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Simultaneous Detection of Three Arboviruses Using a Triplex RT-PCR Enzyme Hybridization Assay

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Virologica Sinica 2012年第3期27卷 179-186页

作者： DanDong Shi—hongFu Li-huaWang ZhiLv Tai-yuanLi Guo.dongLiang PreventionofVeterinaryMedicineDepartment CollegeofAgricultureYanbianUniversityYanji13300~China StateKeyLaboratoryforInfectiousDiseasePreventionandControlInstituteforViralDiseaseControlandPrevention ChineseCenterforDiseaseControlandPreventionBeo'ing102206China

Arboviruses represent a serious problem to public health and agriculture worldwide. Fast, accurate identification of the viral agents of arbovirus-associated disease is essential for epidemiological surveillance and laboratory investigation. We developed a cost-effective, rapid, and highly sensitive one-step "triplex RT-PCR enzyme hybridization" assay for simultaneous detections of Japanese Encephallitis virus (JEV, Flaviviridae), Getah virus (GETV, Togaviridae), and Tahyna virus (TAHV, Bunyaviridae) using three pairs of primers to amplify three target sequences in one RT-PCR reaction. The analytical sensitivity of this assay was 1 pfu/mL for JEV, 10 pfu/mL for GETV, and 10 pfu/mL for TAHV. This assay is significantly more rapid and less expensive than the traditional serological detection and single RT-PCR reaction methods. When "triplex RT-PCR enzyme hybridization" was applied to 29 cerebrospinal fluid (CSF) samples that were JEV-positive by normal RT-PCR assay, all samples were strongly positive for JEV, but negative for GETV and TAHV, demonstrating a good sensitivity, specificity, and performance at CSF specimen detection.

关键词： RT-PCR技术同时检测 RT-PCR反应 RT-PCR检测虫媒病毒流行病学监测血清学检测 pfu

Molecular cloning and expression of pfu DNA polymerase gene and its application in long-distance PCR

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Chinese Science Bulletin 1998年第10期43卷 863-867页

作者： Bing Li Cheng Gu Jindong Zhao Peking Univ Coll Life Sci Beijing 100871 Peoples R China

A 2.3 kb DNA fragment containing pfu DNA polA gene was amplified by PCR from total DNA of Pyrococcus furiosus and cloned into a pGEM-T vector. The recombinant clone pT-pfu was digested with Nco I and Xho I and the fragment was inserted into an expression vector pET3d-X. The pfu polA gene was expressed in Escherichia coli BL21 (DE3). The gene product (pfu) was purified with heat denaturation, polyethylenemine (PEI) precipitation and Bio-rex 70 ion-exchange chromatography. The recombinant pfu was verified by protein N-terminal sequencing. With the recombinant pfu, large λ DNA fragments were successfully amplified in long-distance PCR.

关键词： pfu enzyme expression long-distance PCR.

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主编导读

生物工程学报 2022年第2期38卷 407-410页

作者：作者不详机构不详

热稳定性高、耐盐性能好、扩增速率高、保真度高的DNA聚合酶在PCR反应中具有广泛的用途。翁妍等[1]从超嗜热古菌(Thermococcus eurythermalis)中克隆了一个B家族DNA聚合酶,命名为Teu-PolB DNA聚合酶。该DNA聚合酶的扩增速率和保真度优于... 详细信息

热稳定性高、耐盐性能好、扩增速率高、保真度高的DNA聚合酶在PCR反应中具有广泛的用途。翁妍等[1]从超嗜热古菌(Thermococcus eurythermalis)中克隆了一个B家族DNA聚合酶,命名为Teu-PolB DNA聚合酶。该DNA聚合酶的扩增速率和保真度优于Taq和pfu DNA聚合酶。扩增产量略高于pfu DNA聚合酶,但弱于商品化Taq DNA聚合酶,在高保真DNA片段扩增中具有一定的应用前景。

关键词： DNA聚合酶超嗜热古菌 pfu PCR反应保真度 Taq DNA片段高保真

FIARE ACTIVITY AND EVOLUTION WITHIN AR5629

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天文研究与技术 1990年第4期 160-168页

作者： Hou ShumingYunnan Observatory, Chinese Academy of Sciences, Kunming, 650011, China

The middle ten days of August,1989 was one of the peak times of solar activity.During the period the solar indices such as 10cm radio flux,relative sunspot number,spot area,X—ray flux,proton fluence and electron flue... 详细信息

关键词： proton neutral longitudinal indices geophysical pfu northwest lives storm begin

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高效氯氰菊酯对原生动物群落的毒性研究

中国环境科学 2005年第B6期25卷 115-117页

作者：刘国光王莉霞徐海娟郑立庆河南师范大学环境与科学学院河南省高等学校环境科学与工程重点学科开放实验室

以原生动物群落为靶生物,对高效氯氰菊酯的毒性进行了试验研究.结果表明,48h急性毒性的半数致死浓度为2.04mg/L.在试验浓度范围内,食菌和碎屑者鞭毛虫类具有较高的耐受性,随着高效氯氰菊酯浓度的增加,其在群落中的优势度更加明显.

关键词： pfu 毒性试验高效氯氰菊酯原生动物群落

pfu微型生物群落监测中异养性指数的应用研究及其分形分析

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环境科学学报 2004年第4期24卷 678-683页

作者：冯伟松沈韫芬中国科学院水生生物研究所武汉430072

对常德和汉江的异养性指数(HI)进行了分形分析,表明异养性指数在二维空间分布具有自相似性.异养性指数数据点与化学综合污染指数(P)数据点在双对数坐标中分段拟合时,当常德和汉江的LogP分别小于0 602和0 493时,常德和汉江的分形维数分别... 详细信息

对常德和汉江的异养性指数(HI)进行了分形分析,表明异养性指数在二维空间分布具有自相似性.异养性指数数据点与化学综合污染指数(P)数据点在双对数坐标中分段拟合时,当常德和汉江的LogP分别小于0 602和0 493时,常德和汉江的分形维数分别为0 39332和0 74110;当常德和汉江的LogP大于0 602和0 493时,常德和汉江的分形维数分别为0 30678和0 27239.拐点的出现表明异养性指数的变化在两个尺度域内遵从着不同的规律.拐点尺度以前,分维数较高,表明群落组成复杂,群落所受污染压迫较小.拐点以后,分维数较低,表明群落组成逐渐简单,群落所受的污染压迫较大.因此对异养性指数的分形研究,可以较好的反映微型生物群落在受到不同的污染压迫时,群落组成从复杂到简单演替过程中的动力学过程.另外,在水质微型生物群落监测方法(pfu)的4个生物参数中,除异养性指数外,其它3个参数都要求有原生动物分类基础,在显微镜下用活体鉴定种类,要求仔细观察,不能遗漏种类,对分析人员的技能要求高.但异养性指数(HI)靠仪器测定,易于掌握.

关键词： pfu 生物群落生物监测异养性指数叶绿素

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实时RT-PCR检测西尼罗病毒

中华微生物学和免疫学杂志 2005年第6期25卷 519-522页

作者：邓永强姜涛于曼秦成峰陈水平祝庆余秦鄂德军事医学科学院微生物流行病研究所

目的建立西尼罗病毒快速、敏感和特异的实时RTPCR法,用于西尼罗病毒疾病的早期诊断。方法对Vero细胞增殖的西尼罗病毒分别进行常规RTPCR和实时RTPCR法扩增,以pfu/ml为参考标准,比较二者的敏感性和特异性。并用实时RTPCR法检测西尼罗病... 详细信息

目的建立西尼罗病毒快速、敏感和特异的实时RTPCR法,用于西尼罗病毒疾病的早期诊断。方法对Vero细胞增殖的西尼罗病毒分别进行常规RTPCR和实时RTPCR法扩增,以pfu/ml为参考标准,比较二者的敏感性和特异性。并用实时RTPCR法检测西尼罗病毒感染的小鼠组织标本。结果采用所建立的实时RTPCR法和常规RTPCR法可分别检测到0.02pfu/ml和2pfu/ml的西尼罗病毒RNA,前者的敏感性比后者高100倍。而对其他黄病毒科成员的检测均为阴性,表明该方法是特异的。采用这种实时RTPCR法可从西尼罗病毒感染小鼠的血液、脾脏、肾脏和脑组织标本中检测出病毒核酸,且在感染后第2天最先自血液和脾脏中检测到病毒,在感染后1周的脑组织中的病毒滴度最高。结论本研究建立的实时RTPCR法具有很高的敏感性和特异性,因此该方法可用于西尼罗病毒疾病的早期监测和流行病学研究。

关键词：实时RT-PCR检测 RT-PCR法西尼罗病毒感染 PCR法检测流行病学研究病毒疾病组织标本病毒RNA 早期诊断细胞增殖 Vero 参考标准黄病毒科病毒核酸病毒滴度早期监测特异性敏感性感染后 ml pfu 脑组织小鼠血液

对pfu法中MacArthur-Wilson平衡模型的修改

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水生生物学报 1989年第4期13卷 312-318页

作者：王继忠沈韫芬顾曼如中国科学院水生生物研究所

考虑到环境压迫的因素,对pfu法中的MacArthur-Wilson平衡模型作了修改,推导出一个更为适用的新模型。小野外生态试验和室内毒理试验中提出4个功能参数(S_(eq),G,H,T_(90％))用于环境的生物监测。使用Monte Garlo序贯随机模拟算法和Marqu... 详细信息

考虑到环境压迫的因素,对pfu法中的MacArthur-Wilson平衡模型作了修改,推导出一个更为适用的新模型。小野外生态试验和室内毒理试验中提出4个功能参数(S_(eq),G,H,T_(90％))用于环境的生物监测。使用Monte Garlo序贯随机模拟算法和Marquardt算法估计模型参数并完成计算机程序的编制,最后还使用拟合差异度法检验实验模型。

关键词：修改平衡模型 pfu 水体污染生物监测

修饰的pfu酶与T7ssb蛋白在聚合酶链式反应中的应用

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基因组学与应用生物学 2018年第5期37卷 2220-2227页

作者：刘明珠秦中强杨天华陈勇李永海李正红蚌埠医学院科研中心生理学实验室蚌埠233000 蚌埠医学院科研中心病理生理实验室蚌埠233000 蚌埠医学院科研中心感染与免疫实验室蚌埠233000

表达、纯化pfu-sso7d及T7ssb蛋白,并优化PCR反应体系。分别将pfu、pfu-sso7d及T7ssb基因构建于p ET28载体上,转化至原核细胞中,诱导表达出pfu、pfu-sso7d及T7ssb蛋白,并通过His-Nickle亲和层析纯化柱纯化蛋白。从A549细胞中提取人的基因... 详细信息

表达、纯化pfu-sso7d及T7ssb蛋白,并优化PCR反应体系。分别将pfu、pfu-sso7d及T7ssb基因构建于p ET28载体上,转化至原核细胞中,诱导表达出pfu、pfu-sso7d及T7ssb蛋白,并通过His-Nickle亲和层析纯化柱纯化蛋白。从A549细胞中提取人的基因组DNA,以该基因组DNA为模板,利用pfu酶扩增c-met基因;同时从A549中提取总RNA,经过逆转录反应后,以逆转录产物c DNA为模板,分别利用pfu酶和pfu-sso7d酶扩增PD-L1基因,对比两种酶的DNA扩增效率;从MC38细胞中提取鼠的基因组DNA,以此基因组DNA为模板,分别用pfu-sso7d和pfu-sso7d联合T7ssb蛋白扩增Trp53基因,对比两种PCR反应体系的扩增效率。我们成功的将pfu、pfu-sso7d及T7ssb基因构建于p ET28载体上,并成功的诱导表达并纯化了这三种蛋白;用pfu酶成功的扩增出c-met基因;对比pfu酶,pfu-sso7d表现出较高的DNA扩增效率;在扩增Trp53基因的PCR反应体系中,同单独使用pfu-sso7d酶相比,pfu-sso7d联合T7ssb蛋白在PCR反应体系中可以提高PCR产物的量,约1.7倍。本次研究表明,利用纯化的pfu-sso7d蛋白和T7ssb蛋白,我们构建了优化的PCR反应体系。

关键词：聚合酶链反应 pfu DNA聚合酶 T7单链结合蛋白重组蛋白诱导表达蛋白纯化