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大鼠被动吸烟气道磷酸二酯酶4d和白细胞介素-8的关系研究

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临床肺科杂志 2010年第11期15卷 1570-1573页

作者：李莉王向东四川省科学城医院四川绵阳621900

目的观察香烟介导的大鼠慢性支气管炎气道磷酸二酯酶4d(pde4d)与白细胞介素-8(interleukin-8,IL-8)相互关系。方法烟雾吸入建立大鼠慢性支气管炎模型,两组干预组(低剂量和高剂量)大鼠香烟吸入之前分别给予腹腔内注射甲基强的松龙1mg/kg... 详细信息

目的观察香烟介导的大鼠慢性支气管炎气道磷酸二酯酶4d(pde4d)与白细胞介素-8(interleukin-8,IL-8)相互关系。方法烟雾吸入建立大鼠慢性支气管炎模型,两组干预组(低剂量和高剂量)大鼠香烟吸入之前分别给予腹腔内注射甲基强的松龙1mg/kg和10mg/kg,均1次/d。采用免疫组化检测气管及肺气道上皮pde4d表达的变化;收集支气管肺泡灌洗液(BALF)进行细胞计数及分类;ELISA检测BALF中IL-8和肿瘤坏死因子-α(tumournecrosis factor alpha,TNF-α)浓度的变化。结果与对照组相比,吸烟显著增加大鼠气管与肺组织气道黏膜上皮pde4d的表达,且pde4d阳染增加与BALF中IL-8和TNF-α释放量增加呈正相关。甲强龙干预后,pde4d蛋白阳染减低,BALF中IL-8和TNF-α释放减少;增大甲强龙剂量,pde4d和IL-8浓度进一步减少,以上差异均具有统计学意义(P0.05)。结论香烟烟雾诱导后,大鼠气道pde4d活性迅速上升,BALF中IL-8和TNF-α浓度增加;运用甲强龙干预后,pde4d被抑制并下调TNF-α活性进而减少IL-8的释放,减轻气道炎症。

关键词： pde4d IL-8 吸烟甲基强的松龙大鼠

Ano5基因敲除小鼠成骨增强机制的初步研究

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北京口腔医学 2022年第2期30卷 93-97页

作者：马欣荣李鸿宇刘秀董蕊胡颖首都医科大学口腔医学院口腔医学研究所北京100050 首都医科大学教育处北京100050

目的初步探讨导致Ano5基因敲除小鼠(Ano5^(-/-))成骨增强的潜在机制。方法选取出生2~3天小鼠颅骨成骨细胞(mCOB)进行原代培养,CCK-8实验观察细胞增殖能力,荧光探针染色检测胞内Zn^(2+)离子浓度。利用Agilent Mouse lncRNA V3芯片检测12... 详细信息

目的初步探讨导致Ano5基因敲除小鼠(Ano5^(-/-))成骨增强的潜在机制。方法选取出生2~3天小鼠颅骨成骨细胞(mCOB)进行原代培养,CCK-8实验观察细胞增殖能力,荧光探针染色检测胞内Zn^(2+)离子浓度。利用Agilent Mouse lncRNA V3芯片检测12周雄鼠胫骨组织差异表达基因,实时定量PCR(qRT-PCR)检测胫骨组织及m COB成骨分化过程中锌离子转运体和作用相关基因的表达水平。结果Ano5^(-/-)小鼠的mCOB增殖能力明显增强;细胞内Zn^(2+)浓度在成骨分化的第21天升高。锌离子调控基因pde4d在骨组织和m COB成骨分化晚期的表达均下降,介导Zn^(2+)胞内转运的基因Zip-8、Zip-14表达增强,而介导Zn^(2+)胞外转运的基因Znt-5、Znt-7表达均降低。结论Ano5基因敲除后通过调控Zn^(2+)转运体相关基因表达改变成骨细胞内Zn^(2+)浓度,可能造成pde4d-cAMP-CREB轴功能障碍,导致Ano5^(-/-)小鼠成骨功能增强。

关键词： Ano5基因锌离子转运体成骨分化 pde4d

KP-4通过调控miRNA-219a-5p及其靶基因信号通路减脑缺血损伤的作用机制

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KP-4通过调控miRNA-219a-5p及其靶基因信号通路减脑缺血损伤的作...

作者：卢敏仪广东工业大学

学位级别：硕士

研究背景脑卒中（cerebral stroke）是一种具有发病率高、致残率、高死亡率高为特征的急性脑血管疾病,其分为出血性和缺血性脑卒中（其中缺血性脑卒中占约80%）。缺血性脑卒中是由于大脑中出现局部血流的短暂或永久性中断,导致相应区域... 详细信息

研究背景脑卒中（cerebral stroke）是一种具有发病率高、致残率、高死亡率高为特征的急性脑血管疾病,其分为出血性和缺血性脑卒中（其中缺血性脑卒中占约80%）。缺血性脑卒中是由于大脑中出现局部血流的短暂或永久性中断,导致相应区域的脑损伤或脑梗死,进而引起意识、运动、语言等脑功能受损,甚至危机生命。及时溶栓或取栓使堵塞的血管再通,恢复脑部供氧供能是治疗脑缺血的最有效手段。但是血氧供给恢复会造成损伤部位的继发的脑缺血损伤,即脑缺血再灌注（Ischemia-reperfusion,I/R）损伤。I/R损伤过程是一个复杂的级联反应,涉及多种损伤机制,如细胞内Ga2+超载,氧化应激,兴奋性氨基酸毒性,线粒体供能受损,炎症小体形成,炎症通路及各种膜受体以损伤相关分子模式被激活等,多种因素导致细胞凋亡、自噬。目前,能够有效治疗脑缺血再灌注损伤的方法和药物十分有限,因此其发病机制及防治措施的研究仍是亟待解决的科学问题。microRNAs（miRNA）是一类长度约为22个核苷酸的非编码小RNA。miRNAs在个体发育、细胞增殖、分化、衰老及肿瘤形成等多种生理、病理过程中都起到重要的调控作用。近年来研究指出,miRNAs参与脑卒中的发生、发展过程。既往研究已证实,miRNAs通过与靶基因mRNA（messenger RNA）的3’非编码区（3’Untranslated Region,3’UTR）相结合导致mRNA的降解或翻译抑制,而且miRNA的转录后效应更快,并能同时调节下游许多靶基因。因此,miRNAs可能是治疗脑卒中潜在靶点。本团队研发的植物单体新药KP-4是异甜菊醇的衍生物,具有比较理想的水溶性以及生物利用度。已有证明KP-4对大脑中动脉栓塞再灌注（Middle cerebral artery occlusion/reperfusion,MCAO/R）小鼠具有神经保护作用,同时也有研究表明KP-4能通过miRNA-181b/CYLd对小鼠局灶性脑缺血发挥神经保护作用。但是KP-4是一个多靶点药物,而且其保护作用的机理还没有完全阐明,因此本课题的研究意义在于更加深入的探究KP-4在脑缺血再灌注损伤中对miRNA的影响以及其潜在的作用机制。从而为KP-4临床给药带来新的理论及实验基础,同时也为寻找脑缺血标志物和潜在的药物靶点提供了新思路。目的本研究旨在探究KP-4对缺血再灌注损伤中异常miRNA及miRNA靶基因的影响,并研究其潜在的分子作用机制。方法1.通过脑梗死体积变化、病理学改变、行为学变化构建小鼠MCAO/R损伤模型以及确定KP-4体内给药浓度;同时通过CCK8、流式细胞分析构建N2a细胞氧糖剥夺再复灌（Oxygen-glucose deprivation/reperfusion,OGd/R）损伤模型及确定 KP-4 体外给药浓度。2.通过 miRNA测序、Western Blot（WB）、Real-time PCR（RT-PCR）、流式细胞分析等方法,在体内外水平探究KP-4对miRNA的影响及对miRNA的作用进行分析;3.利用生物信息学分析、细胞转染、WB、荧光素酶报告基因实验对miR-219a-5p的靶基因进行筛选及验证;***、RT-PCR、流式细胞分析等方法分析miR-219a-5p/pde4d信号通路的作用及KP-4对此信号通路的影响。结果1.在体内外水平发现,KP-4对缺氧/缺血再灌注损伤发挥保护作用;2.在缺氧/缺血再灌注损伤过程中,KP-4能够通过上调miR-219a-5p表达对体内外缺氧/缺血再灌注损伤发挥保护作用;***-219a-5p可通过作用于pde4d-3’UTR的靶序列靶向调节pde4d的表达;***-4能通过miR-219a-5p/pde4d信号通路对OGd/RN2a细胞发挥神经保护作用。

关键词：缺血/缺氧再灌注损伤 KP-4 miR-219a-5p pde4d

miR-1904对小鼠肝癌细胞生物学特性的影响

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miR-1904对小鼠肝癌细胞生物学特性的影响

作者：刘佳朋哈尔滨工业大学

学位级别：硕士

pde4d基因位于小鼠13号染色体上,其编码产物pde4d(磷酸二酯酶4d)可以特异性降解c AMP,因而细胞的生命活动中发挥重要作用。miR-1904定位于小鼠pde4d第8内含子内,是一种内含子micro RNA。鉴于目前对miR-1904靶基因及功能研究较少,本论文... 详细信息

pde4d基因位于小鼠13号染色体上,其编码产物pde4d(磷酸二酯酶4d)可以特异性降解c AMP,因而细胞的生命活动中发挥重要作用。miR-1904定位于小鼠pde4d第8内含子内,是一种内含子micro RNA。鉴于目前对miR-1904靶基因及功能研究较少,本论文以miR-1904为研究对象,分析了其在小鼠肝癌细胞中的表达及与宿主基因pde4d的靶向关系,并进一步研究了miR-1904对Hepa1-6细胞生物学行为的影响。首先本文鉴定了miR-1904与宿主基因pde4d之间的靶向关系。首先在Hepa1-6细胞转染miR-1904 mimics,外源性上调miR-1904,定量PCR和western blot检测显示pde4d的m RNA和蛋白质水平都出现了显著性下调;而转染miR-1904 inhibitor后pde4d表达出现显著性上调。随后双荧光素酶报告实验和挽救实验进一步证明pde4d是miR-1904的靶基因。其次本文研究了miR-1904对小鼠肝癌细胞生物学表型的影响。在小鼠肝癌细胞Hepa1-6中上调和抑制miR-1904的表达,检测到miR-1904抑制肝癌细胞的增殖、克隆形成、迁移和侵袭。细胞周期和细胞凋亡实验结果进一步证实了miR-1904是通过促进细胞凋亡而并非改变细胞周期来影响细胞增殖的。体内成瘤实验表明过表达miR-1904的肿瘤无论是生长速率还是肿瘤质量都出现显著性下降,说明miR-1904具有肿瘤抑制子的功能。综上所述,本研究验证了pde4d是miR-1904的靶基因之一,miR-1904表达上调对小鼠肝癌细胞的增殖、迁移、侵袭、克隆形成和体内成瘤能力具有抑制作用,并促进细胞凋亡。说明miR-1904可能作为抑癌miRNA在肿瘤发生和发展中起到作用,为进一步阐明miR-1904的生物学功能奠定了基础。

关键词：肝癌细胞内含子miRNA pde4d miR-1904

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淫羊藿苷抑制非小细胞肺癌生长的机制研究

淫羊藿苷抑制非小细胞肺癌生长的机制研究

作者：吕雅鑫上海中医药大学

学位级别：硕士

目的:考察淫羊藿苷（Icariin）对非小细胞肺癌增殖生长的影响及相关作用机制。方法:1.淫羊藿苷干预肺癌原位荷瘤裸鼠模型中肿瘤生长的体内药效学考察用A549-GFP-luc细胞建立肺癌原位荷瘤裸鼠模型,随机分为3组:模型组,Icariin低剂量（100... 详细信息

目的:考察淫羊藿苷（Icariin）对非小细胞肺癌增殖生长的影响及相关作用机制。方法:1.淫羊藿苷干预肺癌原位荷瘤裸鼠模型中肿瘤生长的体内药效学考察用A549-GFP-luc细胞建立肺癌原位荷瘤裸鼠模型,随机分为3组:模型组,Icariin低剂量（100 mg/kg/d）组和Icariin高剂量（200 mg/kg/d）组,荷瘤第二天开始给药处理,共24天。利用小动物活体成像技术考察Icariin对非小细胞肺癌A549-GFP-luc原位荷瘤裸鼠模型体内肿瘤生长的影响,HE染色检测肺部肿瘤组织病理情况,将3个组别的肿瘤组织进行高通量mi RNAs测序分析;Taqman Micro RNA RT-PCR检测模型组和给药组的肺部瘤组织中mi R-375的表达情况;q RT-PCR和Western blotting检测淫羊藿苷给药后对肺部瘤组织中pde4d和YAP1基因及蛋白表达的影响;ELISA检测淫羊藿苷给药后肺部瘤组织中c AMP含量的变化;Western blotting检测淫羊藿苷给药后对肺部瘤组织中VASP和AKT信号通路的影响。2.淫羊藿次苷Ⅱ干预非小细胞肺癌细胞A549和NCI-H2126的体外机制研究MTT考察淫羊藿苷Ⅱ对A549和NCI-H2126细胞活力的影响;MTT考察淫羊藿次苷Ⅱ对BEAS-2B、A549和NCI-H2126细胞活力的影响;平板克隆法考察淫羊藿次苷Ⅱ对A549和NCI-H2126细胞平板克隆形成的影响;流式细胞术检测淫羊藿次苷Ⅱ对A549和NCI-H2126细胞凋亡的影响;Western blotting检测淫羊藿次苷Ⅱ对A549和NCI-H2126细胞中β-Catenin和Cyclin d1蛋白表达的影响;q RT-PCR检测淫羊藿次苷Ⅱ对A549和NCI-H2126细胞中mi R-375表达的影响;q RT-PCR和Western blotting检测淫羊藿次苷Ⅱ对A549和NCI-H2126细胞中pde4d和YAP1基因及蛋白表达的影响;ELISA检测淫羊藿次苷Ⅱ干预A549和NCI-H2126细胞后胞内c AMP的含量;Western blotting检测淫羊藿次苷Ⅱ干预A549和NCI-H2126细胞后VASP及AKT信号通路的活性。*** R-375/pde4d在非小细胞肺癌中的作用及机制初探Taqman Micro RNA RT-PCR检测mi R-375在正常肺上皮细胞和不同非小细胞肺癌细胞株中的表达情况;q RT-PCR和Western blotting检测pde4d在正常肺上皮细胞和不同非小细胞肺癌细胞株中的表达情况;ELISA检测在正常肺上皮细胞和不同非小细胞肺癌细胞株中的c AMP含量;q RT-PCR检测过表达mi R-375后A549和NCI-H2126细胞中mi R-375的表达情况;MTT考察过表达mi R-375对A549和NCI-H2126细胞活力的影响;Western blotting检测过表达mi R-375对A549和NCI-H2126细胞中β-Catenin、Cyclin d1和Cleaved-PARP1蛋白表达的影响;q RT-PCR和Western blotting检测过表达mi R-375后A549和NCI-H2126细胞中pde4d和YAP1基因及蛋白的表达情况;ELISA检测过表达mi R-375后A549和NCI-H2126细胞中c AMP含量的变化;Western blotting检测过表达mi R-375对A549和NCI-H2126细胞中VASP及AKT信号通路的影响;q RT-PCR和Western blotting检测敲低pde4d后A549和NCI-H2126细胞中pde4d基因及蛋白的表达情况;MTT考察敲低pde4d对A549和NCI-H2126细胞活力的影响;ELISA检测敲低pde4d后A549和NCI-H2126细胞中c AMP含量的变化;Western blotting检测敲低pde4d对A549和NCI-H2126细胞中VASP及AKT信号通路的影响。结果:1.在体内水平,淫羊藿苷灌胃给药干预24天后,与模型组比较,给药组均显著抑制A549-GFP-luc细胞肺癌原位荷瘤裸鼠模型中肺部生物发光值,提示淫羊藿苷能够抑制肺部肿瘤的生长。HE染色显示模型组细胞排列紧密,细胞核肥大、畸形,染色加深。而与模型组相比,给药组肺部肿瘤病变面积减少,肺泡基本结构完整,排列整齐。将高通量mi RNAs测序结果进行分析,在模型组和给药组中变化最大的mi RNA列表中筛选出mi R-375进行后期机制研究。淫羊藿苷可使肿瘤组织中的mi R-375表达提高,抑制了其靶基因YAP1的基因和蛋白的表达,同时抑制pde4d的基因和蛋白的表

关键词：非小细胞肺癌淫羊藿苷淫羊藿次苷Ⅱ miR-375 YAP1 pde4d cAMP、VASP信号通路 AKT信号通路