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猪重要腹泻病毒多重qRT-PCR鉴别检测方法及PEDV、pdcov分子流行病学研究

猪重要腹泻病毒多重qRT-PCR鉴别检测方法及PEDV、PDCoV分子流行病...

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作者：周洪槿广西大学

学位级别：硕士

猪肠道冠状病毒(PECoVs)和猪轮状病毒(Po RVs)是常见导致猪腹泻的病毒。PECoVs包括猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪急性腹泻综合征病毒(SADS-CoV)和猪德尔塔冠状病毒(pdcov),它们都能引起相似的猪肠道腹泻症状。... 详细信息

猪肠道冠状病毒(PECoVs)和猪轮状病毒(Po RVs)是常见导致猪腹泻的病毒。PECoVs包括猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪急性腹泻综合征病毒(SADS-CoV)和猪德尔塔冠状病毒(pdcov),它们都能引起相似的猪肠道腹泻症状。轮状病毒A群(RVA)、轮状病毒B群(RVB)、轮状病毒C群(RVC)和轮状病毒H群(RVH)是已知在猪中流行的4种Po RVs。PECoVs或Po RVs间常发生混合感染,建立8种猪腹泻病毒的快速检测方法,对病毒的防控有重要意义。PEDV和pdcov是两种最常见的PECoVs,开展分子流行病学调查,了解它们的遗传变异方向对疫苗的研制和选择具有重要意义。1、猪肠道冠状病毒多重qRT-PCR检测方法的建立及运用猪感染PECoVs后出现类似的临床症状,包括呕吐、腹泻和脱水。本研究根据PEDV N、TGEV M、pdcov M和SADS-CoV N基因设计引物和探针,建立快速检测这4种PECoVs的qRT-PCR方法。该方法对4种病毒的LOD为121 copies/μL,组内和组间试验变异系数均小于2%,具有高特异性、灵敏度和重复性。使用该方法检测2020-2022年从广西多个猪场采集的3236份猪腹泻样本,PEDV、TGEV、pdcov和SADS-CoV的阳性率分别为18.26%、0.46%、13.16%和0.15%,检测结果与先前报道的qRT-PCR方法符合率超过99%。这些结果表明多重qRT-PCR方法为检测PECoVs提供高效准确的技术手段。2、猪轮状病毒多重qRT-PCR检测方法的建立及运用目前在猪中流行包括RVA、RVB、RVC和RVH在内的4种Po RVs,病毒间常发生混合感染。本研究根据RVA、RVB、RVC和RVH的VP6基因设计引物和探针,建立多重qRT-PCR检测方法。该方法对Po RVs的LOD均为15 copies/μL,组内和组间试验的变异系数均小于2%,具有高特异性、灵敏度和重复性。使用该方法检测广西1447份猪腹泻样本,RVA、RVB、RVC和RVH的阳性率分别为42.09%、27.50%、44.23%和13.13%,而且混合感染比单一病毒感染更常见。检测结果与参考方法的符合率在99%以上。结果表明多重qRT-PCR方法为检测猪RVs提供高效准确的技术手段。本研究首次报道猪RVH在我国流行,我们需要更加关注Po RVs的影响。3、2020-2022年广西猪流行性腹泻病毒分子流行病学研究本研究从2020-2022年广西各市的腹泻样本中选择部分PEDV阳性样品进行扩增、克隆和测序,最终得到52株PEDV的S1、M、N基因。序列分析表明,52株PEDV S1、M、N基因的核苷酸及其编码的氨基酸的相似性分别为91.8%-99.9%和89.1%-100%、96.0%-100%和94.2%-100%、95%-100%和94.7%-100%。S1基因编码的氨基酸存在大量变异,而M和N基因编码的氨基酸保守。遗传进化树分析表明52株PEDV大部分属于GⅡ群,而有6株处于S-INDEL群。同时广西毒株间还有潜在同源重组件。本研究表明广西毒株有遗传多样性,应继续加强检测和分子流行病学调查。4、2020-2022年广西猪德尔塔冠状病毒分子流行病学研究本研究从2020-2022年广西猪腹泻样本中选择部分pdcov阳性样品进行扩增、克隆和测序,最终得到32株pdcov的S、M、N基因。32株pdcov与参考毒株的S、M、N基因核苷酸及其编码的氨基酸的相似性均在94.4%以上,表明不同来源的pdcov S、M、N基因相似性高。S基因编码的氨基酸有多个变异位点,而M和N基因编码的氨基酸较保守。遗传进化树分析表明32株pdcov均处于中国毒株所在的GroupⅡ。本研究表明广西pdcov流行毒株的遗传变异特点,为科学防控pdcov提供依据。

关键词：猪肠道冠状病毒猪轮状病毒 qRT-PCR PEDV pdcov分子流行病学

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