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pd0325901, an ERK inhibitor, enhances the efficacy of pd-1 inhibitor in non-small cell lung carcinoma

Acta Pharmaceutica Sinica B 2021年第10期11卷 3120-3133页

作者： Min Luo Yuhui Xia Fang Wang Hong Zhang Danting Su Chaoyue Su Chuan Yang Shaocong Wu Sainan An Suxia Lin Liwu Fu State Key Laboratory of Oncology in South China Collaborative Innovation Center for Cancer MedicineGuangdong Esophageal Cancer InstituteSun Yat-sen University Cancer CenterGuangzhou 510060China Pharmacy College Guangzhou Medical UniversityGuangzhou 510182China

ERK pathway regulated the programmed death ligand-1(pd-L1)expression which was linked to the response of programmed death-1(pd-1)/pd-L1 blockade *** it is deducible that ERK inhibitor could enhance the efficacy of pd-1 inhibitor in cancer *** this study,pd0325901,an oral potent ERK inhibitor,strongly enhanced the efficacy of pd-1 antibody in vitro and in vivo models in non-small cell lung carcinoma(NSCLC)***,pd0325901 or shRNA-ERK1/2 significantly downregulated the pd-L1 expression in NSCLC cells and increased the CD3+T cells infiltration and functions in tumor *** was a positive correlation between the p-ERK1/2 expression and pd-L1 expression in patients with *** the patients with low p-ERK1/2 expression were observed a high response rate of pd-1/pd-L1 blockage *** results demonstrate that pd0325901,an ERK inhibitor,can enhance the efficacy of pd-1 blockage against NSCLC in vitro and in vivo *** the combination of ERK inhibitor such as pd0325901 and pd-1/pd-L1 blockage is a promising regimen and encouraged to be further confirmed in the treatment of patients with NSCLC.

关键词： ERK1/2 pd-L1 pd-1 pd0325901 NSCLC Immunotherapy Targeted therapy Combination therapy

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MEK抑制剂pd0325901显著提高猪胎儿成纤维细胞ssODN介导的HDR效率

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遗传 2019年第4期41卷 327-336页

作者：欧浩李国玲王豪强黄广燕蔡更元李紫聪吴珍芳张献伟华南农业大学动物科学学院国家生猪种业工程技术研究中心广州510642 温氏食品集团股份有限公司新兴527400

基因组DNA发生双链断裂(double strand break, DSB)后主要通过同源定向修复(homologous-directed repair, HDR)和非同源末端连接(nonhomologous end joining, NHEJ)两种途径进行修复,其中单链寡聚核苷酸(single-stranded oligodeoxyribonucleotide, ssODN)介导的同源定向修复是动物基因组常用的基因组定点修饰技术,具有较大的科研和应用价值。为提高猪基因组ssODN介导HDR效率,本研究以猪胎儿成纤维细胞(porcine fetal fibroblasts, PFFs)为研究对象,利用丝裂原活化的细胞外信号调节激酶(mitogen-activated extracellular signal-regulated kinase, MEK)抑制剂pd0325901培养细胞,研究其对HDR效率的影响及作用分子机理。结果显示,pd0325901能显著提高PFFs的G_2期和S期细胞群百分比,减少G_1期细胞群比率,促进HDR修复因子的表达。在最适浓度250 nmol/L时,pd0325901使ssODN介导的GFP报告载体的修复效率提高了58.8%;同时使PFFs基因组位点DMD和ROSA26定点修饰效率分别提高了48.16%和17.64%。本研究表明,MEK抑制剂pd0325901能显著提高猪基因组ssODN介导的同源定向修复效率,为高效制备定点基因修饰动物模型提供了新思路。

关键词： MEK抑制剂同源定向修复(HDR) pd0325901 基因编辑

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Chir99021联合pd0325901对小鼠胚胎干细胞中miRNAs差异表达的影响

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现代药物与临床 2014年第11期29卷 1203-1208页

作者：马一翔上海市第二人民医院上海200011

目的通过研究Chir99021联合pd0325901对小鼠胚胎干细胞中mi RNAs差异表达的影响,为揭示胚胎干细胞的自我更新和分化的机制提供更多线索。方法采用mi RNA基因芯片技术检测Chir99021联合pd0325901处理组和pd0325901处理组mi RNAs的表达谱... 详细信息

目的通过研究Chir99021联合pd0325901对小鼠胚胎干细胞中mi RNAs差异表达的影响,为揭示胚胎干细胞的自我更新和分化的机制提供更多线索。方法采用mi RNA基因芯片技术检测Chir99021联合pd0325901处理组和pd0325901处理组mi RNAs的表达谱差异。选取3倍以上及通过查文献与胚胎干细胞自我更新相关的1.5倍以上3倍以下的mi RNAs,采用实时荧光定量PCR法验证,利用mi RDB、Miranda两个数据库交叉预测差异表达的靶基因,并应用KEGG Pathway进行靶基因功能富集分析。结果与pd0325901单独处理相比,Chir99021联合pd0325901处理组有47种mi RNAs上调1.5倍以上,75种mi RNAs下调1.5倍以上;用实时荧光定量PCR验证差异表达的mi RNAs,结果显示13个mi RNAs与芯片结果相符。靶基因预测分析显示,mi R-466a-5p、mi R-466d-5p处于重要位置,Plcb1、Prkcb处于关键基因位置。结论 Chir99021可引起小鼠胚胎干细胞中的mi RNAs差异表达,差异表达的mi RNAs可能通过调控Plcb1、Prkcb基因而影响胚胎干细胞的自我更新。

关键词： Chir99021 pd0325901 胚胎干细胞 miRNAs 芯片生物信息学分析

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FGF2对小鼠骨稳态的作用研究

FGF2对小鼠骨稳态的作用研究

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作者：温鑫山东农业大学

学位级别：硕士

骨骼是一个不断重塑的动态器官,骨稳态平衡由骨细胞、成骨细胞和破骨细胞共同维持。成骨细胞负责骨基质的合成、分泌与矿化,并最终分化为骨细胞,破骨细胞负责骨的分解与吸收。骨稳态平衡被打破,一系列骨骼疾病便应运而生。当破骨大于成... 详细信息

骨骼是一个不断重塑的动态器官,骨稳态平衡由骨细胞、成骨细胞和破骨细胞共同维持。成骨细胞负责骨基质的合成、分泌与矿化,并最终分化为骨细胞,破骨细胞负责骨的分解与吸收。骨稳态平衡被打破,一系列骨骼疾病便应运而生。当破骨大于成骨时会引起骨量丢失和骨质疏松症,当成骨大于破骨时会造成骨硬化。因此,维持成骨细胞与破骨细胞的功能稳定是预防与治疗骨骼疾病的有效措施。成纤维细胞生长因子2(Fibroblast growth factor 2,FGF2)具有调节骨稳态平衡的作用,但其具体作用机制仍未有研究报道。本课题通过对小鼠骨髓基质细胞(Bone marrow stromal cells,BMSCs)体外培养验证了FGF2对其矿化的作用,并对BMSCs外源添加SSR128129E(SSR)和AZD4547(AZD)以及以灌胃的方式为小鼠给药SSR阻断FGF/FGFRs信号,添加pd0325901(pd)阻断ERK信号来研究它们对FGF2的反转作用,其中SSR和AZD分别是FGFs受体(FGF receptor,FGFR)的变构抑制剂和酪氨酸激酶抑制剂,pd是ERK信号通路的阻断剂。此外我们利用FGF2基因敲除小鼠验证FGF2对骨稳态的影响,主要结果如下:(1)茜素红染色结果显示,外源加入重组FGF2抑制了BMSCs的矿化。AKP与TRAP酶活测定结果显示外源添加FGF2组与对照组相比AKP酶活并无明显差异,但是TRAP酶活高于对照组。(2)Western Blot结果显示,外源加入重组FGF2激活了ERK和CREB的磷酸化,促进了破骨相关基因的蛋白表达,而pd抑制了它们的表达。茜素红染色结果显示,pd阻断了FGF2对BMSCs的矿化抑制作用。染色质免疫共沉淀结果证明p-CREB与Rankl的启动子区域发生结合作用。(3)BMSCs外源添加SSR对FGF2矿化抑制的反转作用比较微弱。而BMSCs外源添加AZD,几乎完全阻断了FGF2的矿化抑制作用。(4)q PCR和Western Blot结果证明,与野生型相比,FGF2基因敲除小鼠的BMSCs破骨相关基因表达和蛋白表达下调,矿化能力更强。FGF2基因敲除小鼠的破骨相关基因表达及ERK蛋白的磷酸化水平下调。(5)给小鼠灌服SSR,结果显示SSR处理组的骨密度、骨矿含量以及腿骨的粗壮程度皆低于对照组。综上所述,我们通过体内外试验,证实了FGF2通过促进破骨细胞生成对骨稳态的负调控作用。FGF2通过激活ERK-CREB信号途径,促进RANKL表达而促进破骨细胞的生成。SSR对FGF2的拮抗作用比较微弱,但AZD、pd在细胞实验中显著抑制了FGF2的作用。本课题研究结果为预防与治疗骨质疏松症提供新靶点,并为研发相关药物提供思路。

关键词： FGF2 骨质疏松症破骨细胞生成 SSR128129E AZD4547 pd0325901

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阿法替尼与MEK抑制剂联合应用于细胞株NCI-H522、A549、UM-SCC-74B、JHU-O28的探索

阿法替尼与MEK抑制剂联合应用于细胞株NCI-H522、A549、UM-SCC-74...

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作者：林小峰广西医科大学

学位级别：硕士

第一部分阿法替尼与MEK抑制剂GSK1120212联合应用于腺癌细胞株NCI-H522和A549【目的】探索阿法替尼与MEK抑制剂GSK1120212联合应用对肺腺癌细胞相关蛋白表达、细胞增殖和凋亡的作用。【材料和方法】1.细胞功能实验,于普通培养皿培养NCI-... 详细信息

第一部分阿法替尼与MEK抑制剂GSK1120212联合应用于腺癌细胞株NCI-H522和A549【目的】探索阿法替尼与MEK抑制剂GSK1120212联合应用对肺腺癌细胞相关蛋白表达、细胞增殖和凋亡的作用。【材料和方法】1.细胞功能实验,于普通培养皿培养NCI-H522和A549细胞株,分别分为三组:单药阿法替尼组、单药GSK1120212组和联合用药组,每组内又接受4种不同的处理。单药阿法替尼组细胞分别用0(即对照组),2.5,5.0,10μMol/L终浓度的阿法替尼处理,单药GSK1120212组细胞分别用0,1.0,2.0,4.0μMol/L终浓度的GSK1120212处理,联合用药组分别用DMSO,5.0μMol/L阿法替尼,2.0μMol/L GSK1120212,5.0μMol/L阿法替尼+2.0μMol/L GSK1120212处理。培养24小时后收集细胞获取蛋白,western blot技术检测p-EGFR、p-AKT、p-S6、p-ERK1/2等蛋白的表达情况。2.细胞增殖实验,用96孔板培养细胞,分3种处理,2组单药处理按0,0.125,0.25,0.5,1.0,2.0μMol/L终浓度进行药物处理,联合用药组采用1:1联合用药处理,每个浓度均设计3个微孔;培养72小时后SRB法测定细胞增殖情况。3.细胞凋亡实验,药物处理同功能实验联合用药组,培养72小时,流式细胞术检测细胞凋亡情况。【结果】1.阿法替尼单独应用可抑制NSCLC NCI-H522、A549细胞株PI3K/AKT/mTOR下游蛋白p-EGFR、p-AKT、p-S6的表达,同时会诱导RAS/MEK/ERK通路关键蛋白p-ERK1/2表达增加。***1120212单独应用可抑制NCI-H522、A549细胞株RAS/MEK/ERK通路关键蛋白p-ERK1/2的表达,同时会诱导PI3K/AKT/mTOR下游蛋白表达增加p-AKT表达增加。3.阿法替尼与GSK1120212联合应用可以起到双通路互补抑制作用,p-AKT、p-S6、p-ERK1/2表达明显被抑制,GSK1120212能增强阿法替尼部分抑制效果。4.阿法替尼与GSK1120212联合应用可以更明显地抑制细胞增殖、促进细胞凋亡。【结论】阿法替尼联合GSK1120212应用起到PI3K/AKT/mTOR、RAS/MEK/ERK双通路抑制的效果,能更好地抑制NCI-H522、A549细胞的生长、增殖,促进细胞凋亡。第二部分阿法替尼与MEK抑制剂pd0325901联合应用于鳞癌细胞株UM-SCC-74B和JHU-O28【目的】探索阿法替尼与MEK抑制剂pd0325901联合应用对鳞癌细胞相关蛋白表达、细胞增殖和凋亡的作用。【材料和方法】1.细胞功能实验,于普通培养皿培养UM-SCC-74B和JHU-O28细胞株,分别分为三组:单药阿法替尼组、单药pd0325901组和联合用药组,每组内又接受4种不同的处理。单药阿法替尼组细胞分别用0(即对照组),2.5,5.0,10μMol/L终浓度的阿法替尼处理,单药pd0325901组细胞分别用0,1.0,2.0,4.0μMol/L终浓度的pd0325901处理,联合用药组分别用DMSO,5.0μMol/L阿法替尼,2.0μMol/L pd0325901,5.0μMol/L阿法替尼+2.0μMol/L pd0325901处理。培养24小时后收集细胞获取蛋白,western blot技术检测p-EGFR、p-AKT、p-S6、p-ERK1/2等蛋白的表达情况。2.细胞增殖实验,用96孔板培养细胞,分3种处理,2组单药处理按0,0.125,0.25,0.5,1.0,2.0μMol/L终浓度进行药物处理,联合用药组采用1:1联合用药处理,每个浓度均设计3个微孔;培养72小时后SRB法测定细胞增殖情况。3.细胞凋亡实验,药物处理同功能实验联合用药组,培养72小时,流式细胞术检测细胞凋亡情况。【结果】1.阿法替尼单独应用可抑制HNSCC UM-SCC-74B和O28细胞株PI3K/AKT/m TOR下游蛋白p-EGFR、p-AKT、p-S6的表达,同时会诱导RAS/MEK/ERK通路关键蛋白p-ERK1/2表达增加。***0325901单独应用可抑制UM-SCC-74B和JHU-O28细胞株RAS/MEK/ERK通路关键蛋白p-ERK1/2的表达,同时会诱导PI3K/AKT/m TOR下游蛋白表达增加p-AKT表达增加。3.阿法替尼与pd0325901联合应用可以起到双通路互补抑制作用,p-AKT、p-S6、p-ERK1/2表达明显被抑制,pd0325901能增强阿法替尼部分抑制效果。4.阿法替尼与pd0325901联合应用可以更明显地抑制细胞增殖、促进细胞凋

关键词：阿法替尼 GSK1120212 联合腺癌细胞增殖凋亡阿法替尼 pd0325901 联合鳞癌细胞增殖凋亡

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MEK通路抑制剂及AR敲除对山羊附睾头细胞gBD104a表达的影响

MEK通路抑制剂及AR敲除对山羊附睾头细胞gBD104a表达的影响

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作者：郭永娟山西农业大学

学位级别：硕士

山羊β-防御素104a(gBD104a)被定位于山羊附睾头上皮细胞、山羊精子头部前端顶体及精子中部的线粒体上,其可能在精子的成熟及获能等生理过程发挥重要作用。但是,目前关于gBD104a的表达调控机制尚不清楚,因此,本试验旨在研究MEK抑制剂及A... 详细信息

山羊β-防御素104a(gBD104a)被定位于山羊附睾头上皮细胞、山羊精子头部前端顶体及精子中部的线粒体上,其可能在精子的成熟及获能等生理过程发挥重要作用。但是,目前关于gBD104a的表达调控机制尚不清楚,因此,本试验旨在研究MEK抑制剂及AR基因敲除对山羊附睾头细胞中gBD104a表达的影响。取15日龄羔羊附睾头组织剪成小块,用胰蛋白酶消化后进行培养,建立附睾头细胞系。通过对体外培养的山羊附睾头细胞培养液中分别添加不同浓度的17β-雌二醇(E2,0.001 ng/mL、0.01 ng/mL、0.1 ng/mL、1ng/mL、10ng/mL、100ng/mL)、二氢睾酮(DHT,10ng/mL、20ng/mL、40 ng/mL、80 ng/mL、160 ng/mL、320 ng/mL)及 MEK 信号通路抑制剂 pd0325901(1.0μM、2.5 μM、5.0 μM、10.0 μμM),处理48 h后用流式细胞仪检测附睾头细胞的活细胞数和凋亡细胞数。同时,收集各处理组的细胞,用荧光定量PCR和Western blotting技术检测gBD104a的mRNA和蛋白表达情况。应用CRISPR/Cas9系统构建了 3个AR基因敲除载体。通过细胞转染,检测敲除AR基因后gBD104a的表达情况。研究结果如下:(1)在附睾头细胞培养液中添加0.1 ng/mL E2处理48 h后,山羊附睾头细胞中gBD104a mRNA的表达量显著高于空白对照组和添加100 ng/mL E2组(Ppd0325901后,山羊附睾头细胞中gBD104amRNA的表达量显著低于添加0.1 ng/mL E2组gBD104a的表达量;添加0.1 ng/mLE2和1.0 μM pd0325901时,gBD104amRNA和蛋白的表达量显著低于对照组(Ppd0325901后,山羊附睾头细胞中gBD104a mRNA和蛋白的表达量均显著高于其它组(Ppd0325901后,山羊附睾头细胞中活细胞的百分率显著低于添加0.1 ng/mL E2组,凋亡率显著高于空白对照组和添加0.1 ng/mL E2组(Ppd0325901时,山羊附睾头细胞中活细胞的百分率显著低于空白对照组和添加160ng/mLDHT组,凋亡率显著高于只添加160ng/mLDHT组(P<0.05)。(4)用构建的3个pCas9/gRNA1 AR基因敲除载体质粒转染山羊附睾头细胞,通过荧光定量PCR和Western blotting检测细胞中AR的表达量,筛选出敲除效果最佳的载体—pCas9/gRNA1-AR-1452。用 pCas9/gRNA1-AR-1452 敲除山羊附睾头细胞AR基因后,gBD104a mRNA和蛋白的表达量显著低于对照组(P<0.05)。综上所述,E2和DHT都可以促进山羊附睾头细胞中gBD104a的表达。E2和DHT通过MEK信号通路调节gBD104a的表达,而且雄激素—雄激素受体途径参与调节gBD104a的表达。

关键词：山羊附睾头细胞 gBD104a E2 DHT pd0325901 R敲除

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