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产胞内pha的芽孢杆菌的发酵工艺及基因组学研究

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产胞内PHA的芽孢杆菌的发酵工艺及基因组学研究

作者：顾进进石河子大学

学位级别：硕士

由于环境问题,例如因大气污染而导致的全球变暖,地球二氧化碳积聚和化石的性质有限,资源短缺变得严重,以微生物合成的可降解高分子材料逐步成为科研人员研究的热点。作为可再生生物质聚合物,聚羟基脂肪酸酯(pha)是一类典型的可完全降解... 详细信息

由于环境问题,例如因大气污染而导致的全球变暖,地球二氧化碳积聚和化石的性质有限,资源短缺变得严重,以微生物合成的可降解高分子材料逐步成为科研人员研究的热点。作为可再生生物质聚合物,聚羟基脂肪酸酯(pha)是一类典型的可完全降解的生物聚酯材料。因其具有良好的生物特性和良好的理化性能,pha被认为是最具竞争力并且可替代部分经典石油基的塑料,还具有可持续发展意义的新型生物聚酯材料。但是限制pha使用的因素是pha生产成本高,pha产率低,尤其是在芽孢杆菌中更为明显。到目前为止,pha的主要生产方法依然是微生物发酵,如何优化培养基从而降低生产成本和提高产率是科研人员需要解决的问题。研究表明,微生物合成pha的组分及含量与底物密切相关,本论文中优化底物进行发酵,从而降低了生产成本。pha合酶(phaC)是pha生产过程中的关键酶,决定着pha的产率。据报道,烯酰辅酶A水合酶(Enoyl-CoA hydratase)是生物合成过程中脂肪酸β-氧化途径的关键酶,通过改造pha合酶和烯酰辅酶A提高pha产率理论上是可行的。基因工程是目前合酶改造过程中应用最多的技术,本论文中,其主要是在分子层面上来改变相关酶,以期能够提高合酶的催化活性。本论文主要研究内容及结果如下:1.本研究中确定的细菌16S rDNA基因序列已经存入GenBank(NCBI),登录号为MSBQ00000000。通过与NCBI已知序列对比分析,用MEGA软件做系统发育树分析结果得到PJC48菌株属于芽孢杆菌属。本研究通过GC-MS和NMR对pha聚合物的化学成分进行了分析,结果表明聚合物的单体是3-羟基戊酸。2.通过单因素和响应面实验,对培养基及培养条件进行了优化,从而找到了最佳碳氮比为6:1,最佳温度为30°C。培养48h后,最终使得pha产量为1.64 g/L,产率比优化前提高了32.75%。3.对菌株PJC48进行物理和化学诱变,分别得到了菌株UV-60-8和EMS-60-3。化学诱变虽然传代性状有明显恢复,但传至第六代发酵得到的细胞干重较原菌株提高了123.5%,pha产量提高了90%。通过对pha合酶进行过表达,pha合成过程中非关键酶(烯酰辅酶A水合酶)敲除,最终使得pha合成产量提高。本论文通过pha合成菌的筛选诱变选育、条件优化及基因改造等研究,结果表明PJC48是一株高产pha的菌株,为深入挖掘pha在微生物中合成的代谢机理研究提供参考,为pha在不同菌种的商业化提供可能。

关键词：聚羟基脂肪酸酯烯酰辅酶A水合酶 pha合酶紫外诱变基因工程

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pha合成菌筛选、鉴定及其合成特性研究

PHA合成菌筛选、鉴定及其合成特性研究

作者：李庆辉长春理工大学

学位级别：硕士

塑料制品造成的白色污染和石油等不可再生资源价格的上涨导致了非石油生产且可替代传统化学合成高分子材料的开发方兴未艾。微生物合成的生物聚酯(pha)因具有类似传统合成高聚物的材料性质作为其替代品广受关注。但因其微生物合成菌合... 详细信息

塑料制品造成的白色污染和石油等不可再生资源价格的上涨导致了非石油生产且可替代传统化学合成高分子材料的开发方兴未艾。微生物合成的生物聚酯(pha)因具有类似传统合成高聚物的材料性质作为其替代品广受关注。但因其微生物合成菌合成量有限、合成成本较高及单体结构单一等原因使得pha并不能被广泛应用。本文从93号豆油生产线周边油污中成功地筛选出一株聚羟基脂肪酸生产菌,通过16S rR NA序列测定及系统发育进化树分析,确定该菌株为铜绿假单胞菌,并命名为Pseudo monas aeruginosa93-3-1(NCBI登录号为MH426701)。培养条件优化结果表明,该菌株在37℃,pH 7.0,含有2%(w/v)豆油和1%(w/v)硝酸钾的无机盐培养基中,能够合成含有3-羟基辛酸(3HO)、3-羟基癸酸(3HD)和3-羟基十二烷酸(3HDD)的中长链混合聚酯。并且该菌株在优化培养条件下,能够利用含有3%(w/v)废弃食用油作为碳源的无机盐培养基可合成0.15g/L含有3HO、3HD的混合聚酯。为了分析该菌株的pha聚合酶所属类型和合成途径,我们测定了该菌株的基因组成。其基因测序结果表明,该菌株pha合成基因座与其它Pseudomonas sp.菌属的pha合成菌类似的II类pha合成酶,由1680bp(phaC1),858bp(phaZ)和1683bp(phaC2)组成,与Pseudomonas ***4502、Pseudomonas putida和Pseudomonas sp.61-3有70%以上的高碱基同源性,该菌株利用脂肪酸的β-氧化途径合成中长链的脂肪酸共聚酯。本研究不仅丰富了pha合成菌的种类,而且在利用廉价碳源降低生物聚酯的合成成本以及废弃食用油再利用获得高附加值产品方面具有重要的参考价值。

关键词：聚羟基脂肪酸酯菌株筛选铜绿假单胞菌 pha合酶

基于hadA和phaC1Pa93（STQK）的pha合成基因工程菌构建及合成产物分析

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基于hadA和phaC1Pa93（STQK）的PHA合成基因工程菌构建及合成产物...

作者：王明长春理工大学

学位级别：硕士

聚羟基脂肪酸酯（Polyhydroxyalkanoates,phas）是一种由亲盐古菌和多种细菌合成,可以从植物生物量、油、糖甚至二氧化碳等可再生资源中生产的生物基塑料,具有生物相容性和可生物降解性。一些细菌如Pseudomonas savastanoi和Pseudomonas... 详细信息

聚羟基脂肪酸酯（Polyhydroxyalkanoates,phas）是一种由亲盐古菌和多种细菌合成,可以从植物生物量、油、糖甚至二氧化碳等可再生资源中生产的生物基塑料,具有生物相容性和可生物降解性。一些细菌如Pseudomonas savastanoi和Pseudomonas putida在含有正苯链烷酸作为碳源的培养基中可以合成芳香族聚酯作为石油衍生的芳香族聚合物如聚氯乙烯（Polyvinylchloride,PVC）和聚苯乙烯（Polystyrene,PS）的替代品应用前景广泛。因此通过基因工程手段构建具有合成与石油基PET或PS性质类似的含苯环pha基因工程菌研究引人瞩目。本研究选择来源于Clostridium diffcile的具有催化苯环脂肪酸底物形成聚合前体的2-羟基异己酸Co A-转移酶Had A作为前体供给酶,选择来源于Pseudomonas aeruginosa 93-3-1的pha合酶pha C1及其突变体pha C1用于pha聚合。根据两类酶的底物特异性分析,基于设计的pha合成途径,构建以大肠杆菌为宿主含有重组质粒p QE-80L-had A-pha C1/pha C1或p ACYCDute1-pha C1/pha C1-had A的工程菌株,利用葡萄糖和含苯环的脂肪酸作为碳源培养基因工程菌,探讨其合成pha的能力和结构。首先,利用体外重组技术过表达并提纯了HadA和phaC1及其突变体pha C1并分析了其活性和底物特异性。将扩增的基因片段分别与载体连接构建重组质粒转导入宿主获得三个重组菌BL21-p ColdⅡ-had A、BL21-p QE-80L-pha C1和BL21-p QE-80L-pha C1。体外大量培养重组菌表达目的蛋白并利用6His标签并纯化,获得蛋白浓度分别为Had A（15.8 mg/m L）、pha C1（3.8mg/m L）和pha C1（5.4 mg/m L）。三个蛋白的底物特异性分析结果表明,Had A对（R）-3HB、4HBZ、HPBA和（R）-MA酶活性为0.1264±0.0011 U/mg、0.1193±0.0019 U/mg、0.1595±0.0003 U/mg和0.1287±0.0023 U/mg;pha C1仅对（R）-3HBCoA有活性,其酶比活力为0.1400±0.0002 U/mg;phaC1对（R）-3HBCo A、4HBZCo A、HPBACo A和（R）-MACo A酶活性为0.1371±0.0009 U/mg、0.1266±0.0012U/mg、0.0980±0.0011 U/mg和0.1548±0.0019 U/mg。其次,分别使用pQE-80L和pACYCDute-1两种质粒,构建含HadA和pha C1/pha C1的共表达载体,并在蛋白表达水平检测其表达情况。通过分子生物学手段,构建含had A和pha C1/pha C1的重组质粒p QEHC、p QEHSTQK、p ACH和p ASTQKH,基因工程菌培养后菌液蛋白质表达检测结果表明,基于p ACYCDute-1构建的共表达载体p AC/STQKH在氮限制的条件下,Had A和pha C1/pha C1蛋白能自主、稳定的同时表达。将其分别转导DH5α和XL-Blue得到稳定表达两种目的蛋白的基因工程菌DHp QEHC、DHp QEHSTQK、DHp ASTQKH和XLp ASTQKH。最后,对基因工程菌DHpACH和DHpASTQKH培养,利用H-NMR分析合成产物的结构;并对DHp ASTQKH进行培养条件优化。DHp ACH在仅添加2%葡萄糖和额外添加（R）-3HB的条件下,合成产物的H-NMR结果显示,均在5.3 ppm、2.6ppm和1.3 ppm处有特征峰,推测为PHB;DHp ASTQKH在仅添加2%葡萄糖、额外添加（R）-3HB和（R）-MA时,合成产物的H-NMR结果显示,仅在5.3 ppm、2.6 ppm和1.3 ppm处有特征峰,推测为PHB,而额外添加4HBZ或HPBA时,合成产物的H-NMR结果显示,均在0.75 ppm、1.36 ppm、1.65 ppm、2.6 ppm、5.2 ppm和5.3ppm都有特征峰,推测产物为PHBV。对DHp ASTQKH进行培养条件优化,以4m M HPBA或6 m M 4 HBZ为底物,在p H=8,额外添加4 g/L乙酸钠溶液,于LB培养基中,使用XLpASTQKH菌株培养可获得最大的CDW和pha产量。

关键词：聚羟基脂肪酸酯大肠杆菌多基因共转化 CoA转移酶 pha合酶代谢工程

假单胞菌利用生物柴油副产物甘油合成pha研究

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假单胞菌利用生物柴油副产物甘油合成PHA研究

作者：胡静辽宁大学

学位级别：硕士

近年来,石油危机、能源紧缺的问题日益严峻,世界各国正积极研发太阳能、风能、水能、生物质能等可再生的替代能源。生物柴油作为一种极有前景的可再生能源,受到全世界学术界和产业界的普遍关注。然而,生物柴油在生产过程中会产生大量的... 详细信息

近年来,石油危机、能源紧缺的问题日益严峻,世界各国正积极研发太阳能、风能、水能、生物质能等可再生的替代能源。生物柴油作为一种极有前景的可再生能源,受到全世界学术界和产业界的普遍关注。然而,生物柴油在生产过程中会产生大量的副产物（以甘油为主）。根据美国国家生物柴油协会的信息,预计2020年全球生物柴油市场将达1200万吨。副产物过度积累会带来废水、废气等环境污染的问题及对传统甘油市场的巨大冲击。如何利用新工艺和新技术加工处理生物柴油副产物,研究和开发高附加值新产品,成为生物柴油产业可持续发展的关键和保障。聚羟基脂肪酸酯（Polyhydroxyalkanoates, phas）是许多微生物在C、N源失衡条件下,作为胞内碳源和能源储存物而大量积累产生的高分子聚合物,具有良好的热可塑性、生物相容性和可降解性,被广泛应用在环境友好型材料、组织工程、药物可控缓释载体等各个方面。利用微生物合成具有高附加值生物材料pha是当前的研究热点。然而pha合成过程中原料成本居高不下一直制约其发展。假单胞菌是pha生产的优良菌株,可利用不同碳源为原料合成pha,生物柴油副产物是非常好且便宜的pha合成的原料。以生物柴油副产物为原料合成pha,对于解决生物柴油副产物过度积累的问题具有重要意义。本研究利用本实验室筛选得到的假单胞菌Pseudomonas oleovorans ZJ03为出发菌株,利用紫外诱变结合Nile Red随机定向筛选可利用甘油的高产pha菌株,并通过气相色谱法（GC）进一步分析确认。本研究还利用基因工程手段从不同的假单胞菌中克隆到了I型和II型pha合酶基因,将其通过接合转化转入到Ralstonia eutropha PHB-4合酶缺失突变株中分析确认功能。具体研究结果如下: 1)本研究为解决pha产率低的问题,以P. oleovorans ZJ03为出发菌株,利用紫外随机诱变、定向筛选,根据紫外光下Nile Red荧光强度与假单胞菌pha产量成正比的原理结合气相色谱法筛选可利用甘油的高产pha假单胞菌突变株。共进行了两次诱变,第一次诱变之后,转菌过程可能受人为因素的影响,生长缓慢,荧光强度对比效果不是很好,得到了三株菌,其中A1为正向突变,A3、A8为负突变,其pha含量分别为34.29%、10.98%和13.67%,与野生型比较提高的较少。第二次诱变采用直接涂布于选择培养基中培养,在紫外光下挑取荧光强度较高的菌株培养,得到的pha含量从24.59%提高到44.67%,得到pha产量突变株,但在平行性和稳定性上稍差,在下一步工作中进一步优化条件以期得到稳定高产pha突变株。 2)I型pha合酶基因的克隆:通过I型合酶基因序列比对分析,该基因具有高度保守性。从而设计引物利用PCR技术,从P. oleovorans ZJ03基因组中克隆pha合酶基因,将基因亚克隆到表达载体pBBR1MCS2中,通过化学转化的方法转化到Escherichia coli S17-1中,经酶切验证及测序结果比对,得到I型合酶基因。以E. coli S17-1为供体菌,Ralstonia eutropha PHB-4为受体菌,经接合转化将表达载体转化到R. eutropha PHB-4合酶缺失突变株中,通过重组菌的发酵并结合GC分析确认基因的功能。研究结果表明,重组菌可利用果糖、葡萄糖酸钠产生PHB,其含量分别73.88±3.80%和63.09±1.18%,证明基因的功能。 3)II型pha合酶基因的克隆:通过II型合酶基因序列比对分析,该基因具有高度保守性。从而设计引物利用PCR技术,从Pseudomonas corrugata YF388基因组中克隆pha合酶基因,将基因亚克隆到表达载体pBBR1MCS2中,通过化学转化的方法转化到E. coli S17-1中,经酶切验证及测序结果比对,得到II型合酶基因。以E. coli S17-1为供体菌,R. eutropha PHB-4为受体菌,经接合转化将表达载体转化到R. eutropha PHB-4合酶缺失突变株中。经测序结果比对及酶切验证,表达质粒构建成功,为进一步验证其功能提供理论基础。综上所述,本研究成功获得高产pha假单胞菌,且克隆I型和II型合酶基因,构建表达载体,并在宿主菌R. eutropha PHB-4中确认分析功能,为今后利用定点突变技术和嵌合酶构建技术扩大合酶的底物范围及改变pha单体组成的可能性提供理论基础。

关键词：生物柴油副产物甘油聚羟基脂肪酸酯紫外诱变 pha合酶

类产碱假单胞菌YS1 BAC文库的筛选及转基因烟草植株遗传稳定性分析

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类产碱假单胞菌YS1 BAC文库的筛选及转基因烟草植株遗传稳定性分析

作者：马超华南热带农业大学

学位级别：硕士

聚羟基脂肪酸酯(Polyhydroxyalkanoates,phas),一种由微生物合成的聚酯,由于具有生物降解性、生物相容性等优良性能,而在众多领域,如农业、医药、高分子材料、组织工程、环保和包装材料等方面得到广泛应用。在pha的合成途径中,pha合成... 详细信息

聚羟基脂肪酸酯(Polyhydroxyalkanoates,phas),一种由微生物合成的聚酯,由于具有生物降解性、生物相容性等优良性能,而在众多领域,如农业、医药、高分子材料、组织工程、环保和包装材料等方面得到广泛应用。在pha的合成途径中,pha合成酶是最关键的酶,对pha的组成和分子量等性质具有决定性的作用。到目前为止,已经在超过45种细菌中克隆得到了超过59个pha合成酶基因。类产碱假单胞菌YS1(*** YS1)是一株能合成含短链与中链单体pha的菌株。本研究通过设计PHB合成酶部分基因特异引物,以菌株*** YS1基因组DNA为模板,PCR扩增出一段与Alcaligenes eutrophus PHB合成酶基因phbCj有99%的同源性片段。以PCR产物与Pseudomonas sp.61-3 phbC下游序列中的寡聚核苷酸片段作为共同筛选 *** YS1 BAC文库的探针,通过斑点杂交初筛,Southern杂交验证,利用亚克隆技术得到外源片段大小为5kb左右的阳性克隆子pH22-E5。本课题另一部分工作是检测转pha合酶基因烟草的遗传稳定性。以已获得的两株转pha合成酶phaC1、phaC2双价基因的烟草及其后代为材料,通过对这株转基因烟草各后代进行PCR、PCR-Southern检测,初步确定*** YS1 pha合成酶phaC1、phaC2双价基因能在转基因植株的后代中稳定地遗传,利用卡那霉素抗性大田直接筛选、Southern blot等方法对阳性植株作了进一步检测。用氯仿-次氯酸钠对74株PCR-Southern检测为阳性的转化植株中进行phas抽提,有61株中得到目的产物。所转化的烟草在产物合成水平上转化率为67.7%。

关键词：假单胞菌YS1 BAC文库 pha合酶杂交筛选转基因烟草遗传稳定性

工程谷氨酸棒状杆菌提高纤维素聚3-羟基丁酸酯产量的研究

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工程谷氨酸棒状杆菌提高纤维素聚3-羟基丁酸酯产量的研究

作者：李静华东理工大学

学位级别：硕士

聚3-羟基丁酸酯（Poly 3-hydroxybutyrate,PHB）是一类可以由微生物全合成的高分子聚酯,具有与石油基塑料相似的物理性质和热加工性能以及生物可降解性。PHB可以生物质资源进行发酵生产,但其昂贵的生产成本是产业化大规模生产PHB的最大... 详细信息

聚3-羟基丁酸酯（Poly 3-hydroxybutyrate,PHB）是一类可以由微生物全合成的高分子聚酯,具有与石油基塑料相似的物理性质和热加工性能以及生物可降解性。PHB可以生物质资源进行发酵生产,但其昂贵的生产成本是产业化大规模生产PHB的最大障碍。PHB生产大多以淀粉和糖类物质作为原料,其成本占总生产成本的30%-40%以上,因此降低PHB的原料成本十分重要。木质纤维素具有来源广泛、价格低廉和可再生的优势,并且不存在“与人争粮”的问题,是未来工业化生产PHB的最具应用潜力的原料。前期工作以高抗逆性Corynebacterium glutamicum S9114为出发菌株,将PHB合成相关基因和木糖代谢、转运相关基因整合到基因组上,获得了一株能够利用葡萄糖和木糖稳定合成PHB的*** JH02菌株。本论文的研究目的是在*** JH02基础上通过分子生物学改造和探究谷氨酸棒状杆菌合成PHB的最适NH4+添加量进一步提高重组谷氨酸棒状杆菌合成PHB的能力,并且将获得的重组菌株在麦秆水解液中检验其生产PHB的能力。具体研究内容包括:（1）细胞形态工程改造增大细胞体积,从而提供PHB在胞内积累的潜力;（2）膜定位表达pha合酶,提高pha合酶的稳定性以及缩短pha合酶参与聚合反应的空间距离;（3）引入phaP基因,缩小PHB颗粒的粒径起到保护菌体的作用;（4）增加乙酰辅酶A流入PHB合成路径的代谢通量;（5）探究氨氮水平（NH4+）对***合成PHB的影响;（6）适应性进化提高***对木质纤维素中木糖的利用能力。第一部分是通过分子生物学改造来提高*** JH02合成PHB的能力。为了增大细胞体积,为PHB的积累提供更多的空间,通过过表达细胞形态相关的pknB和WhcD基因分别使细胞干重增加了 1.0倍和1.1倍,促进了谷氨酸棒状杆菌细胞生长,最终PHB的产量分别提高了 177.0%和163.0%。为了提高pha合酶的稳定性,缩短pha合酶参与聚合反应的空间距离,将pha合酶定位在细胞膜上,获得的两株重组菌株JH02-Peftu-（Ncgl）phaC 和 JH02-Peftu-（porB）phaC使胞内 PHB 含量显著提高 70.1%,140.6%,使细胞干重增加1倍左右,最终两株重组菌的PHB产量分别提高195.0%和310.6%。第二部分是探究了氨氮对***合成PHB的影响。通过浓度梯度实验确定当NH4+添加浓度为45 g/L时,*** JH02获得最高的PHB产量。RT-qPCR实验表明当添加合适的NH4+浓度时,EMP途径、TCA循环和PHB合成路径的相关基因转录水平都明显上调,这证明氨氮的添加不仅能促进细胞生长,更重要的是能有效促进PHB合成相关基因的表达,从而促进胞内PHB的积累。第三部分是检验重组菌株在麦秆水解液中合成PHB的能力,以及通过适应性进化提高***对木质纤维素中木糖的利用速率。通过膜定位表达pha合酶获得的重组菌株JH02-Peftu-（Ncgl）phaC在30%固含量里的麦杆水解液中经过补料批发酵,最终获得了 16.2 g/L的PHB产量。***木糖利用能力的适应性进化实验表明,对于非天然的PHB生产菌株,适应性进化不利于胞内合成PHB。本论文获得的重组菌株*** JH02-Peftu-（Ncgl）phaC在合适的NH4+浓度下利用木质纤维素合成PHB的能力显著提升,胞内PHB含量最高可以达到39.3 wt%,PHB产量最高可以达到16.2 g/L,与对照菌株*** JH02相比,胞内PHB含量提高了 134.8%,PHB产量提高了 57.3%。本论文获得的工程菌株实现了利用真实木质纤维素体系生产PHB的最高指标,为接下来木质纤维素生产PHB的工业化应用提供了一株有潜力的候选菌株。

关键词：谷氨酸棒状杆菌木质纤维素 PHB pha合酶 NH4+

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聚3-羟基丙酸重组菌构建及代谢调控

聚3-羟基丙酸重组菌构建及代谢调控

作者：范如婷北京化工大学

学位级别：硕士

聚3-羟基丙酸(P3HP)是一种极具开发前景的聚羟基脂肪酸(pha)。P3HP作为新型高分子生物材料,其不仅具有良好的生物兼容性、可降解性和较高刚性,还具较好延展性和拉伸性能等,被视为塑料最佳替代品。目前,自然界中尚未发现能够天然合成P3H... 详细信息

聚3-羟基丙酸(P3HP)是一种极具开发前景的聚羟基脂肪酸(pha)。P3HP作为新型高分子生物材料,其不仅具有良好的生物兼容性、可降解性和较高刚性,还具较好延展性和拉伸性能等,被视为塑料最佳替代品。目前,自然界中尚未发现能够天然合成P3HP的微生物,且P3HP化学合成存在很大局限性,因此,利用微生物法生产P3HP尤为迫切。本课题选取肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniaeMGH78578)为宿主,甘油为底物,通过甘油脱水酶(DhaB)、辅酶A依赖的丙醛脱氢酶(PduP)和pha合酶(phaC)的催化完成P3HP的积累。研究以下内容：1、成功克隆了来源于罗尔斯通氏菌(Ralstonia eutropha H16)的phaCl和来源于集胞藻(Synechocystis sp. PCC6803)的phbC,构建了两株重组菌K. p(pET-pk-phaCl)和K. p(pET-pk-phbC),发酵检测两重组菌中并无可测P3HP产生,推测可能由于P3HP前体物不足导致,需要强化前体物浓度。2、克隆来源于K. pneumoniae和鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella enterica serovar Typhimurium LT2)辅酶A依赖的丙醛脱氢酶基因(pduPxp与pduPse)并在K. pneumoniae中表达,发现PduPse能够高效表达,其酶活为2.03 U/mg,相比于对照菌(K. pneumoniae与K.p(pET-pk))分别提高了7.58倍和5.31倍。pduPSe基因超表达对宿主菌生长、甘油消耗以及代谢流量产生了影响。重组菌K. p(pET-pk-pduPSe)能高效转化有害中间产物3-羟基丙醛,使得生物量的提高;且能够重排碳代谢流。3、构建了P3HP重组菌株K. p(pET-pk-pduPSe-phaC1)和K.p(pET-pk-pduPSe-phbC),研究PduP和pha合酶串联表达重组菌P3HP的积累。结果表明,pduPSe与phaC1串联表达未明显增加宿主菌生长负荷,而不同来源的pha合酶基因对宿主菌生物量影响具有差异。重组菌K. p(pET-pk-pduPSe-phaC1)代谢甘油速率较平稳,24 h时甘油剩余量为14.26 g/L,与对照菌比甘油消耗速率能力有所降低;重组菌K. p(pET-pk-pduPSe-phbC) 24 h时甘油剩余量为18.89 g/L,其甘油代谢能力低于重组菌K. p(pET-pk-pduPSe-phaC1)。4、为探究代谢流分向对P3HP合成的影响,构建了dhaT基因敲除的重组重组菌株K. p(pET-pk-pduPSe-phaC1-ΔdhaT)和K.p(pET-pk-pduPSe-phbC-ΔdhaT)。结果表明,该重组菌株生长减慢,甘油消耗速率大幅降低,表明dhaT敲除后并没有消除1,3-丙二醇代谢途径对P3HP合成的影响,反而干扰了甘油代谢网络。该改造策略不利于P3HP积累。成功用tac启动子替换原载体中pk启动子,构建重组菌K. p(pET-tac-pduPSe-phaC1)和K. p(pET-tac-pduPSe-phbC),经分析,tac启动子可使PduPSe与phaC1蛋白均得以成功表达。

关键词：聚3-羟基丙酸肺炎克雷伯氏菌甘油 pha合酶丙醛脱氢酶

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SOE-PCR法构建新型pha嵌合酶研究

辽宁大学学报（自然科学版） 2021年第3期48卷 277-282页

作者：赵小慧张卉妍胡风庆辽宁省经济作物研究所辽宁辽阳111000 辽宁大学轻型产业学院辽宁沈阳110036

聚羟基脂肪酸酯(Polyhydroxyalkanonate,pha)合酶是pha合成过程中的关键酶,其活性和底物特异性决定pha含量和单体组成.构建嵌合酶是改变pha单体组成的一种有效方式.利用重叠延伸PCR(gene splicing by overlap extension,SOE-PCR)法,以... 详细信息

聚羟基脂肪酸酯(Polyhydroxyalkanonate,pha)合酶是pha合成过程中的关键酶,其活性和底物特异性决定pha含量和单体组成.构建嵌合酶是改变pha单体组成的一种有效方式.利用重叠延伸PCR(gene splicing by overlap extension,SOE-PCR)法,以富氧产碱菌和嗜水气单胞菌pha合酶基因为亲本构建新的pha嵌合酶.结果表明,带有新型嵌合酶基因的重组菌株AHRE可利用葡萄糖酸钠和果糖产生3HB.利用辛酸钠、月桂酸、油酸、辛酸钠和葡萄糖酸钠混合碳源,除3HB和3HHx外,还产生了新的单体组分3HO.辛酸钠和葡萄糖酸钠混合碳源发酵,pha含量最高,达57.54%.辛酸钠为单一碳源时,3HO单体组成含量最高,占pha总量1.932%,证明嵌合酶构建成功.这为今后利用基因工程技术改变菌株pha单体组成提供了有效方法,为获得具有更好材料学特性的pha奠定了工作基础.

关键词：聚羟基饱和脂肪酸酯(pha) pha合酶嵌合酶