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phgdh介导的糖酵解在镉引起的A549细胞增殖中的作用研究

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PHGDH介导的糖酵解在镉引起的A549细胞增殖中的作用研究

作者：罗盛向大连医科大学

学位级别：硕士

目的:根据2023年美国癌症统计数据显示,预计癌症死亡有609,820例,其中肺癌死亡占比为21%,每天约350人死于肺癌。虽然吸烟是造成肺癌发生的主要原因,但重金属暴露也被认为是一个重要的致病因素。镉暴露也与肺癌密切相关,并且镉暴露会导... 详细信息

目的:根据2023年美国癌症统计数据显示,预计癌症死亡有609,820例,其中肺癌死亡占比为21%,每天约350人死于肺癌。虽然吸烟是造成肺癌发生的主要原因,但重金属暴露也被认为是一个重要的致病因素。镉暴露也与肺癌密切相关,并且镉暴露会导致抗氧化能力的削弱从而致癌。phgdh作为丝氨酸合成途径的关键酶,在许多癌症中高表达。研究发现镉能够诱导phgdh的表达,并且糖酵解参与镉诱导的细胞增殖。因此,本研究旨在探讨phgdh介导的糖酵解在镉诱导的细胞增殖中的作用。方法:本研究采用人肺腺癌（A549）细胞、人胚肺成纤维（HELF）细胞、人正常肝（L-02）细胞、人肺癌（H1299）细胞、人卵巢癌（A2780和OVCAR3）细胞、人肝癌（Hep G2）细胞和人乳腺癌（MCF-7）细胞作为体外实验模型。将BALB/c小鼠作为体内动物实验模型,当BALB/c小鼠经过氯化镉处理和HMGA2质粒转染后,Western blot观察phgdh的表达。细胞划痕实验观察转染小干扰RNA（si phgdh）后,氯化镉处理诱导的细胞增殖和迁移能力的变化。葡萄糖和乳酸含量测定试剂盒测定转染si phgdh后,氯化镉处理培基中葡萄糖、乳酸含量。Hoechst实验观察转染si phgdh后,氯化镉处理对细胞凋亡的形态学变化。转染si phgdh和HMGA2质粒后,Western blot观察有氧糖酵解和氧化磷酸化（OXPHOS）相关蛋白的表达。染色质免疫沉淀（Chromatin immunoprecipitation,Ch IP）实验观察HMGA2对phgdh基因表达的影响。经氯化镉和HIF-1α抑制剂YC-1处理,以及HIF-1α激活剂CoCl处理和转染si phgdh后,Western blot观察HMGA2、phgdh的表达。在BALB/c小鼠体内建立异种移植瘤模型,观察phgdh和氯化镉处理对异种移植瘤形成的影响。结果:phgdh在不同细胞系中的表达结果显示,phgdh在A549和HELF细胞中表达较高。CdCl处理的A549细胞、HELF细胞和BALB/c小鼠肺组织中phgdh表达升高。细胞划痕实验和Hoechst实验结果显示,转染si phgdh后,抑制CdCl诱导的细胞增殖和迁移并促进细胞凋亡,说明phgdh在CdCl诱导的细胞增殖、迁移和凋亡中发挥重要作用。葡萄糖和乳酸含量测定结果显示,si phgdh并没有减少CdCl诱导的葡萄糖摄取,但明显减少了CdCl诱导的乳酸产生。Western blot实验结果显示,转染si phgdh后,CdCl诱导的PKM2和LDHA的表达减少,抑制的COX IV和ND1的表达增加,但并没有减少CdCl诱导的GLUT1,说明phgdh参与CdCl诱导的糖酵解和抑制的OXPHOS。Western blot实验结果显示,si phgdh抑制HMGA2质粒诱导的有氧糖酵解相关蛋白的表达减少,抑制的OXPHOS相关蛋白的表达增加。Ch IP实验结果显示,HMGA2蛋白可以与phgdh基因启动子序列结合,说明HMGA2调节糖酵解和氧化磷酸化是通过对phgdh的转录调控。Western blot实验结果显示,利用YC-1明显减少了CdCl诱导的HMGA2和phgdh的表达。而si phgdh并没有减少CoCl诱导的HIF-1α和HMGA2的表达,说明HIF-1α参与了CdCl诱导的HMGA2和phgdh的表达。异种移植瘤实验表明,si phgdh对CdCl处理的BALB/c小鼠移植瘤的重量和体积有抑制作用。结论:综上所述,CdCl诱导HIF-1α升高,HMGA2/phgdh介导的糖酵解在CdCl诱导的细胞增殖中发挥了重要作用。

关键词：氯化镉 phgdh HMGA2 HIF-1α 糖酵解

ATF4在子宫内膜癌细胞中调节phgdh和SHMT2的作用及机制研究

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ATF4在子宫内膜癌细胞中调节PHGDH和SHMT2的作用及机制研究

作者：车得路河南大学

学位级别：硕士

实验目的:子宫内膜癌通常与能量代谢紊乱有关,探讨子宫内膜癌细胞中能量代谢的作用机制对治疗子宫内膜癌具有重要意义。而丝氨酸作为人体内的八种非必需氨基酸之一,在人体内参与多种生理活动,可以为细胞增殖提供一碳单位、甘氨酸等,并... 详细信息

实验目的:子宫内膜癌通常与能量代谢紊乱有关,探讨子宫内膜癌细胞中能量代谢的作用机制对治疗子宫内膜癌具有重要意义。而丝氨酸作为人体内的八种非必需氨基酸之一,在人体内参与多种生理活动,可以为细胞增殖提供一碳单位、甘氨酸等,并在肿瘤进程中扮演重要角色。人体内的丝氨酸来源主要有两种途径:Ⅰ自身合成途径;Ⅱ通过外界环境摄取。磷酸甘油脱氢酶（phosphoglycerate dehydrogenase）是丝氨酸合成的第一个酶也是限速酶,丝氨酸羟甲基转移酶（serine hydroxymethyltransferase 2）主要分布于线粒体中,可以将甘氨酸转化为丝氨酸。研究发现在结直肠癌细胞中限制丝氨酸合成联合培养基中缺少丝氨酸/甘氨酸可以抑制肿瘤生长,但该项研究没有具体揭示当丝氨酸合成抑制后并联合培养基中缺少丝氨酸/甘氨酸后的作用机制。因此本课题主要阐述激活转录因子4（activating transcription factor 4）在丝氨酸/甘氨酸缺失后在子宫内膜癌中的作用机制,为丝氨酸研究提供一个新思路,也为子宫内膜癌的治疗提供一个新的方法和策略。实验方法:1.采用TCGA大数据分析人子宫内膜癌组织与癌旁组织中phgdh蛋白表达量的区别,具体分析了13对病人的癌组织和癌旁组织中的phgdh表达含量的区别。随后通过分析子宫内膜癌患者的总进展生存期和无进展生存期,检测phgdh与子宫内膜癌患者预后的关系。2.在子宫内膜癌细胞中,通过Quantitative Real-time PCR实验和Western Blot实验检测子宫内膜癌细胞中丝氨酸合成关键酶表达含量。3.通过si RNA转染抑制phgdh后,检测抑制phgdh后对AN3CA增殖活性的影响。随后用phgdh抑制剂NCT-503处理AN3CA和Ishikawa细胞,并用phgdh低表达的HEC-1-A细胞作为对照,检测NCT-503对phgdh依赖的子宫内膜癌细胞的影响。4.研究抑制丝氨酸合成并联合培养基中缺失丝氨酸/甘氨酸对子宫内膜癌细胞活性的影响。用缺失丝氨酸和缺失丝氨酸/甘氨酸的培养基联合不同浓度的NCT-503处理AN3CA细胞,检测其对子宫内膜癌细胞的影响。5.检测phgdh抑制细胞增殖的作用机制。通过DCFH-DA法检测了抑制phgdh对ROS的影响,并用ROS的清除剂TOC预处理后,用DCFH-DA法检测了在子宫内膜癌细胞中ROS的变化。6.探讨抑制丝氨酸合成联合培养基中缺少丝氨酸/甘氨酸对ROS的影响。用DCFH-DA法检测了抑制phgdh联合培养基中缺少丝氨酸/甘氨酸对ROS的影响,用TOC预处理后,通过DCFH-DA法检测了其对ROS的影响;用MTT法检测了其对子宫内膜癌细胞活性的影响;用Annexin V-FITC/PI和Western Blot法检测了其对AN3CA细胞凋亡的影响。7.研究抑制丝氨酸合成途径并联合培养基中缺失丝氨酸/甘氨酸对子宫内膜癌细胞活性的影响。用MTT法检测加入NCT-503和SHIN1并联合培养基中缺少丝氨酸/甘氨酸对子宫内膜癌细胞增殖的影响,并用TOC预处理后检测了加入TOC后对子宫内膜癌细胞增殖的影响。8.检测在子宫内膜癌细胞中p53能否调控phgdh。首先检测了在五株子宫内膜癌细胞中p53蛋白的表达情况,随后在p53高表达的HEC-1-A和HEC-1-B细胞用p53抑制剂Pifithrinα处理24 h后,检测了抑制p53后对phgdh的影响,并且挑选了p53低表达的AN3CA和Ishikawa细胞用p53诱导剂Nutlin-3a处理24 h后,检测了诱导p53后对phgdh的影响。9.研究在子宫内膜癌细胞中ATF4能否调控phgdh:在AN3CA和Ishikawa细胞中用ATF4的si RNA处理,然后分别用Western Blot法和Quantitative Real-time PCR法检测了沉默ATF4后对phgdh和SHMT2的蛋白水平和m RNA水平的影响。为了进一步验证,我们随后用ATF4高表达质粒转染两株细胞后,用Western Blot法和Quantitative Real-time PCR法检测了对phgdh和SHMT2的影响。当缺失丝氨酸/甘氨酸后我们检测了ATF4、phgdh和SHMT2的m RNA和蛋白表达含量的变化。实验结论:抑制phgdh可以升高ROS,进而影响子宫内膜癌细胞的增殖和诱导子宫内膜癌细胞凋亡。在丝氨酸/甘氨酸缺失后抑制丝氨酸的合成可以有效抑制子宫内膜癌细胞的增殖,而ROS清除剂TOC则会逆转这种现象。缺失丝氨酸/甘氨酸后,会引起ATF4蛋白的升高,ATF4升高后进而会促进phgdh和SHMT2蛋白表达量升高,从而促进细胞内的丝氨酸合成途径,以维持肿瘤细胞生长。

关键词：丝氨酸甘氨酸 phgdh SHMT2 ATF4 子宫内膜癌

phgdh及MTHFD2在子宫内膜癌组织中的表达及其临床应用价值评估

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PHGDH及MTHFD2在子宫内膜癌组织中的表达及其临床应用价值评估

作者：朱佳敏南方医科大学

学位级别：硕士

研究背景子宫内膜癌作为女性生殖道三大恶性肿瘤之一,是发生于子宫内膜的一组上皮性恶性肿瘤,是世界上第六种最常见的恶性疾病。研究发现,子宫内膜癌的发病率逐年升高,发病人群也有年轻化的趋势,因而,国内外越来越重视对子宫内膜癌的研... 详细信息

研究背景子宫内膜癌作为女性生殖道三大恶性肿瘤之一,是发生于子宫内膜的一组上皮性恶性肿瘤,是世界上第六种最常见的恶性疾病。研究发现,子宫内膜癌的发病率逐年升高,发病人群也有年轻化的趋势,因而,国内外越来越重视对子宫内膜癌的研究。目前对于子宫内膜癌的发生、发展机制仍不甚清楚。我们希望通过研究,清晰子宫内膜癌发生的途径,从而找到可以对子宫内膜癌进行早期诊断、早期治疗的方式。3-磷酸甘油脱氢酶(phgdh)是L-丝氨酸合成过程中的重要催化酶。亚甲基四氢叶酸脱氢酶2(MTHFD2)基因编码线粒体的双功能蛋白,是线粒体中叶酸代谢途径中的关键酶。这两种蛋白在许多恶性肿瘤细胞中皆呈高水平表达,在正常子宫内膜组织中的表达则不同。我们发现这两种蛋白都与叶酸代谢相关,而叶酸代谢则是目前公认的促进恶性肿瘤细胞增长的途径。我们猜测,phgdh及MTHFD2是否可以成为子宫内膜癌新的诊断及治疗的研究方向?在临床上是否有一定的应用价值?目的经过对三种不同子宫内膜组织中的phgdh及MTHFD2的蛋白表达情况的检测对比,比较phgdh及MTHFD2在子宫内膜癌组织中的表达情况与不同临床病理特征是否相关。阐明phgdh及MTHFD2在子宫内膜癌发生、发展过程当中可能发生的变化。评估phgdh及MTHFD2在临床上对于子宫内膜癌的诊断及治疗过程可能存在的意义。方法我们此次共收集子宫内膜癌标本一共63例,选取了子宫内膜增生组织55例以及正常子宫内膜组织20例,将患者的组织蜡块取出后进行实验。在进行免疫组化实验后,对phgdh及MTHFD2在三组子宫内膜组织中的表达结果进行检测。结果1、phgdh及MTHFD2在正常的子宫内膜组织、发生子宫内膜增生的组织、子宫内膜癌组织中的高表达率均是逐渐增长的(Pphgdh的表达与手术病理分期、有无脉管癌栓及淋巴转移关系较为密切(此时P0.0125)。3、MTHFD2在子宫内膜癌组织中的表达与手术病理分期关系较为密切(此时P0.0125)。4、在向子宫内膜癌组织逐渐转化的过程当中,phgdh与MTHFD2的表达呈现出较强正相关性(此时P=0.000,r=0.652)。结论1、从正常子宫内膜发展到增生期子宫内膜,再到子宫内膜癌组织过程中,phgdh及MTHFD2的蛋白表达量是逐渐上升的,这个结果提示我们,子宫内膜癌的发生可能有这两种酶的参与。同时,不同临床病理特征下的子宫内膜癌中的phgdh及MTHFD2的不同的表达情况,使得这两种蛋白可能可以协助子宫内膜癌早期的诊断,同时为子宫内膜癌的术前情况的评估及临床上治疗方式的选择提供了参考。2、phgdh在子宫内膜癌中的特异性及灵敏度高于MTHFD2,两种蛋白的共同检测不能增加其诊断价值。3、在向子宫内膜癌组织转化的过程中,phgdh与MTHFD2的表达逐渐增强,且呈较强的正相关性,提示这两种蛋白可能成为子宫内膜癌靶向治疗的突破口。

关键词：子宫内膜癌 phgdh MTHFD2 靶向治疗临床应用价值

phgdh抑制剂NCT-503联合去甲基化剂SGI-1027对非小细胞肺癌抗肿瘤作用机制的研究

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PHGDH抑制剂NCT-503联合去甲基化剂SGI-1027对非小细胞肺癌抗肿瘤...

作者：黄莹莹天津医科大学

学位级别：硕士

目的:本文探究磷酸甘油酸脱氢酶(phosphoglycerate dehydrogenase,phgdh)抑制剂NCT-503抗非小细胞肺癌细胞系A549的作用,进一步联合去甲基化剂SGI-1027,并探索NCT-503联合SGI-1027协同抗非小细胞肺癌A549细胞系作用的机制。为phgdh抑制... 详细信息

目的:本文探究磷酸甘油酸脱氢酶(phosphoglycerate dehydrogenase,phgdh)抑制剂NCT-503抗非小细胞肺癌细胞系A549的作用,进一步联合去甲基化剂SGI-1027,并探索NCT-503联合SGI-1027协同抗非小细胞肺癌A549细胞系作用的机制。为phgdh抑制剂在肿瘤方向的应用提供理论依据和实验基础,进一步为临床治疗非小细胞肺癌提供新的可能性和方案。方法:1.利用MTT法检测一系列浓度phgdh抑制剂NCT-503作用不同时间对人非小细胞肺癌A549细胞的增殖抑制作用,并求算出IC50,确定给药剂量和最佳给药时间。2.利用流式细胞术结合Annexin V-FITC/碘化丙啶(Propidium iodide,PI)双染法检测NCT-503对A549细胞凋亡的影响。3.利用流式细胞术结合PI染色检测NCT-503对A549细胞周期的影响。并利用Western Blot方法检测NCT-503作用于A549细胞后,细胞周期相关蛋白cyclin D1和p27的表达以及Rb的磷酸化水平变化。4.利用MTT法检测SGI-1027作用72小时对人非小细胞肺癌A549增殖的抑制作用,并求算出IC50。5.利用MTT实验结合Calcusyn软件,采用Chou-Talalay法分析NCT-503与SGI-1027联用对A549细胞增殖抑制的联合指数(CI)。6.利用流式细胞术结合Annexin V-FITC/PI双染法检测NCT-503与SGI-1027联用对A549细胞凋亡的影响,并利用Western Blot方法检测凋亡相关蛋白pro-caspase3和PARP切割活化水平。7.利用流式细胞术结合PI染色检测NCT-503与SGI-1027联用对A549细胞周期的影响。并利用Western Blot方法检测细胞周期相关蛋白cyclin D1和p27的表达以及Rb的磷酸化水平变化。8.利用Western Blot法检测NCT-503与SGI-1027联用对A549细胞中AMP活化蛋白激酶(Adenosine 5'-monophosphate-activated protein kinase,AMPK)、信号转换和转录激活因子 3(Signal transducing activator of transcription 3,Stat3)磷酸化水平、磷酸肌醇 3 激酶(Phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)通路关键蛋白3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1(3-phosphoinositide-dependent protein kinase 1,PDK1)、蛋白激酶B(Protein kinase B,Akt)、哺乳动物雷帕霉素靶点(Mammalian target of rapamycin,mTOR)等磷酸化水平。以及细胞外调节蛋白激酶(Extracellular regulated protein kinases,ERK)通路(Ras/Raf/ERK 通路)中 c-Raf(Rapidly accelerated fibrosarcoma)和 ERK 的磷酸化水平的影响。结果:***-503能够抑制非小细胞肺癌A549细胞增殖,并呈剂量依赖性,作用72小时的IC50为14.5 μM。NCT-503对A549细胞没有诱导凋亡作用,但可以使A549细胞周期阻滞于G0/G1期。***-503 与 SGI-1027 联合比例为 IC50NCT-503:IC50 SGI-1027 时具有协同作用。3.联合给予NCT-503和SGI-1027,能促进A549细胞的凋亡。与单药组相比,联合组 pro-caspase3 蛋白水平明显降低,cleaved-caspase3、cleaved-PARP 表达显著性增多。4.联合给予NCT-503和SGI-1027,能促进A549细胞周期阻滞于G0/G1期。与单药组相比,联合组cyclin D1降表达、Rb的磷酸化水平下调、周期抑制因子p27上升。5.联合给予A549细胞NCT-503和SGI-1027时,AMPK磷酸化水平上升、Stat3磷酸化水平降低、PI3K/Akt/mTOR通路关键蛋白PDK1、Akt、mTORC1的磷酸化水平也较单给药时降低,Ras/Raf/ERK通路中c-Raf与ERK磷酸化水平下降。结论:***抑制剂NCT-503对非小细胞肺癌A549细胞增殖有一定的抑制作用,其不能诱导细胞凋亡,对A549增殖的抑制作用是通过将A549细胞周期阻滞于G0/G1期实现的。2.与单独用药相比,NCT-503与去甲基化剂SGI-1027联用可以协同抑制A549细胞增殖,明显诱导A549的凋亡,将A549细胞周期阻滞于G0/G1,并激

关键词： phgdh NCT-503 SGI-1027 联合给药非小细胞肺癌

MERIT40增强phgdh的酶活性并促进乳腺肿瘤的发展

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MERIT40增强PHGDH的酶活性并促进乳腺肿瘤的发展

作者：邓林巧厦门大学

学位级别：硕士

乳腺癌是全球范围内女性最常见的恶性肿瘤之一,也是引起女性死亡的重要病因,研究乳腺癌相关的分子机制具有重要的意义。人类中,MERIT40基因所在位点是首个被发现的三阴性乳腺癌的风险位点。并且,该基因外显子区rs8170位TT基因型被发现... 详细信息

乳腺癌是全球范围内女性最常见的恶性肿瘤之一,也是引起女性死亡的重要病因,研究乳腺癌相关的分子机制具有重要的意义。人类中,MERIT40基因所在位点是首个被发现的三阴性乳腺癌的风险位点。并且,该基因外显子区rs8170位TT基因型被发现与三阴性乳腺癌的高发病率相关。MERIT40蛋白是DNA双链损伤修复复合体BRCA1-A的组成成员之一,它的功能是维持整个BRCA1-A复合体的稳定性,促进复合体的组成并介导DNA损伤修复。为了探索MERIT40在乳腺癌中可能存在的新功能,我们实验室以MERIT40为饵进行了蛋白质间相互作用的筛查后发现phgdh与MERIT40之间存在相互作用,并且在葡萄糖饥饿刺激下会增强这种相互作用。phgdh是糖酵解——丝氨酸生物合成途径中的第一个分支酶,也是催化丝氨酸合成一系列反应的限速酶。许多研究证实,phgdh高表达于多种乳腺癌中并与肿瘤细胞的生长息息相关,但其酶活调控机制仍不清楚。我们通过构建体外酶活测量体系发现,过表达MERIT40增强了phgdh酶活力,而敲低MERIT40使phgdh的酶活力降低了,体外回补MERIT40蛋白能够在一定程度上挽救由于MERIT40缺失导致的phgdh酶活力的降低。在细胞模型中,MERIT40的存在可以很大程度上维持细胞在葡萄糖饥饿条件下的生存,降低细胞的死亡率。在小鼠乳腺原位移植瘤模型中,敲低MERIT40显著降低了 MDA-MB-468乳腺癌细胞在小鼠乳腺原位的生长速率。这一发现可能为乳腺癌的治疗提供一个新的药物靶点。

关键词：乳腺癌 MERIT40 phgdh

NBA1与phgdh相互作用并促进乳腺癌的生长

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NBA1与PHGDH相互作用并促进乳腺癌的生长

作者：吴筠梅厦门大学

学位级别：硕士

NBA1是BRCA1复合体中重要的接头蛋白,对整个BRCA1复合体的构架以及复合体成员蛋白的稳定性十分重要,它参与DNA损伤复合体的组成并且介导DNA的损伤修复。为了探究NBA1新的功能,我们以NBA1为饵进行了蛋白相互作用的筛查,发现phgdh与NBA1... 详细信息

NBA1是BRCA1复合体中重要的接头蛋白,对整个BRCA1复合体的构架以及复合体成员蛋白的稳定性十分重要,它参与DNA损伤复合体的组成并且介导DNA的损伤修复。为了探究NBA1新的功能,我们以NBA1为饵进行了蛋白相互作用的筛查,发现phgdh与NBA1存在着相互作用。phgdh作为糖酵解通路的旁支——丝氨酸合成通路的第一个分支酶,是下游一系列反应的重要限速因素。此外,在许多乳腺癌的发生发展过程中phgdh都扮演了重要的角色。本文的研究中我们通过一系列实验首次发现NBA与phgdh存在相互作用并且葡萄糖饥饿刺激增强这种相互作用,而糖酵解中间代谢物3-磷酸甘油酸对这两个蛋白的相互作用有直接影响。一方面,我们鉴定出了 NBAl与phgdh发生相互作用的位置,另一方面,我们发现NBAl不会影响phgdh四聚体的形成,但是会减弱PKCζ对phgdh的磷酸化。最后,我们通过细胞和小鼠乳腺癌模型看到了 NBA1对乳腺癌生长具有促进作用。我们对NBAl和phgdh的联系进行的初步探究,提供了一个NBA1通过phgdh影响肿瘤生长的潜在机制,可能成为乳腺癌治疗的一个新的药物靶点。

关键词：乳腺癌 NBA1 phgdh

YY2通过抑制丝氨酸代谢限速酶磷酸甘油酸脱氢酶（phgdh）阻止结肠癌细胞的增殖

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YY2通过抑制丝氨酸代谢限速酶磷酸甘油酸脱氢酶（PHGDH）阻止结肠...

作者：李卓霖重庆大学

学位级别：硕士

阴阳2(Yin Yang 2,YY2)是最近发现的具有锌指结构域的YY家族转录因子。YY2最早出现在胎盘哺乳动物进化完成之后,是YY家族另一转录因子阴阳1(Yin Yang 1,YY1)的逆转录拷贝。YY家族中的YY2和YY1在核苷酸和氨基酸序列上高度同源。而YY1已... 详细信息

阴阳2(Yin Yang 2,YY2)是最近发现的具有锌指结构域的YY家族转录因子。YY2最早出现在胎盘哺乳动物进化完成之后,是YY家族另一转录因子阴阳1(Yin Yang 1,YY1)的逆转录拷贝。YY家族中的YY2和YY1在核苷酸和氨基酸序列上高度同源。而YY1已被广泛研究证明可作为转录因子参与调控多种生物过程;然而,尽管最近研究表明YY2能够参与免疫调节、发育过程并抑制肿瘤的发生,但目前我们对YY2生物学和病理生理功能的了解仍然非常有限。代谢重编程是肿瘤细胞在恶劣微环境下快速增殖和存活的关键特征之一。最近的研究表明,除了葡萄糖和脂类代谢的重编程外,肿瘤细胞也改变了它们的氨基酸代谢方式。例如,肿瘤细胞通过上调谷氨酸转运蛋白促进谷氨酰胺代谢,以回补三羧酸循环(TCA)循环为肿瘤细胞提供能量,同时产生重要的还原剂谷胱甘肽(GSH)清除肿瘤细胞快速增殖积累的活性氧(ROS);除此之外,肿瘤细胞还能通过促进丝氨酸代谢过程中的酶的表达促进丝氨酸代谢,为肿瘤细胞提供核酸合成前体并产生大量还原性物质还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)维持细胞内氧化还原平衡,氨基酸代谢重塑的改变促进了肿瘤的发生发展。另一方面,YY2目前被证实是一种肿瘤抑制因子,可以有效抑制细胞周期进程和肿瘤发生,但其分子作用机制尚未完全阐明。此外,它是否参与肿瘤细胞代谢重编程,特别是肿瘤细胞氨基酸代谢重编程,目前仍尚未清楚。首先,我们通过RNA-Seq测序和KEGG分析发现,YY2过表达导致肿瘤细胞代谢途径中的丝氨酸代谢通路富集。丝氨酸代谢产物的减少进一步证实了YY2对丝氨酸代谢途径的影响。此外,我们发现YY2对丝氨酸代谢的抑制作用显著导致结肠癌细胞增殖潜能的降低。RNA-Seq测序结果、定量PCR以及蛋白质定量分析结果表明,YY2显著下调丝氨酸代谢途径3-磷酸甘油酸脱氢酶(phgdh)的m RNA和蛋白表达水平,phgdh是丝氨酸合成代谢途径的关键限速酶,可将3-磷酸甘油酸(3PG)转化为3-磷酸羟基丙酮酸(3PHP),随后,3-磷酸羟基丙酮酸(3PHP)在磷酸丝氨酸氨基转移酶1(PSAT1)作用下形成3-磷酸丝氨酸(3PS),最后,3-磷酸丝氨酸(3PS)在磷酸丝氨酸磷酸酶(PSPH)的作用下转化为丝氨酸,完成丝氨酸从头合成。此外,通过对丝氨酸代谢产物的检测以及对结肠癌细胞增殖潜能的分析,我们发现同时过表达YY2和phgdh可消除YY2对丝氨酸代谢和肿瘤细胞增殖的抑制作用,提示YY2调控PHDGH是其通过调节氨基酸代谢途径抑制肿瘤细胞增殖的关键。同时,前期研究表明YY2可以调控肿瘤抑制因子p53的表达,而p53又负调控phgdh的表达。为了阐明YY2对phgdh表达的调控是否依赖于p53,我们利用p53缺失的结肠癌细胞HCT116细胞分析了过表达YY2对HCT116细胞中phgdh表达水平以及丝氨酸代谢产物水平的影响,实验结果表明YY2对phgdh的调控不依赖于p53的表达。为了进一步解析YY2调控phgdh表达的具体分子机制,我们进行了双荧光素酶报告基因实验和染色质免疫沉淀(Ch IP)实验,实验结果发现YY2能够直接与phgdh启动子结合并抑制其转录活性。最后,通过免疫缺陷小鼠的肿瘤异种移植实验,我们证明YY2过表达抑制了HCT116细胞的体内成瘤潜能,而同时过表达phgdh后则能显著恢复HCT116细胞的体内成瘤潜能。这一实验结果表明YY2/phgdh信号轴在肿瘤抑制因子p53不存在的条件下对肿瘤细胞的体内成瘤能力具有显著的抑制作用。综上所述,本研究通过体内外及多种分子细胞生物学方法揭示了YY2可通过负调控丝氨酸代谢途径重要关键酶phgdh的转录活性从而抑制肿瘤细胞丝氨酸代谢,显著抑制肿瘤细胞增殖和体内成瘤能力的新调控机制。除此之外,本研究不仅将YY2与肿瘤细胞代谢中的氨基酸代谢调控联系起来,而且证明了YY2具有作为抗肿瘤治疗策略靶点的可能性。

关键词：结肠癌细胞丝氨酸代谢 YY2 phgdh p53

谷氨酰胺和phgdh对宫颈癌Hela细胞增殖的影响及其相关机制研究

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谷氨酰胺和PHGDH对宫颈癌Hela细胞增殖的影响及其相关机制研究

作者：马瑞肖中国医科大学

学位级别：硕士

目的:本研究旨在探讨谷氨酰胺(glutamine,Gln)缺乏对宫颈癌Hela细胞增殖、迁移和凋亡的影响及其相关机制;并进一步研究宫颈癌Hela细胞在谷氨酰胺缺乏的条件下,phgdh的表达情况及进一步沉默phgdh后对宫颈癌Hela细胞增殖的影响及其相关作... 详细信息

目的:本研究旨在探讨谷氨酰胺(glutamine,Gln)缺乏对宫颈癌Hela细胞增殖、迁移和凋亡的影响及其相关机制;并进一步研究宫颈癌Hela细胞在谷氨酰胺缺乏的条件下,phgdh的表达情况及进一步沉默phgdh后对宫颈癌Hela细胞增殖的影响及其相关作用机制。研究方法:1、应用CCK8方法检测在不同浓度(0/0.1/0.5/1/2/4mmol/L)Gln的条件下培养48h,检测Hela细胞的生长情况,继续培养48h后,再用CCK8方法检测各组细胞生长情况。2、应用细胞划痕实验观察在不同浓度(0/0.1/0.5/1/2/4mmol/L)Gln的培养条件下Hela细胞迁移能力变化情况。3、应用PE Annexin V Apoptosis Detection Kit I方法检测在不同浓度(0/0.1/0.5/1/2/4mmol/L)Gln的条件下培养48h后Hela细胞凋亡情况。4、应用流式细胞法检测在不同浓度(0/0.1/0.5/1/2/4mmol/L)Gln的条件下培养48h后Hela细胞内ROS水平。5、应用慢病毒转染RNA干扰技术抑制宫颈癌Hela细胞中phgdh的表达,构建phgdhsh RNA基因沉默细胞模型。荧光显微镜及Werstern blot检测转染效率及转染后细胞内phgdh的表达情况。6、应用CCK8方法检测Hela、Helavec和Helash-phgdh在不同浓度(0/0.1/0.5/1/2/4mmol/L)Gln的条件下培养48h和96h,检测各组细胞的生长情况。7、应用PE Annexin V Apoptosis Detection Kit I方法检测Hela、Helavec和Helash-phgdh细胞凋亡情况。8、应用Werstern blot方法检测在不同浓度(0/0.1/0.5/1/2/4mmol/L)Gln的条件下培养48h后Hela细胞内phgdh蛋白表达情况。9、应用流式细胞法检测在不同浓度(0mmol/L/4mmol/L)Gln的条件下培养48h后Hela、Helavec和Helash-phgdh细胞内ROS的情况。10、用GSH/GSSGTM Assay(premega公司)试剂盒检测Hela和Helash-phgdh在不同浓度(0mmol/L/4mmol/L)Gln的条件下培养48h后细胞内GSH/GSSG比值。11、用Total NADP and NADPH Assay试剂盒(Abcom公司)检测在不同浓度(0/0.1/0.5/1/2/4mmol/L)Gln的条件下培养48h后Hela细胞内NADP/NADPH比值变化情况,以及Hela、Helavec和Helash-phgdh细胞内NADP/NADPH比值。结果:1、在谷氨酰胺缺乏的条件下,Hela细胞的生长受到抑制(Pphgdh组细胞的生长抑制率明显比Helavec组和Hela组升高(Pphgdh后进一步抑制宫颈癌Hela细胞生长,继续培养48h后,进一步抑制细胞生长。7、Helash-phgdh组明显比Hela组和Helavec组细胞凋亡数目多(Pphgdh蛋白表达量明显升高(Pphgdh组在4/0mmol/LGln条件下培养后细胞内ROS水平明显高于Helavec组和Hela组(Pphgdh/4mmol/L Gln组和Hela-sh phgdh/0mmol/L Gln组细胞内GSH/GSSG比值分别为46.87±1.25、13.59±1.83、10.99±0.75、3.50±2.57,且差异具有统计学意义(P<0.05)。11、在Gln<2mmol/L时,Hela组细胞内NADP

关键词：宫颈癌Hela细胞谷氨酰胺 phgdh 细胞增殖迁移凋亡氧化还原状态

Serine metabolism orchestrates macrophage polarization by regulating the IGF1–p38 axis

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Cellular & Molecular Immunology 2022年第11期19卷 1263-1278页

作者： Xiao Shan Penghui Hu Lina Ni Long Shen Yanan Zhang Zemin Ji Yan Cui Meihua Guo Haoan Wang Liyuan Ran Kun Yang Ting Wang Lei Wang Bin Chen Zhi Yao Vingjie Wu Qiujing Yu Tianjin Institute of Immunology Key Laboratory of Immune Microenvironment and Disease of the Ministry of EducationThe Province and Ministry Co-sponsored Collaborative Innovation Center for Medical EpigeneticsTianjin Key Laboratory of Inflammation BiologyDepartment of ImmunologySchool of Basic Medical SciencesTianjin Medical University Division of Infectious Disease Second Hospital of Tianjin Medical UniversityTianjin300070China Institute for Genome Engineered Animal Models of Human Diseases National Center of Genetically Engineered Animal Models for International ResearchDalian Medical UniversityDalian116044LiaoningChina Shandong Provincial Hospital School of Laboratory Animal and Shandong Laboratory Animal CenterScience and Technology Innovation CenterShandong First Medical University and Shandong Academy of Medical SciencesJinan250021ShandongChina The Province and Ministry Co-sponsored Collaborative Innovation Center for Medical Epigenetics Department of Pharmacology and Tianjin Key Laboratory of Inflammation BiologySchool of Basic Medical SciencesTianjin Medical UniversityTianjin300070China Tianjin Institute of Immunology Key Laboratory of Immune Microenvironment and Disease of the Ministry of EducationDepartment of ImmunologySchool of Basic Medical SciencesTianjin Medical UniversityTianjinChina Department of Molecular Pathobiology New York University College of DentistryNew YorkNY10010USA

Serine metabolism is reportedly involved in immune cell functions, but whether and how serine metabolism regulates macrophage polarization remain largely unknown. Here, we show that suppressing serine metabolism, either by inhibiting the activity of the key enzyme phosphoglycerate dehydrogenase in the serine biosynthesis pathway or by exogenous serine and glycine restriction, robustly enhances the polarization of interferon-γ-activated macrophages (M(IFN-γ)) but suppresses that of interleukin-4-activated macrophages (M(IL-4)) both in vitro and in vivo. Mechanistically, serine metabolism deficiency increases the expression of IGF1 by reducing the promoter abundance of S-adenosyl methionine-dependent histone H3 lysine 27 trimethylation. IGF1 then activates the p38-dependent JAK–STAT1 axis to promote M(IFN-γ) polarization and suppress STAT6-mediated M(IL-4) activation. This study reveals a new mechanism by which serine metabolism orchestrates macrophage polarization and suggests the manipulation of serine metabolism as a therapeutic strategy for macrophage-mediated immune diseases.

关键词： Serine metabolism phgdh Macrophage polarization SAM IGF1 p38