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Targeting deubiquitinase OTUB1 protects vascular smooth muscle cells in atherosclerosis by modulating pdgfrβ

Frontiers of Medicine 2024年第3期18卷 465-483页

作者： Fei Xu Han Chen Changyi Zhou Tongtong Zang Rui Wang Shutong Shen Chaofu Li Yue Yu Zhiqiang Pei Li Shen Juying Qian Junbo Ge Department of Cardiology and Laboratory of Heart Valve Disease West China HospitalSichuan UniversityChengdu610041China Department of Cardiology Zhongshan HospitalFudan UniversityResearch Unit of Cardiovascular Techniques and DevicesChinese Academy of Medical SciencesShanghai200032China Shanghai Institute of Cardiovascular Diseases Shanghai200032China National Clinical Research Center for Interventional Medicine&Shanghai Clinical Research Center for Interventional Medicine(19MC1910300) Shanghai200032China

Atherosclerosis is a chronic artery disease that causes various types of cardiovascular *** smooth muscle cells(VSMCs),the main components of atherosclerotic plaque,switch from contractile to synthetic phenotypes during *** is crucial in regulating VSMC phenotypes in atherosclerosis,and it can be reversely regulated by ***,the specific effects of deubiquitinases on atherosclerosis have not been thoroughly *** this study,RNAi screening in human aortic smooth muscle cells was performed to explore the effects of OTU family deubiquitinases,which revealed that silencing OTUB1 inhibited PDGF-BB-stimulated VSMC phenotype *** in vivo studies using Apoe−/−mice revealed that knockdown of OTUB1 in VSMCs alleviated atherosclerosis plaque burden in the advanced stage and led to a stable plaque ***,VSMC proliferation and migration upon PDGF-BB stimulation could be inhibited by silencing OTUB1 in *** RNA-sequencing data indicated that knocking down OTUB1 influenced VSMC differentiation,adhesion,and *** spectrometry of ubiquitinated protein confirmed that proteins related to cell growth and migration were differentially ***,we found that OTUB1 recognized the K707 residue ubiquitylation of pdgfrβwith its catalytic triad,thereby reducing the K48-linked ubiquitylation of pdgfrβ.Inhibiting OTUB1 in VSMCs could promote pdgfrβdegradation via the ubiquitin–proteasome pathway,so it was beneficial in preventing VSMCs’phenotype *** findings revealed that knocking down OTUB1 ameliorated VSMCs’phenotype switch and atherosclerosis progression,indicating that OTUB1 could be a valuable translational therapeutic target in the future.

关键词： atherosclerosis vascular smooth muscle cell ubiquitylation deubiquitinase OTUB1 pdgfrβ

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A pdgfrβ-targeting nanodrill system for pancreatic fibrosis therapy

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Chinese Chemical Letters 2024年第10期35卷 353-359页

作者： Han Han Bi-Te Chen Jia-Rong Ding Jin-Ming Si Tian-Jiao Zhou Yi Wang Lei Xing Hu-Lin Jiang State Key Laboratory of Natural Medicines Department of PharmaceuticsChina Pharmaceutical UniversityNanjing 210009China College of Pharmacy .Yanbian UniversityYanji 133002China Department of Nephrology Changhai HospitalNaval Medical UniversityShanghai 200433China

Activated pancreatic stellate cells(PSCs)are the main source of collagen layer deposition and the key target in pancreatic ***,no effective treatment specific to pancreatic fibrosis clinically,owing to the drug accumulation blocked by the collagen barrier and thus it is difficult to inhibit activated PSCs ***,a PSCs-targeting nano-system based on“nanodrill”strategy(LA-PC)was designed to enhance the accumulation of all-trans retinoic acid(ATRA)in PSCs,relying on the platelet-derived growth factor receptor beta(pdgfrβ)-targeting peptide(p PB:C*SRNLIDC*)and collagenase(Col).After being injected into fibrotic mice via tail vein,the Col modified on LA-PC can remove the excess collagen layer,and the drug delivery efficiency through pPB targeting peptide was more than 5 times higher than that of free ATRA,as well as the degree of fibrosis significantly ***,this nano-system effectively inhibited platelet-derived growth factor subunit B(PDGF-BB)/pdgfrβaxis on PSCs via a down-regulated extracellular signal-regulated protein kinase(ERK)pathway,and accordingly reduced the level of ***,the smart platform provided a promising strategy for the treatment of pancreatic fibrosis to achieve the precise regulation of PSCs.

关键词： Pancreatic fibrosis Pancreatic stellate cells Liposome pdgfrβ pPB peptide

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结直肠癌组织中pdgfrα和pdgfrβ的表达及意义

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癌症 2008年第6期27卷 654-660页

作者：朱浩图韩军马琳中山大学附属第五医院肿瘤化疗科广东珠海519000

背景与目的:血小板衍生生长因子受体α(platelet-derived growth factor receptor-alpha,pdgfrα)和血小板衍生生长因子受体β(platelet-derived growth factor receptor-beta,pdgfrβ)在肿瘤浸润、转移过程中起重要作用,但其与结直肠癌的关系研究甚少。本研究检测结直肠癌组织中pdgfrα和pdgfrβ的表达,并对其与结直肠癌患者临床病理特征和预后的关系进行探讨。方法:采用免疫组化SABC法检测122例结直肠癌组织与17例正常结直肠组织中pdgfrα和pdgfrβ的表达,并分析二者表达与结直肠癌患者临床病理特征及预后的关系。结果:结直肠癌组织中pdgfrα高表达率为68.8%,pdgfrβ高表达率为65.6%,正常结直肠组织中均无高表达。结直肠癌组织中pdgfrα与pdgfrβ表达呈正相关(r=0.416,Ppdgfrα的表达与原发灶分期、淋巴结转移、远处转移及Dukes’分期正相关。pdgfrβ高表达率在Dukes’C和Dukes'D中较Dukes'A和Dukes'B为高(73.8%vs.56.1%,P=0.040)。pdgfrα高表达患者3年总生存率及3年无进展生存率显著低于低表达者(61.5%vs.72.1%,43.2%vs.72.8%,Ppdgfrα阳性表达者3年无进展生存率也显著低于阴性表达者(47.3%vs.72.1%,Ppdgfrα和pdgfrβ的表达不是独立的预后因素。结论:结直肠癌组织中存在pdgfrα和pdgfrβ高表达,pdgfrα和pdgfrβ表达与结直肠癌进展相关。pdgfrα和pdgfrβ的表达不是独立的预后因素。

关键词：结直肠肿瘤血小板衍生生长因子受体 pdgfrα pdgfrβ 免疫组织化学预后

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ST13-pdgfrβ阳性急性髓系白血病1例报告并文献复习

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中华血液学杂志 2023年第8期44卷 676-679页

作者：仇海荣乔纯杨慧郭睿时雨赵晓丽李建勇朱雨南京医科大学第一附属医院江苏省人民医院血液科南京210029

2016年WHO造血与淋巴组织肿瘤分型标准将伴嗜酸性粒细胞增多的髓系/淋系肿瘤中具有pdgfrα、pdgfrβ、FGFR1重排或PCM1-JAK2者作为一个单独亚型定义[1]。嗜酸性粒细胞增多是这组疾病中常见且显著的特征,但在某些病例中缺失。受编码特定... 详细信息

2016年WHO造血与淋巴组织肿瘤分型标准将伴嗜酸性粒细胞增多的髓系/淋系肿瘤中具有pdgfrα、pdgfrβ、FGFR1重排或PCM1-JAK2者作为一个单独亚型定义[1]。嗜酸性粒细胞增多是这组疾病中常见且显著的特征,但在某些病例中缺失。受编码特定酪氨酸激酶基因重排的驱动,激酶结构域被激活,导致细胞信号传导失调,从而促进肿瘤细胞增殖和生存。其对酪氨酸激酶抑制剂(TKI)的敏感性已得到广泛认可。pdgfrβ位于染色体5q32上,该基因编码的蛋白质是血小板源性生长因子家族成员的细胞表面酪氨酸激酶受体,属于Ⅲ型酪氨酸激酶受体家族成员,其在胚胎发育、细胞增殖、存活、分化、趋化和迁移中起着重要的调节作用。目前已发现有40多种pdgfrβ重排对手基因。本文报道首例ST13-pdgfrβ融合基因阳性急性髓系白血病(AML)病例并进行文献复习。

关键词： pdgfrβ 急性髓系白血病嗜酸性粒细胞增多血小板源性生长因子 ST13 FGFR1 酪氨酸激酶受体髓系

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C-kit和pdgfrβ在食管癌组织中的表达及其临床意义

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癌症 2006年第1期25卷 92-95页

作者：张旭戎铁华张玉龙浩傅剑华林鹏张兰军杨名添曾灿光马国伟苏晓东李小东王军业温浙盛赵进明华南肿瘤学国家重点实验室

背景与目的:有研究表明STI-571能抑制Bcr-Abl、C-kit、血小板衍生生长因子受体β(Platelet-derivedgrouthfactorreceptor-beta,pdgfr!)的酪氨酸激酶,从而抑制细胞的分化增殖和促进细胞凋亡,本研究旨在检测与STI-571相关的酪氨酸激酶受... 详细信息

背景与目的:有研究表明STI-571能抑制Bcr-Abl、C-kit、血小板衍生生长因子受体β(Platelet-derivedgrouthfactorreceptor-beta,pdgfr!)的酪氨酸激酶,从而抑制细胞的分化增殖和促进细胞凋亡,本研究旨在检测与STI-571相关的酪氨酸激酶受体在食管癌中的表达情况。方法:应用免疫组化的方法,检测50例食管癌组织、癌旁组织和正常组织中与STI-571相关的酪氨酸激酶受体C-kit和pdgfrβ的表达。结果:C-kit在癌组织、癌旁组织、正常组织中的强表达率较低,分别为4%、4%、12%,表达的差异无统计学意义。pdgfrβ在癌组织、癌旁组织、正常组织中的强表达率分别为68%、28%、28%,表达的差异有统计学意义。应用Logistic回归的方法,发现C-kit或pdgfrβ在癌组织、癌旁组织、正常组织中的强表达率与患者的性别、年龄、肿物的分化程度、肿物的浸润深度、肿物的部位、淋巴结转移情况和分期无相关。结论:食管癌组织中pdgfrβ的强表达率较高,且明显高于癌旁组织和正常组织。食管正常组织中C-kit的强表达率较低,癌组织和癌旁组织中C-kit的强表达率更低。

关键词：食管肿瘤 STI-571 C-kit pdgfrβ 治疗应用

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奶牛乳腺炎金黄色葡萄球菌诱导小鼠乳腺组织中TβRⅠ、FGFR2和pdgfrβ的表达

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中国预防兽医学报 2018年第8期40卷 720-725页

作者：毕艳楠王凤龙丁玉林缪增强陈梦娟王金玲内蒙古农业大学兽医学院内蒙古呼和浩特010018 农业部动物疾病临床诊疗技术重点实验室内蒙古呼和浩特010018

为探究TβRⅠ、FGFR2和pdgfrβ对小鼠乳腺组织纤维化的作用,本研究采用奶牛乳腺炎金黄色葡萄球菌(***)感染小鼠乳腺后,分别于感染后1 d、3 d、5 d、7 d、14 d、21 d采集小鼠乳腺组织,应用免疫组化染色检测TβRⅠ、FGFR2和pdgfrβ在小鼠... 详细信息

为探究TβRⅠ、FGFR2和pdgfrβ对小鼠乳腺组织纤维化的作用,本研究采用奶牛乳腺炎金黄色葡萄球菌(***)感染小鼠乳腺后,分别于感染后1 d、3 d、5 d、7 d、14 d、21 d采集小鼠乳腺组织,应用免疫组化染色检测TβRⅠ、FGFR2和pdgfrβ在小鼠乳腺组织细胞中的表达与分布,应用荧光定量PCR和western blot方法检测小鼠乳腺组织中TβRⅠ、FGFR2和pdgfrβm RNA转录水平和这些蛋白的相对表达水平。结果显示,小鼠感染***前期(1 d^5 d) TβRⅠ、FGFR2和pdgfrβ主要在其炎性细胞和乳腺上皮细胞中表达,TβRⅠ、FGFR2和pdgfrβm RNA转录水平和蛋白表达极显著高于对照组(ppdgfrβ在小鼠乳腺成纤维细胞和乳腺上皮细胞中均有表达,TβRⅠ、FGFR2和pdgfrβ的表达极显著高于对照组(ppdgfrβ的表达,从而促进小鼠乳腺纤维化。本研究为深入探究生长因子受体在乳腺纤维化的分子作用机制奠定了基础。

关键词：金黄色葡萄球菌小鼠 TβRⅠ FGFR2 pdgfrβ

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受体型酪氨酸激酶pdgfrβ在毕赤酵母中的表达与纯化

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微生物学通报 2009年第10期36卷 1460-1465页

作者：茆建胜周祥山张元兴华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室上海200237

构建了受体酪氨酸激酶pdgfrβ的融合表达载体pPIC3.5K-pdgfrβ,转化毕赤酵母GS115,通过组氨酸营养缺陷型筛选,G4l8高拷贝菌株筛选,以及摇瓶诱导表达筛选,得到一株高表达pdgfrβ毕赤酵母菌株M3。对该菌株进行5L罐培养,镍柱亲和纯化在250m... 详细信息

构建了受体酪氨酸激酶pdgfrβ的融合表达载体pPIC3.5K-pdgfrβ,转化毕赤酵母GS115,通过组氨酸营养缺陷型筛选,G4l8高拷贝菌株筛选,以及摇瓶诱导表达筛选,得到一株高表达pdgfrβ毕赤酵母菌株M3。对该菌株进行5L罐培养,镍柱亲和纯化在250mmol/L咪唑浓度下洗下pdgfrβ融合蛋白,Western blot验证约为90.08kD,酶联免疫反应检测表明融合表达的pdgfrβ具有高的酪氨酸激酶活性。为筛选其小分子抑制剂奠定了基础。

关键词：受体酪氨酸激酶 pdgfrβ 毕赤酵母表达

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pdgfrβ与CALR突变共表达细胞模型构建与促细胞增殖作用的研究

PDGFRβ与CALR突变共表达细胞模型构建与促细胞增殖作用的研究

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作者：高媛山西医科大学

学位级别：硕士

目的:原发性血小板增多症(Essential Thrombocythemia,ET)是骨髓增殖性肿瘤(Myeloproliferative Neoplasms,MPN)中发病率较高的一种类型。JAK2V617F、MPL、CALR基因突变为该疾病的主要致病基因。研究发现CALR突变ET患者与JAK2V617F突变ET患者在巨核系(血小板)增殖作用方面有所差异,提示CALR突变ET患者可能有其他新的机制参与致病过程。研究发现,造血系统中pdgfrβ较特异表达于巨核系细胞,生理情况下pdgfrβ的活化可促进巨核系的增殖和分化。本课题组前期利用内源性表达pdgfrβ的人巨核细胞株UT7细胞分别构建了过表达CALR突变型及野生型基因的细胞模型,初步证实pdgfrβ参与CALR突变促细胞恶性增殖的过程。本研究旨在通过Ba/F3细胞(小鼠原B淋巴细胞)构建新的细胞模型进一步验证pdgfrβ与CALR突变体对细胞自主增殖的影响及两者的相互作用关系。方法:1、利用逆转录病毒转导系统构建过表达人源pdgfrβ的Ba/F3细胞模型利用RT-PCR获取带MYC标签序列的人源pdgfrβ的CDS区全长,通过酶切、连接及转化构建pdgfrβ逆转录病毒表达载体p REX-IRES-CD4-pdgfrβ。利用脂质体将该表达质粒与包装质粒共转导至293T细胞,收集48h逆转录病毒悬液并感染Ba/F3细胞。通过CD4磁珠分选阳性感染的Ba/F3细胞。利用RT-PCR及Western bolt法鉴定外源pdgfrβ基因及蛋白在Ba/F3细胞中的表达情况。构建的细胞模型命名为Ba/F3-pdgfrβ。2、利用慢病毒转导系统构建过表达CALR突变型及野生型的Ba/F3细胞模型利用RT-PCR分别获取带HA标签序列的CALR Type1、CALR Type2、CALR Wild-Type的CDS区全长,通过酶切、连接及转化分别将三个基因序列构建至慢病毒表达载体p CDH1-MSCV-MCS1-T2A-cop GFP。利用脂质体将构建成功的表达质粒分别与包装质粒共转导至293T细胞,收集48h慢病毒悬液并感染Ba/F3细胞。应用流式分选GFP阳性表达的Ba/F3细胞。利用RT-PCR及Western bolt法鉴定突变型及野生型CALR基因及蛋白在Ba/F3细胞中的表达情况。构建的细胞模型依次命名为Ba/F3-CALR Type1、Ba/F3-CALR Type2、Ba/F3-CALR Wild-Type。3、构建人源pdgfrβ和CALR共表达的Ba/F3细胞模型收集上述方法(1)中的pdgfrβ逆转录病毒悬液分别感染方法(2)中已构建的Ba/F3-CALR Type1/CALR Type2/CALR Wild-Type细胞模型,通过CD4磁珠分选阳性感染的细胞。构建成功的细胞模型分别命名为Ba/F3-pdgfrβ-CALR Type1、Ba/F3-pdgfrβ-CALR Type2、Ba/F3-pdgfrβ-CALR Wild-Type。4、CCK-8法检测各组Ba/F3细胞模型的增殖情况用不含IL-3因子的培养基分别培养Ba/F3、Ba/F3-pdgfrβ、Ba/F3-CALR Type1/CALR Type2/CALR Wild-Type、Ba/F3-pdgfrβ-CALR Type1/CALR Type2/CALR Wild-Type细胞模型。采用CCK-8法检测各组细胞0h、24h、48h、72h的吸光度,每个时间点设六个复孔,实验重复3次。通过标准曲线计算并比较各组细胞的增殖情况。5、免疫共沉淀检测pdgfrβ和CALR突变蛋白之间的相互作用情况培养前期研究已构建的UT7-CALR Type1、UT7-CALR Type2、UT7-CALR Wild-Type细胞模型,收集各组细胞,按10:1体积/质量的比例加入IP裂解/洗涤缓冲液提取各组细胞总蛋白。BCA蛋白含量检测试剂盒测定各组蛋白质浓度。HA抗体分别结合含HA标签蛋白的CALR突变及野生型蛋白,琼脂糖珠免疫沉淀所有CALR蛋白,Westernblot(pdgfrβ抗体)分析pdgfrβ蛋白;反之,pdgfrβ抗体结合UT7内源性表达的pdgfrβ蛋白,琼脂糖珠免疫沉淀pdgfrβ蛋白,Westernblot(HA抗体)分析CALR突变及野生型蛋白。6、荧光蛋白共定位检测pdgfrβ和CALR突变蛋白结合情况依次构建CALR突变及野生型基因的荧光蛋白表达载体(p EGFP-N1-CALR Type1、p EGFP-N1-CALR Type2、p EGFP-N1-CALR Wild-Type)和pdgfrβ基因的荧光蛋白表达载体(p Ds Red2-N1-pdgfrβ)。利用脂质体分别将载体p EGFP-

关键词：骨髓增殖性肿瘤原发性血小板增多症 CALR pdgfrβ

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pdgfrβ调控骨肉瘤细胞有氧糖酵解的机制研究

PDGFRβ调控骨肉瘤细胞有氧糖酵解的机制研究

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作者：唐瑚应重庆医科大学

学位级别：硕士

目的:研究血小板衍生生长因子受体β(Platelet-derived growth factor receptor-beta,pdgfrβ)与骨肉瘤细胞株HOS有氧糖酵解的相关性及调控机制。方法:从GEO数据库下载数据集后采用GSEA、Pearson相关检验和PPI相关分析评估糖代谢基因集... 详细信息

目的:研究血小板衍生生长因子受体β(Platelet-derived growth factor receptor-beta,pdgfrβ)与骨肉瘤细胞株HOS有氧糖酵解的相关性及调控机制。方法:从GEO数据库下载数据集后采用GSEA、Pearson相关检验和PPI相关分析评估糖代谢基因集在骨肉瘤中的富集程度及pdgfrβ与糖酵解靶基因的相关性。运用RNAi技术抑制骨肉瘤细胞株HOS中pdgfrβ的表达或使用外源性配体PDGFBB激活pdgfrβ后,采用q RT-PCR、western blotting检测糖酵解关键基因的m RNA和蛋白表达水平;葡萄糖消耗及乳酸生成实验检测骨肉瘤细胞在常氧条件下的葡萄糖代谢。另外,运用荧光显微镜观察细胞线粒体膜电位(MMP)的变化。随后,联合使用PDGFBB和(或)pdgfrβ的抑制剂Sunitinib、PI3K途径抑制剂LY294002、MEK途径抑制剂U0126、Warburg效应抑制剂DCA处理HOS细胞后,western blotting及糖代谢实验检测pdgfrβ调控骨肉瘤有氧糖酵解的具体机制。结果:1.生物信息学分析表明,与癌旁组织相比,糖酵解基因集在骨肉瘤中明显富集,pdgfrβ与骨肉瘤中部分糖酵解靶基因的表达呈显著正相关。2.抑制pdgfrβ的表达后,q RT-PCR和western blotting结果显示,HOS细胞中关键糖酵解分子GLUT1、PDK1、PFK1、PKM2和LDHA的m RNA和蛋白表达水平均下降;HK2的蛋白表达水平降低,但其m RNA表达水平未出现明显变化。3.抑制pdgfrβ的表达后,葡萄糖消耗实验及乳酸生成实验观察到HOS细胞对葡萄糖的消耗量明显降低,乳酸的生成也相应减少。4.抑制pdgfrβ的表达后,MMP出现明显下降。5.使用PDGFBB激活pdgfrβ以后,HOS细胞中关键糖酵解分子GLUT1、PDK1、PFK1、PKM2、LDHA、HK2的表达水平随时间逐渐增加。6.使用PDGFBB处理HOS细胞后,葡萄糖消耗及乳酸生成实验观察到细胞对葡萄糖的消耗及乳酸的生成明显增加。7.使用PDGFBB处理细胞后,HOS细胞内MMP随刺激时间的增加逐渐增加。8.抑制pdgfrβ的表达后,western blotting显示细胞总的及核内c-Myc的表达降低,而使用PDGFBB处理细胞后,转录因子c-Myc的表达呈时间依赖性增加。9.联合使用PDGFBB、pdgfrβ抑制剂Sunitinib、PI3K通路抑制剂LY294002、MEK通路抑制剂U0126处理细胞及Warburg效应抑制剂DCA处理细胞24 h,western blotting结果表明PDGFBB/pdgfrβ主要通过激活PI3K/AKT/m TOR通路介导c-Myc的表达,并促进骨肉瘤细胞的有氧糖酵解。结论:pdgfrβ对骨肉瘤细胞HOS有氧糖酵解有显著的正调控作用,且pdgfrβ诱发的有氧糖酵解并非继发于胞内线粒体功能受损。PDGF/pdgfrβ信号主要通过PI3K/AKT/m TOR/c-Myc通路对骨肉瘤细胞的有氧糖酵解进行调控。

关键词： pdgfrβ 骨肉瘤代谢重编程有氧糖酵解 c-Myc

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pdgfrβ对肾母细胞瘤有氧糖酵解的调控及其机制研究

PDGFRβ对肾母细胞瘤有氧糖酵解的调控及其机制研究

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作者：郭佳琪重庆医科大学

学位级别：硕士

目的:研究血小板衍生生长因子受体β（Platelet-derived growth factor receptor-beta,pdgfrβ）对肾母细胞瘤G401细胞生物学特性的影响及调控有氧糖酵解的具体机制。方法:通过外源性配体PDGF-BB激活或小干扰RNA抑制pdgfrβ,CCK-8实验... 详细信息

目的:研究血小板衍生生长因子受体β（Platelet-derived growth factor receptor-beta,pdgfrβ）对肾母细胞瘤G401细胞生物学特性的影响及调控有氧糖酵解的具体机制。方法:通过外源性配体PDGF-BB激活或小干扰RNA抑制pdgfrβ,CCK-8实验检测细胞增殖能力,Western blot结合流式细胞术分析细胞周期及周期蛋白的变化,Transwell实验和伤口愈合实验检测细胞侵袭迁移能力,Western blot和免疫荧光技术检测EMT相关基因的变化。其次,q RT-PCR结合Western blot检测糖酵解相关酶HK2、PKM2、LDHA和PDK1的表达,酶活性试剂盒检测HK、PK和LDH的活性,根据细胞外葡萄糖和乳酸浓度的变化趋势分析糖代谢水平。Western blot分析pdgfrβ对PI3K/AKT/m TOR通路蛋白的影响。联合使用PDGF-BB与PI3K抑制剂LY-294002、有氧糖酵解抑制剂DCA或pdgfrβ抑制剂Sunitinib,糖代谢实验结合Western blot分析pdgfrβ调控G401细胞有氧糖酵解的具体机制;最后将PDGF-BB与PKM2抑制剂C3K、HK2抑制剂2-DG或PDK1抑制剂DCA联合处理细胞,通过糖代谢实验筛选pdgfrβ调控有氧糖酵解过程中的关键酶,并用所筛选酶的激活剂进一步验证。结果:***-BB促进G401细胞增殖,15 ng/m L PDGF-BB促增殖作用最显著;抑制pdgfrβ后,细胞增殖能力降低;2.细胞周期结果显示,PDGF-BB处理G401细胞后,G1期和S期细胞数变化最为明显。进入G1期的细胞数逐渐增多,进入S期细胞数逐渐减少,而G2期在72 h才出现降低趋势。Western blot结果发现,G1期和S期相关蛋白Cyclin E2、CDK2和Cyclin A1表达均上调,提示PDGF-BB可能通过促进G401细胞S期进程来促进细胞增殖;在抑制pdgfrβ后,S期细胞数增多,S期相关蛋白Cyclin A1和CDK2蛋白表达量减少,提示发生S期阻滞;***-BB刺激促进G401细胞侵袭迁移,抑制pdgfrβ表达后细胞侵袭迁移能力则降低;***-BB刺激后,G401细胞E-cadherin下调,vimentin、snail和α-SMA表达上调,促进EMT进程;抑制pdgfrβ后趋势与之相反;5.糖酵解相关实验表明,PDGFBB促进HK2、PKM2、LDHA和PDK1 m RNA和蛋白的表达,同时提高HK、PK和LDH活性,G401细胞对葡萄糖的利用增多,乳酸生成增多;抑制pdgfrβ后有氧糖酵解相关酶的表达及活性均降低,细胞消耗的葡萄糖减少,乳酸生成也减少;***-BB处理细胞后检测PI3K/AKT/m TOR通路蛋白发现,p-PI3K、p-AKT、p-m TOR表达增加,且磷酸化水平随时间逐渐升高;抑制pdgfrβ后磷酸化水平降低。而总的PI3K、AKT、m TOR蛋白均不受影响;7.用LY-294002、DCA和Sunitinib分别预先阻断PI3K通路、有氧糖酵解和pdgfrβ后发现,pdgfrβ可通过PI3K/AKT/m TOR通路来调节有氧糖酵解从而促进肾母细胞瘤EMT进程;8.使用2-DG、C3K和DCA分别预先阻断HK2、PKM2和PDK1后再加PDGF-BB,通过比较分析乳酸和葡萄糖水平发现,预先阻断PKM2后有氧糖酵解受抑制程度最大;9.联合使用pdgfrβ抑制剂Sunitinib、PKM2抑制剂C3K及PKM2激活剂DASA-58处理G401细胞,糖代谢实验发现DASA-58可逆转Sunitinib对G401细胞有氧糖酵解的抑制作用,且C3K和Sunitinib联合使用对有氧糖酵解的抑制作用比两者单独使用的抑制作用大。结论:pdgfrβ可影响肾母细胞瘤G401细胞的生物学特性,且PDGF-BB/pdgfrβ可通过PI3K/AKT/m TOR通路调节有氧糖酵解从而促进肾母细胞瘤EMT进程,其中PKM2是pdgfrβ调控有氧糖酵解途径的关键酶。

关键词： pdgfrβ 有氧糖酵解上皮-间质转化肾母细胞瘤

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