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pf-127水凝胶联合骨髓间充质干细胞外泌体来源miR-132诱导成骨分化修复牙槽骨缺损

河北医学 2024年第5期30卷 731-737页

作者：邱静怡袁京首都医科大学附属北京世纪坛医院口腔科北京海淀区100039 中国人民解放军总医院第一医学中心北京海淀区100039

目的:探究pf-127水凝胶联合骨髓间充质干细胞外泌体来源miR-132诱导成骨分化对牙槽骨缺损的修复作用。方法:培养骨髓间充质干细胞,(bone mesenchymal stem cells,BMSCs),并转染anti-miR-132、anti-miR-NC质粒。制备BMSCs来源外泌体(bone... 详细信息

目的:探究pf-127水凝胶联合骨髓间充质干细胞外泌体来源miR-132诱导成骨分化对牙槽骨缺损的修复作用。方法:培养骨髓间充质干细胞,(bone mesenchymal stem cells,BMSCs),并转染anti-miR-132、anti-miR-NC质粒。制备BMSCs来源外泌体(bone mesenchymal stem cells-exosomes,BMSCs-exo),蛋白质印迹法鉴定表达标志物。制备pf-127水凝胶和BMSCs-Exo复合物,PKH67标记法检测BMSCs的摄取;茜素红染色检测BMSCs的成骨能力;逆转录-聚合酶链反应(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction,RT-PCR)检测细胞中miR-132表达和碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、骨钙素(osteocalcin,OCN)、Runt相关转录因子2(Runt-related transcription factor 2,Runx2)mRNA表达。建立牙槽骨缺损大鼠模型,将大鼠随机分为pf-127水凝胶组、pf-127水凝胶+BMSCs-exo-anti-miR-NC组和pf-127水凝胶+BMSCs-exo-anti-miR-132组。微型计算机断层扫描(Micro-computed tomography,micro-CT)评估牙槽骨缺损情况;蛋白质印迹法检测牙槽骨组织中ALP、OCN、Runx2蛋白表达。结果:anti-miR-132组BMSCs中miR-132表达明显低于anti-miR-NC组(Ppf127水凝胶组相比,BMSC-exo-anti-miR-NC组、pf127水凝胶+BMSC-exo-anti-miR-NC组、pf127水凝胶+BMSC-exo-anti-miR-132组中miR-132表达均明显降低,茜素红染色相对活性、细胞中Runx2、ALP和OCN mRNA表达均明显增加,且pf127水凝胶+BMSC-exo-anti-miR-132组变化最显著(Ppf-127水凝胶+BMSCs-exo-anti-miR-NC组和pf-127水凝胶+BMSCs-exo-anti-miR-132组BV/TV比值、BMD、Tb.N和***及细胞中Runx2、ALP、OCN蛋白表达均明显升高,***明显降低(Ppf-127水凝胶+BMSCs-exo-anti-miR-132组变化最显著。结论:pf-127水凝胶联合骨髓间充质干细胞来源外泌体来源干扰miR-132表达可促进骨髓间充质干细胞的成骨分化,从而促进牙槽骨缺损大鼠的修复。

关键词：牙槽骨缺损 pf-127水凝胶骨髓间充质干细胞外泌体 miR-132 成骨分化

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脂肪间充质干细胞及pf-127水凝胶复合物对宫腔粘连子宫内膜的修复功能研究

脂肪间充质干细胞及PF-127水凝胶复合物对宫腔粘连子宫内膜的修复...

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作者：祖珍玉广州中医药大学

学位级别：硕士

研究背景:宫腔粘连(Intrauterine adhesions,IUA)主要由外伤或手术引起的子宫内膜损伤,导致宫腔部分或完全闭塞,并伴有宫腔进行性纤维化,可导致不孕、反复流产、腹痛和其他不良妊娠结局。IUA治疗的主要目的是重建宫腔并恢复子宫内膜功能... 详细信息

研究背景:宫腔粘连(Intrauterine adhesions,IUA)主要由外伤或手术引起的子宫内膜损伤,导致宫腔部分或完全闭塞,并伴有宫腔进行性纤维化,可导致不孕、反复流产、腹痛和其他不良妊娠结局。IUA治疗的主要目的是重建宫腔并恢复子宫内膜功能,宫腔镜下经宫颈粘连切除术(Hysteroscopic transcervical resection of adhesion,TCRA)是宫腔粘连治疗的标准方法,但术后粘连的高复发率和低妊娠率仍然是中重度IUA患者重点关注的问题。近年来,干细胞研究在生物医学领域的进展为IUA的治疗提供了新的机遇,利用间充质干细胞进行宫腔粘连的治疗已成为医学研究的热点。脂肪间充质干细胞(Adipose Derived Stem Cells,ADSCs)来源丰富,可通过分离、体外培养获取且具有较强的分化能力。此外,脂肪间充质干细胞经过反复扩增后功能旺盛,其免疫原性较低,研究表明其具有抗炎和抗纤维化作用,可以抑制干细胞凋亡和促进其再生,在未来可作为IUA的一种潜在治疗方法,然而目前对于脂肪间充质干细胞治疗IUA的疗效及机制尚不完全清楚。普兰尼克F-127(PluronicF-127,pf-127),是由聚氧乙烯(Polyoxyethylene,PEO)与聚氧丙稀(Poly propylene oxygen;PPO)组成的一种非离子表面活性共聚物(分子式为PEO-PPO-PEO),是美国FDA批准的生物可吸收的生物相容性支架材料,在温度升高时可逆地胶凝,并通过简单的表面吸收和清除在体内逐渐溶解。它具有优异的生物学特性,包括固有的生物相容性、低抗原性和生物降解性,相关的实验表明其与宫腔粘连手术联合使用时抗粘连的有效率增加;然而对于基底层严重受损和子宫内膜丧失的中重度IUA病患者,由于目前干预治疗措施的有效性有限,子宫内膜再生仍然是一个巨大的挑战。目前尚未发现将ADSCs和pf-127水凝胶复合物应用于中重度IUA患者子宫内膜再生修复的研究。本研究通过建立与临床IUA病理特征相似的化学损伤IUA模型,并通过分离提取ADSCs,构建脂肪间充质干细胞-pf-127水凝胶复合物,评价其对子宫内膜容受性的影响及评估其生物安全性,探讨其在体内治疗效果及其可能修复作用机制,以期为解决临床中重度IUA患者子宫内膜容受性下降的问题提供一种新的思路。第一部分新西兰大白兔宫腔粘连化学损伤模型的构建及评价目的:构建稳定有效且符合人类IUA病理组织特征的的动物IUA模型方法:1.选用60只健康雌性普通级新西兰大白兔并将其随机分为4组,假手术组、化学损伤10s组、化学损伤30s组、化学损伤60s组,每组15只,余20只雌兔随机分为假手术组、化学损伤10s组、化学损伤30s组、化学损伤60s组,每组5只进行生殖功能实验研究。造模7d、14d、28d后,分批处死各组兔,切除双侧子宫,置于4%多聚甲醛浸泡固定,以备后续HE染色及Masson染色实验。2.通过对子宫组织包埋切片后进行HE染色和Masson染色,运用光镜观察子宫大体形态学变化,检测分析子宫内膜腺体数量、内膜厚度及纤维化程度。3.通过妊娠实验检测各造模组在妊娠率和增加胚胎着床数方面的变化进而评价四种造模方法IUA兔的生殖功能。结果:1.大体形态学观察假手术组兔子宫壁光滑柔韧,厚度均匀,弹性高,子宫结构完整,上皮细胞结构完整,间质腺体丰富。与假手术组相比,在术后第7天,化学损伤10s组子宫内膜形态几乎没有明显变化,子宫内膜结构基本完整;术后14天,子宫出现轻度出血,间质水肿;术后28天细胞外基质胶原纤维轻度增加,宫腔形态结构比较完整。化学损伤30s组在术后7天子宫腺腔扩张,毛细血管变脆易破裂出血,但细胞形态损伤不明显;术后14天子宫内膜腺管腔内可见致密的中性粒细胞浸润,子宫腔上皮和腺上皮细胞结构不完整;术后28天有轻度恢复,仍有宫腔粘连带出现。化学损伤1min组术后7天,宫腔严重水肿,子宫内膜组织结构疏松,子宫内膜坏死明显,形成多发性微脓肿;术后14天和28天,上皮无再生,中性粒细胞减少,腔上皮结构被完全破坏,可见不同程度的变性、坏死和脱落。间质纤维化更为严重,粘膜层和肌层均出现散在分布的微脓肿。2.子宫内膜厚度检测正常子宫内膜表面呈波浪形,子宫黏膜下层和基底层呈圆形或椭圆形。三组损伤模型兔子宫宫腔形态不规则,有扩张或萎缩,部分浅肌层缺失,腺体稀疏,部分损伤部位有脱落的内膜碎片。在造模后第7天、14天和28天测定各组模型的子宫内膜厚度。术后7天和14天后,化学损伤10s组和化学损伤30s组子宫内膜厚度逐渐下降(P<0.05);化学损伤30s组在造模后28天,内膜厚度相较于14天有所升高(P<0.05),而化学损伤60s组子宫内膜厚度仍继续下降,差异有显著性(P<0.05)。3

关键词：宫腔粘连脂肪间充质干细胞子宫内膜容受性 pf-127水凝胶

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人脂肪源性外泌体联合pf-127水凝胶通过miR-148a-3p递送促进皮肤创面血管再生的机制研究

人脂肪源性外泌体联合PF-127水凝胶通过miR-148a-3p递送促进皮肤...

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作者：张琪琪中国医科大学

学位级别：硕士

目的:皮肤创面愈合是一个复杂的生理过程,血管再生在其中发挥着重要的作用。外泌体(Exosomes,Exos)可以通过递送其内蛋白质、m RNA和微小RNA(micro RNA,mi RNA)等物质对皮肤创面愈合过程进行调控。人脂肪间充质干细胞(Human Adipose-der... 详细信息

目的:皮肤创面愈合是一个复杂的生理过程,血管再生在其中发挥着重要的作用。外泌体(Exosomes,Exos)可以通过递送其内蛋白质、m RNA和微小RNA(micro RNA,mi RNA)等物质对皮肤创面愈合过程进行调控。人脂肪间充质干细胞(Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells,h ADSCs)源性的外泌体中mi R-148a-3p的表达水平较高,并且可以促进血管形成。另外,Pluronic F-127水凝胶(Pluronic F-127 hydrogel,pf-127水凝胶)是一种新型生物材料,具有结合其他活性物质并对其进行缓释的作用,可以用作药物的运载体。本研究旨在探究外泌体中mi R-148a-3p在促进内皮细胞功能与皮肤创面愈合和血管生成的过程中发挥的作用及其机制。方法:1、使用超滤法从h ADSCs中分离外泌体,并对其进行鉴定,通过转染mi R-148a-3p sponge质粒对h ASDSCs中mi R-148a-3p进行敲低,分离外泌体,得到mi R-148a-3p被敲低的外泌体。2、通过生物信息学分析,筛选出mi R-148a-3p的靶基因及其涉及的信号通路。3、通过细胞功能实验包括CCK-8、细胞划痕实验、管腔形成实验以及蛋白免疫印迹实验(Western blot,WB)和实时荧光定量聚合酶链式反应(Real Time Quantitative Polymerase Chain Reaction,RT-q PCR)检测外泌体、pf-127水凝胶和mi R-148a-3p、靶基因对人脐静脉内皮细胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cells,HUVECs)功能的影响。4、通过双荧光素酶报告基因实验对mi R-148a-3p对其靶基因的靶向抑制作用进行验证,并通过WB和RT-q PCR检测过表达和敲低mi R-148a-3p后靶基因表达水平的变化情况。通过WB对mi R-148a-3p和靶基因是否参与信号通路进行验证。5、通过体内实验建立小鼠全层皮肤损伤模型,观察外泌体、pf-127水凝胶和mi R-148a-3p敲低的外泌体局部涂抹处理后创面愈合速度,并通过苏木素-伊红(Hematoxylin-eosin,H&E)染色、Masson染色、CD31免疫组化染色、WB检测创面愈合效果和血管再生情况。结果:1、通过生物信息学分析,筛选出mi R-148a-3p的靶基因磷酸酶和张力蛋白同源物(Phosphatase and tensin homologue,PTEN),及其涉及的PI3K/AKT信号通路。2、通过超滤法从未经处理和经过mi R-148a-3p敲低处理的h ADSCs中成功分离外泌体,通过RT-q PCR检测到敲低处理的h ADSCs分离的外泌体中mi R-148a-3p水平下降。3、通过体外细胞功能实验以及WB和RT-q PCR实验发现,外泌体可以通过其内mi R-148a-3p下调靶基因PTEN的表达,并激活PI3K/AKT信号通路,促进HUVECs的增殖、迁移和管腔形成功能,pf-127水凝胶不能直接促进HUVECS的功能。4、通过体内实验发现,外泌体可以通过其内mi R-148a-3p促进小鼠皮肤创面愈合,pf-127水凝胶联合外泌体处理对创面愈合的作用最显著,加速了创面愈合速度和效果,增强了血管再生能力。结论:本研究结果显示,h ADSCs中外泌体可以通过其内mi R-148a-3p靶向抑制PTEN表达,并激活PI3K/AKT信号通路,从而促进HUVECs的增殖、迁移和管腔形成功能,促进皮肤创面愈合和血管再生,pf-127水凝胶与外泌体联合作用于创面,具有更好的治疗效果。

关键词：外泌体 miRNA pf-127水凝胶创面愈合血管再生

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pf-127-LV-NTFs三维复合支架培养大鼠神经干细胞

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基础医学与临床 2022年第1期42卷 75-81页

作者：梁国新梁茵茹刘淑贤陈康振林勇秦江霞吴洪福广东医科大学附属第三医院(顺德龙江医院) 广东佛山528318 广东医科大学附属广州花都医院广东广州510800 广东医科大学干细胞与再生组织工程重点实验室广东东莞523808

目的观察Pluronic F-127(pf-127)水凝胶负载编码慢病毒LINGO-1 shRNA(LV)及神经营养因子混合物(NTFs)(pf-127-LV-NTFs)三维复合支架对大鼠神经干细胞(NSCs)增殖分化的影响。方法构建慢病毒(LV)后以不同感染复数(MOI)感染NSCs,用RT-qPCR及Western blot检测NSCs中LINGO-1的表达;按照一定比例将脑源性神经营养因子(BDNF)、神经营养素-3(NT-3)、血小板衍生生长因子(PDGF)、胰岛素样生长因子-1(IGF-1)、表皮生长因子(EGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、神经胶质细胞来源的神经营养因子(GDNF)配制成NTFcocktail(NTFs),pf-127水凝胶负载LV和NTFcocktail并分组培养NSCs;用CCK-8法检测NSCs的细胞活力,LIVE/DEAD染色检测NSCs的存活率,免疫荧光染色检测NSCs增殖和分化情况。结果LV感染NSCs的最适MOI=5;pf-127对NSCs的细胞活力没有影响;pf-127+LV+NTFs组NSCs存活、增殖及神经元分化比例较高(Ppf-127-LV-NTFs三维复合支架有利于大鼠NSCs的增殖和神经元的定向分化。

关键词：神经干细胞 LINGO-1 shRNA pf-127水凝胶神经元分化

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