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中国人兽共患病学报 2021年第10期37卷 937-944页

作者：王璞蔡玉荣张刚孔云逸穆爱娟李勇宁夏大学西部生物资源保护与利用教育部重点实验室银川750021 宁夏大学生命科学学院银川750021 贺兰县农业农村局农业综合执法大队贺兰750200

结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)是引起结核病的病原体,也是单一感染微生物导致死亡的最重要原因。在MTB基因组上有一类特殊的蛋白家族——pe/ppe蛋白家族,该蛋白家族对细菌毒力、抗原变异、宿主细胞命运等至关重要,且在... 详细信息

结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)是引起结核病的病原体,也是单一感染微生物导致死亡的最重要原因。在MTB基因组上有一类特殊的蛋白家族——pe/ppe蛋白家族,该蛋白家族对细菌毒力、抗原变异、宿主细胞命运等至关重要,且在特异性诊断试剂和疫苗研制中具有广阔的应用前景。本文将从pe/ppe蛋白家族的结构特征、生物学功能、及其对宿主免疫反应调控等方面的近年来研究进展作一综述。

关键词：结核分枝杆菌 pe/ppe Th1 巨噬细胞

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结核分支杆菌pe/ppe特异性基因的克隆表达及初步应用

结核分支杆菌PE/PPE特异性基因的克隆表达及初步应用

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作者：吴静希西北农林科技大学

学位级别：硕士

结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)是引起结核病的病原菌,是当前肆虐全球、严重危害人类健康的重要传染病。随着人口流动增加、多重耐药菌株的出现以及HIV与结核分支杆菌伴发感染,结核分支杆菌的感染和传播呈逐年上升趋势,... 详细信息

结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)是引起结核病的病原菌,是当前肆虐全球、严重危害人类健康的重要传染病。随着人口流动增加、多重耐药菌株的出现以及HIV与结核分支杆菌伴发感染,结核分支杆菌的感染和传播呈逐年上升趋势,已成为全球严重的公共卫生和社会问题。早期诊断及规范治疗是主要的防控策略,临床上急需特异而灵敏的的快速诊断方法。pe/ppe蛋白家族随着结核分支杆菌全基因序列测序的完成而发现,推测它们可能具有重要的免疫学价值,有助于研究开发新型特异性诊断试剂和有效的结核疫苗。本研究通过生物信息学分析结核分支杆菌所特有的全部167个pe/ppe,并进行膜蛋白或分泌蛋白的预测,选取与BCG相似性较低的pe/ppe,并结合RD1～RD16区的pe/ppe基因分布及优势抗原表位分析,最终选取三个pe/ppe目的基因作为研究对象,分析具备优势抗原表位的重组蛋白片段可能为结核诊断的研究提供新的备选抗原。成功构建了3个重组表达质粒peT-28a(+)-Rv3425、peT-28a(+)-Rv3873、peT-28a(+)-Rv2487c,原核表达纯化出具有优势抗原表位的蛋白片段,与rCFP10- ESAT6共同进行主要抗原性分析。重组蛋白的Western印迹分析显示,rRv3873、rCFP10-ESAT6与rRv3425显示出良好的反应原性;而rRv2487c未检测到阳性条带。 ELISA结果显示,rRv3425、rRv3873和rCFP10-ESAT6在结核抗体检测中的敏感性和特异性分别为39%和97.5%,28%和94.6%, 37%和95%。而将rRv3425与rCFP10-ESAT6的ELISA结果合并分析,检测的敏感性可提高到57%,初步显示了rRv3425和rCFP10-ESAT6存在一定的抗原互补性,可提高诊断的敏感性并为抗原的联合诊断提供参考。 ELISPOT结果显示,rRv2487c和rCFP10-ESAT6检测28例结核病患者阳性率分别为78.6%、75%,检测21例健康者的阳性率分别为19%、23.8%,而rRv3873和rRv3425均未出现斑点反应。rRv2487作为未见报道的抗原,本试验结果显示其与CFP10-ESAT6的ELISPOT检测结果相近,提示可能作为以T细胞为基础的结核诊断试验的备选抗原。综上所述,本研究通过生物信息学预测的基因抗原表位,为寻找更好的抗原靶位提供了参考。具有优势抗原表位的重组蛋白片段,在结核病诊断中具备一定的潜在应用价值,可与其它备选抗原联合辅助诊断提供参考。

关键词：结核分支杆菌生物信息学 pe/ppe ELISA ELISPOT

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结核分枝杆菌靶抗原Rv1789刺激结核感染人群IFN-γ水平研究

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中国病原生物学杂志 2016年第11期11卷 964-968页

作者：薛满红黄彬王晓春许礼发李朝品南京市妇幼保健院江苏南京210004 安徽理工大学医学院病原生物学教研室安徽淮南232001 皖南医学院安徽芜湖241002

目的检测并比较Rv1789刺激结核分枝杆菌(Mtb)感染人群和健康对照者外周血IFN-γ水平。方法以原核表达体系构建、表达、纯化rRv1789。从南京市疾病预防控制中心选择39位受试者,参考临床结核病诊断标准和rCM-WBIA诊断标准将其分为TB感染组... 详细信息

目的检测并比较Rv1789刺激结核分枝杆菌(Mtb)感染人群和健康对照者外周血IFN-γ水平。方法以原核表达体系构建、表达、纯化rRv1789。从南京市疾病预防控制中心选择39位受试者,参考临床结核病诊断标准和rCM-WBIA诊断标准将其分为TB感染组(包括结核病患者和潜伏感染者)和健康对照组,进行rRv1789-WBIA试验。结果成功构建peT30b-Rv1789质粒,SDS-PAGE鉴定表达产物分子质量单位为44ku,与预期相符;Western blot证实该蛋白能被相应抗体识别。rRv1789刺激Mtb感染组产生的IFN-γ水平显著高于健康对照组(Ppe/ppe家族蛋白Rv1789具有抗原性,可用作Mtb感染快速诊断和结核疫苗候选抗原。

关键词： pe/ppe rRv1789 rCM 全血IFN-γ释放试验(WBIA)

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卡介苗基因缺失株BCGΔWag22的构建及BALB/c小鼠潜伏感染模型的建立

卡介苗基因缺失株BCGΔWag22的构建及BALB/c小鼠潜伏感染模型的建...

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作者：赵静华中农业大学

学位级别：硕士

结核分枝杆菌是造成结核病的主要病原,结核病作为一种世界性的疾病,在全世界范围内造成了巨大的精神和物质伤害。在完成结核分枝杆菌群基因组测序后,发现了一个在全基因组中占有10%的比重的一个家族---pe和ppe家族,而pe家族根据其C端的... 详细信息

结核分枝杆菌是造成结核病的主要病原,结核病作为一种世界性的疾病,在全世界范围内造成了巨大的精神和物质伤害。在完成结核分枝杆菌群基因组测序后,发现了一个在全基因组中占有10%的比重的一个家族---pe和ppe家族,而pe家族根据其C端的序列的不同特点分为pe和pe-pgrs亚家族,ppe家族分为ppe-mptr(major polymor phictandem repeats),ppe-svp(with a Gxx SVPxx W motif),ppe-ppw(with a Pxx Pxx W motif)和ppe(with no distinctive features)亚家族,本研究中涉及到的基因Wag22属于pe-pgrs亚家族,该家族特点是C端序列的高GC含量(≥60%)且含有非常多的GC重复序列,这就增大了体外扩增目的基因的难度。只有少量的文献对Wag22有报道,指出Wag22只有在感染宿主后才会表达,且表达产物Wag22蛋白具有纤维连接蛋白活性,可能在结核分枝杆菌感染宿主的早期发挥一定的作用。本研究以卡介苗BCG为亲本菌株,敲除目的基因Wag22后对小鼠巨噬细胞RAW264.7的影响来探讨目的基因在感染宿主时所发挥的作用,同时在获得缺失株的基础上,利用BCG和缺失株建立一个潜伏感染的动物模型。(1)BCG基因缺失株的构建本研究构建了一个分枝杆菌噬菌体,该噬菌体中含有目的基因上下游同源臂和筛选基因Hyg和sac B的同源重组载体,利用噬菌体感染BCG时将同源重组载体注射到BCG细胞内,发生同源重组后利用筛选基因筛选出阳性克隆子,最后用PCR的方法对阳性克隆子进行鉴定,将鉴定正确的阳性克隆子进行测序,检测目的基因区域的序列。最后成功获得BCG基因缺失株BCG?Wag22。(2)缺失株BCG?Wag22表型的变化成功获得突变株后,我们对突变株和BCG进行了菌落形态、生长曲线、细胞毒性、抗吞噬和存活能力的检测。发现缺失Wag22后菌落形态和生长曲线没有明显差异,但在抗吞噬和存活能力检测方面,BCG?Wag22更易被吞入巨噬细胞内,吞入细胞后,在胞内的存活率没有差别。而细胞毒性方面缺失株对细胞的毒性稍大一些,这些表型的变化可能代表缺失株BCG?Wag22更容易进入宿主并长期在宿主内存在,刺激机体产生长期的免疫力。(3)蛋白Wag22的体外表达由于Wag22只在感染宿主后才表达,所以我们对目的基因进行体外原核表达,选取p ET-28a原核表达载体成功构建了Wag22-p ET-28a质粒,在体外获得了包涵体蛋白,并对包涵体蛋白进行复性,获得了复性后的Wag22蛋白。但由于蛋白的浓度过低无法进行下一步实验,我们会尝试其他的表达方法完成这个实验。(4)潜伏感染动物模型的建立我们利用缺失株BCG?Wag22和BCG来建立潜伏感染模型,选择的实验动物为6-8周龄雌性BABL/C小鼠,以尾静脉注射的方式向小鼠体内注入5×105CFU/200μL的细菌,在两个月的实验时间内观察结核病典型病变-肉芽肿,我们选取了三个时间段进行观察,我们得到的观察结论是,突变株组与BCG组引起类似的病变,病变部位主要集中在脾脏和肝脏,心、肺、肾等脏器并未发现明显病变,而在这个过程中也并未出现肉芽肿组织,但我们对细胞因子IL-2、IL-6、INF-γ和TNF-α的检测方面发现突变组能引起更强烈的IL-6、INF-γ和TNF-α的表达,这代表缺失株BCG?Wag22能引起机体更强的免疫反应。

关键词：结核分枝杆菌 pe/ppe Wag22 基因缺失潜伏感染

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