检索结果-南通市图书馆

作者：刘晶慧中国农业科学院

学位级别：硕士

植物基因工程已经被广泛应用到作物遗传改良中,为农作物品种改良提供了重要支撑。其中,CRISPR/Cas9基因编辑技术具有特异性高、编辑效率高、操作简单等优点而被广泛应用到植物基因工程中。但在植物遗传转化过程中,植物细胞壁会限制外源... 详细信息

植物基因工程已经被广泛应用到作物遗传改良中,为农作物品种改良提供了重要支撑。其中,CRISPR/Cas9基因编辑技术具有特异性高、编辑效率高、操作简单等优点而被广泛应用到植物基因工程中。但在植物遗传转化过程中,植物细胞壁会限制外源分子进入细胞,基因编辑元件的大小也会影响外源基因传递效率,导致基因编辑效率降低。另外,传统遗传转化方法具有宿主限制性,限制了基因编辑技术的应用范围。因此,打破物种限制性,高效地将外源分子传递到受体细胞中是植物基因编辑技术待突破的一个重要瓶颈。基于此,研究与完善具有高传递效率的外源基因递送系统,构建一种直接穿壁的、无外源基因整合的新型植物遗传转化平台,变得十分重要。本研究首先筛选出高效的瞬时转化方法,鉴定出高效基因编辑体系,探索了单壁碳纳米管(single-walled carbon nanotubes,SWNT)介导的遗传转化方法在植物中的可行性,以期利用瞬时转化的短时效性优势,将SWNT介导的遗传转化方法与基因编辑技术结合,获得一种新型稳定的遗传转化体系。主要研究内容及结果如下:(1)瞬时遗传转化方法筛选。为筛选出高效传递外源基因的瞬时遗传转化方法,以油菜原生质体为受体细胞,比较peg、CPP、脂质体介导的瞬时遗传转化效率,结果表明peg转化法的转化效率高,可以应用到基因编辑元件筛选以及基因编辑效率检测的实验当中。(2)高效基因编辑体系筛选。为提高基因编辑效率,筛选出高效的基因编辑体系,使用peg介导的遗传转化方法,将不同类型的基因编辑元件导入野生型或稳定表达Cas9蛋白的油菜原生质体中,分析基因编辑效率。结果表明:不同启动子驱动的g RNA基因编辑效率不同,与U6-26启动子相比,UBQ10启动子驱动的g RNA质粒的基因编辑效率高,说明优化基因编辑元件的启动子,可提高g RNA在受体细胞内的表达水平,进而提高基因编辑效率;编辑元件的大小影响基因编辑效率,与表达Cas9蛋白及sg RNA的基因编辑质粒相比,体外转录获得sg RNA作用于稳定表达Cas9蛋白植株时,基因编辑效率高,说明减小基因编辑元件的大小能够提高外源基因传递效率,进而提高基因编辑的效率。(3)SWNT介导的瞬时遗传转化体系。为验证SWNT介导的瞬时遗传转化方法在植物细胞中的可行性,首先构建了聚乙烯亚胺单壁碳纳米管复合物(PEI-SWNT),探索PEI-SWNT复合物与外源基因的最佳结合比例,然后使用PEI-SWNT复合物将报告基因转化到油菜原生质体和烟草叶片中,在荧光显微镜下可以成功观察到荧光蛋白的表达。说明PEI-SWNT复合物无需借助外力,可以携带并保护目的基因穿过植物的细胞壁进行基因传递,使其成功在受体细胞内进行无基因整合的瞬时表达,验证了该转化平台的可行性。在后续的实验中,可将SWNT介导的瞬时转化方法与基因编辑技术相结合,对受体植株的分生组织或花粉细胞进行基因编辑,可以获得稳定遗传的基因编辑植株。将本研究建立的瞬时转化体系与基因编辑技术结合,为生物育种产业的快速发展提供有力的技术支持。

关键词：基因编辑效率瞬时转化单壁碳纳米管 peg转化法新型植物遗传转化平台

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真菌免疫调节蛋白基因LZ-8过表达载体的构建及转化灵芝原生质体的研究

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菌物学报 2017年第12期36卷 1625-1631页

作者：孙墨可张曼田娟李晓薇李海燕李玉白城市农业科学院生物技术实验室吉林白城137000 吉林农业大学生物反应器与药物开发教育部工程研究中心吉林长春130118 吉林农业大学食药用菌教育部工程研究中心吉林长春130118

灵芝Ganoderma lingzhi是我国著名的药用真菌。但是,作为一种营养和保健价值都非常高的大型担子菌,灵芝还缺乏完善的转基因方法和安全转基因体系。本研究建立了免疫调节蛋白基因的过表达系统,并利用真菌特异性启动子GPD、终止子NOS和目... 详细信息

灵芝Ganoderma lingzhi是我国著名的药用真菌。但是,作为一种营养和保健价值都非常高的大型担子菌,灵芝还缺乏完善的转基因方法和安全转基因体系。本研究建立了免疫调节蛋白基因的过表达系统,并利用真菌特异性启动子GPD、终止子NOS和目的基因LZ-8构建真菌特异性双T-DNA表达载体p SB130NG-LZ8;利用溶壁酶提取灵芝原生质体,并用FDA染色法检测灵芝原生质体活性,原生质体成活率约为80%。通过peg转化法对灵芝原生质体成功进行了转化,转化得到的原生质体在带有潮霉素抗性平板上长出,转化率为3–4/μgpSB130NG-LZ8+107个原生质体。转化子通过PCR检测和荧光定量PCR检测,获得LZ-8在灵芝中的过表达。

关键词：灵芝双T-DNA载体目的基因LZ-8 peg转化法荧光定量PCR

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