集的染色质、线粒体膜电位的改变、亚G1峰(凋亡峰)及DNA片段化的检出证实大黄素能诱导U937细胞凋亡,并呈量效关系。大黄素作用后G0/G1期细胞比例较对照组增高,S期比例下降,且与药物浓度呈正相关。大黄素作用后caspase-3活性增高,并呈时效关系。同时U937细胞Bcl-2、c-myc、h-TERT、pim-2、Survivin基因mRNA表达随着作用时间的延长而逐渐减少;Bax、野生型P53、P21、TGFβ1基因mRNA表达随着作用时间的延长而逐渐升高;mcl-1基因表达无明显改变。Western-Blot的结果显示Bcl-2、Bax、h-TERT、cyclinD1、procaspase-3、116kD的PARP、pakt、NF-κB(p65)和pNF-κB(pp65)蛋白的表达水平均下降,并且随作用时间延长,表达下降更明显;而PARP蛋白的85kd的裂解片段逐渐增高,akt蛋白表达无明显改变。结论大黄素可抑制U937细胞增殖,诱导其凋亡,在一定浓度范围内呈剂量时间效应关系,并将细胞阻滞于G0/G1期,可能是通过下调Bcl-2、c-myc、h-TERT、pim-2、Survivin、procaspase-3、cyclinD1、Pakt、NF-κB(p65)、pNF-κB(pp65) mRNA和/或蛋白表达,上调Bax、野生型P53、P21、TGFβ1基因表达而起作用的,涉及了多基因、多途径的过程。

关键词：大黄素 U937细胞增殖凋亡 pi3-k/akt