检索结果-南通市图书馆

作者：高晓山西大学

学位级别：硕士

基因治疗通过向靶细胞导入正常基因(外源)来治疗基因缺陷相关疾病。因此,基因治疗作为一种新的肿瘤治疗方式引起了研究者的关注。近年来,基于siRNA的RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术迅速发展,该技术可以特异性降低或关闭目的基因的... 详细信息

基因治疗通过向靶细胞导入正常基因(外源)来治疗基因缺陷相关疾病。因此,基因治疗作为一种新的肿瘤治疗方式引起了研究者的关注。近年来,基于siRNA的RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术迅速发展,该技术可以特异性降低或关闭目的基因的表达,因此该技术在基因治疗领域已经被大量应用。但是裸露的siRNA稳定性差、对血清降解敏感且难以穿透细胞膜。为此,研究者开发了各种各样的递送系统用于实现siRNA的高效递送。而基于聚合物的递送载体具有安全性高、结构易于改造等优势,是研究最多的一类siRNA递送载体。聚乙烯亚胺(pei)可高效络合siRNA,其“质子海绵效应”可有效逃逸内涵体,但pei具有显著的细胞毒性严重限制了其生物医学应用。聚乙二醇(peg)化是一种广泛使用的提高递送系统生物相容性并延长其循环时间的策略,但该过程会降低细胞内化,这一现象被称为“peg窘境”。FeO纳米颗粒具有易于制备、尺寸小、易于化学功能化、优异的生物相容性和稳定性及良好的磁响应性等优势,在生物医学领域展现了良好的应用前景。基于以上研究背景,本课题设计并构建了一种peg可脱落型磁性si PKM2纳米递送系统,该系统在弱酸性条件下可显著增强si PKM2的稳定性及递送效率,并可通过下调PKM2的表达来发挥抗肿瘤效应。本课题主要包括以下三个方面的研究内容。(1)peg-pei/FeO复合物的合成与表征。首先合成peg-pei共聚物,然后与带负电荷的FeO纳米颗粒通过静电相互作用形成peg-pei/FeO复合物,通过TEM、SQUID、DLS等技术对其进行表征,证明了peg-pei/FeO复合物被成功合成。接着通过荧光定量PCR技术、Western Blot技术在m RNA和蛋白水平证实:与结肠上皮细胞FHC相比,PKM2在结肠癌细胞HCT116中显著上调表达。因此,后续采用PKM2高表达的HCT116细胞作为研究对象进行实验。通过MTT法来检测peg-pei/FeO复合物的细胞毒性,表明peg的引入明显降低了pei的细胞毒性。(2)peg-pei/FeO复合物对siRNA的络合能力及递送效率研究。采用凝胶阻滞法检测了peg-pei及peg-pei/FeO复合物对siRNA的络合能力,当N/P比大于等于5:1时,peg-pei共聚物及peg-pei/FeO复合物与siRNA完全络合。琼脂糖凝胶电泳证明peg-pei/FeO@siRNA复合物具有良好的血清稳定性。通过激光扫描共聚焦显微镜和流式细胞仪检测了HCT116细胞对peg-pei/FeO@siPKM2纳米复合物的摄取,结果表明在磁场引导和弱酸性条件下纳米复合物的内化能力明显增强,显著提高了siRNA的递送效率。另外,荧光定量PCR和Western Blot技术证实,在磁场引导和弱酸性条件下,peg-pei/FeO@si PKM2纳米复合物在m RNA和蛋白方面可有效抑制PKM2的表达。(3)peg-pei/FeO@si PKM2纳米复合物的体外抗肿瘤活性评价。通过MTT检测、结晶紫染色法、Annexin V-FITC/PI双染细胞调亡试剂盒、葡萄糖和乳酸检测试剂盒、划痕法和Transwell实验等方法较为系统地研究了peg-pei/FeO@si PKM2纳米复合物的体外抗肿瘤活性。在p H 6.5并有磁场存在的条件下,peg-pei/FeO@si PKM2纳米复合物可有效抑制HCT116细胞的增殖并触发大量肿瘤细胞凋亡;再者,该纳米复合物可显著抑制HCT116细胞对葡萄糖的摄取并减少乳酸的产生,进而降低糖酵解水平;此外,peg-pei/FeO@si PKM2纳米复合物可高效抑制HCT116细胞的迁移。综上所述,本课题成功合成了peg-pei/FeO@si PKM2纳米复合物,该纳米复合物具有良好的血清稳定性;在肿瘤的弱酸性环境中,peg会从纳米复合物上脱落下来,在磁场介导下有效进入肿瘤细胞,促进si PKM2高效递送,因此有望解决“peg窘境”;peg-pei/FeO@si PKM2纳米复合物通过下调PKM2的表达来发挥抗肿瘤活性。本研究可为p H和磁双响应型递送系统构建提供新策略,同时也可为代谢靶向型肿瘤治疗提供新思路。

关键词： peg-pei 磁性siRNA递送载体纳米复合物 PKM2 抗肿瘤活性

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靶向纳米材料作为大鼠单个核细胞基因载体的研究

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赣南医学院学报 2016年第3期36卷 343-346页

作者：董亚贤尧慧燕梁兵钟高贤刁芳明石红婷广州医科大学附属第一医院神经内科广东广州510000 广州医科大学附属第四医院神经内科广东广州510000 广州医科大学附属第二医院神经内科广东广州510000

目的:探讨纳米材料聚乙二醇-聚乙烯亚胺(peg-pei)作为基因载体的可行性研究,研究其负载质粒DNA(p DNA)的能力,分析所形成纳米材料/p DNA复合物的特性,以及体外对细胞的毒性大小及其转染效率。方法:以pei为对照,合成peg-pei,采用MTT法检... 详细信息

目的:探讨纳米材料聚乙二醇-聚乙烯亚胺(peg-pei)作为基因载体的可行性研究,研究其负载质粒DNA(p DNA)的能力,分析所形成纳米材料/p DNA复合物的特性,以及体外对细胞的毒性大小及其转染效率。方法:以pei为对照,合成peg-pei,采用MTT法检测所形成纳米材料/DNA复合物对大鼠单个核细胞(PBMC)的细胞毒性,再采用倒置荧光显微镜及流式细胞仪检测转染效果。结果:N/Ppeg-pei和pei的存活率分别为82.7%及81.3%(P﹥0.05);N/P=10时,peg-pei是81%,pei为59%(Ppeg-pei的细胞存活率比pei低(Ppeg-pei较pei表达的绿色荧光多,荧光强度大(Ppeg-pei和pei的转染效率,分别为28.9%和12.5%(Ppeg-pei具有强的负载能力,转染效率高,细胞毒性低的优点,为作为多发性硬化基因载体的可行性奠定了实践基础。

关键词：纳米材料 peg-pei 体外基因转染

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