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表达pcv2-cap蛋白和PPV1-VP2蛋白的重组伪狂犬病病毒的构建及其免疫原性研究

表达PCV2-Cap蛋白和PPV1-VP2蛋白的重组伪狂犬病病毒的构建及其免...

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作者：谢永兴中国农业科学院

学位级别：硕士

猪圆环病毒2型(Porcine circovirus 2,pcv2)、猪细小病毒1型(Porcine parvovirus type 1,PPV1)和伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)是三种最重要的猪病原体,并常混合感染,给养猪业造成巨大的经济损失。近年来出现的PRV变异株对伪狂... 详细信息

猪圆环病毒2型(Porcine circovirus 2,pcv2)、猪细小病毒1型(Porcine parvovirus type 1,PPV1)和伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)是三种最重要的猪病原体,并常混合感染,给养猪业造成巨大的经济损失。近年来出现的PRV变异株对伪狂犬病的临床防控提出新的挑战。因此,研制安全有效的防制这三种疫病的疫苗具有重要科学价值。cap蛋白和VP2蛋白分别为pcv2和PPV1的主要免疫保护性抗原,是研制基因工程疫苗理想的靶蛋白。PRV作为活载体表达外源保护性抗原成为基因工程疫苗的研究热点。本研究旨在构建高水平表达pcv2-cap蛋白和PPV1-VP2蛋白的重组伪狂犬病病毒,为防制这三种病毒性疾病提供基因工程候选疫苗株。为了构建表达pcv2-cap蛋白和PPV1-VP2蛋白的重组病毒,选择非必需基因TK基因作为插入位点。以重组质粒pMD18T-LR(TK)-EGFP为骨架,首先将密码子优化的PPV1-VP2基因替换EGFP,构建重组质粒pMD18T-LR(TK)-VP2,同时将PRV-gG信号肽序列与密码子优化的PPV1-VP2基因偶联,构建了重组质粒pMD18T-LR(TK)-VP2(SP)。本试验采用经典的同源重组技术构建重组病毒,利用磷酸钙转染方法将重组病毒rPRV-TK/gE/gG/3cap基因组与pMD18T-LR(TK)-EGFP共转染PK-15细胞,以EGFP作为标记经16轮正向蚀斑克隆筛选和PCR法鉴定,获得纯化重组病毒rPRV-TK/EGFP/gE/gG/2cap;再将其基因组与重组质粒pMD18T-LR(TK)-VP2和pMD18T-LR(TK)-VP2(SP)分别共转染PK-15细胞,经6轮反向蚀斑克隆筛选和PCR鉴定,分别获得纯化的2株重组病毒rPRV-TK/VP2/gE/gG/2cap和pMD18T-LR(TK)-VP2(SP)。IPMA和IFA法分别对2株构建的重组病毒进行鉴定。IPMA结果表明这2株重组病毒均可表达pcv2-cap蛋白和PPV1-VP2蛋白;IFA结果表明重组病毒rPRV-TK/VP2/gE/gG/2cap表达的PPV1-VP2蛋白定位于细胞浆和细胞核,而重组病毒rPRV-TK/VP2(SP)/gE/gG/2cap表达的PPV1-VP2蛋白定位于细胞浆。病毒生长动力学试验结果显示,这2株重组病毒在PK-15细胞上具有较高的增殖滴度,但比亲本PRV-JF株略低。为了验证重组病毒rPRV-TK/VP2/gE/gG/2cap和rPRV-TK/VP2(SP)/gE/gG/2cap在动物体内的免疫原性,免疫接种6周龄健康雌性Balb/c小鼠进行免疫原性试验。通过临床症状观察,检测血清中PRV、pcv2和PPV1抗体水平,对构建的重组病毒在小鼠体内的免疫原性进行评价。免疫重组病毒活毒的小鼠未出现明显的临床症状,表明构建的重组病毒安全性较好。用微量中和试验法检测到重组病毒活毒和灭活重组病毒均能诱导小鼠产生PRV中和抗体,而IPMA法检测pcv2和PPV1抗体,结果显示灭活重组病毒免疫的小鼠检测到低水平的pcv2和PPV1抗体,重组病毒活毒免疫的小鼠未检测到相应抗体的产生。本研究成功构建了2株表达pcv2-cap蛋白和PPV1-VP2蛋白的重组病毒,体外试验证实了重组病毒表达的pcv2-cap蛋白和PPV1-VP2蛋白的抗原反应活性。重组病毒活毒和灭活重组病毒均能诱导小鼠产生PRV抗体,而仅灭活重组病毒诱导小鼠产生低水平的pcv2和PPV1抗体。重组PRV表达的PPV1-VP2和pcv2-cap蛋白免疫原性不良的原因有待进一步探讨。

关键词：猪圆环病毒2型 pcv2-cap蛋白猪细小病毒1型 PPV1-VP2蛋白重组伪狂犬病病毒

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表达pcv2-cap蛋白的TK-/gE-/gG-重组伪狂犬病毒的构建及其免疫原性研究

表达PCV2-Cap蛋白的TK-/gE-/gG-重组伪狂犬病毒的构建及其免疫原...

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作者：夏德利中国农业科学院

学位级别：硕士

猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,pcv2),能够引起多种猪病综合征,其中以断奶仔猪多系统综合征(Postweaning multisystemic wasting syndrome,PMWS)造成的危害最为严重,现统称为猪圆环病毒相关疾病(Porcine circovirus-associated diseases,pcvAD)。猪伪狂犬病(Porcine pseudorabies,PR)是由伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)引起的急性传染病,新生仔猪感染后死亡率高,妊娠母猪出现繁殖障碍,猪场一旦发病,很难根除,严重危害猪场的经济效益。衣壳(capsid,cap)蛋白是pcv2的主要免疫保护性抗原,能刺激动物机体产生针对pcv2的特异性中和抗体,是研制基因工程疫苗理想的靶抗原。近年来,以PRV为活载体表达外源保护性抗原成为兽医基因工程疫苗的研究热点。为了阐明PRV-JF株的遗传背景,通过对其基因组U44(gC)基因进行序列分析,探究PRV-JF株与经典PRV-SC株及近年来流行的PRV变异毒株之间的遗传演化关系。将PRV-JF株与临床病料分离的5株PRV和30个GenBank下载的gC基因序列进行分析表明,这6株PRV与2012年以后流行的毒力增强的变异毒株处于同一分支;这些毒株的氨基酸同源性为98.7%00%,而与经典的PRV-SC毒株的氨基酸同源性仅为93.2%4.0%。PRV毒株gC蛋白第520位氨基酸为高变区,尤其第640位出现7个氨基酸(AAASTPA)插入。尽管PRV-JF株分离于2008年,但它与2011年之后分离的变异毒株属于一个分支,不属于经典毒株,表明PRV变异毒株早在2008年前在我国猪群中就开始流行,以PRV-JF毒株作为重组病毒的亲本有助于PRV变异毒株的防控。为了进一步提高重组病毒株rPRV-JF-TK/gE/2cap中的cap蛋白的表达量,选择非必需基因U4作为新的插入位点。本试验采用经典的基因同源重组技术构建重组病毒,通过磷酸钙转染方法将pMD-EGFP-LR(gG)与重组病毒株rPRV-JF-TK/gE/2cap基因组共转染猪肾细胞系(PK-15),经同源重组将U4基因替换为EGFP表达盒,经20轮蚀斑克隆纯化、PCR法鉴定,获得重组病毒rPRV-JF-TK/g E/2cap/gG/EGFP;以克隆的重组病毒为亲本,将重组转移载体pMD-cap-LR(gG)与病毒基因组共转染PK-15细胞,反向筛选没有绿色荧光的病毒蚀斑,经6轮蚀斑克隆、PCR法鉴定,最终获得含有3个pcv2-cap表达盒的3基因缺失重组病毒株(rPRV-JF-TK/gE/gG/3cap)。为了与rPRV-JF-TK/g E/2cap相鉴别,在U4位置表达的pcv2-cap蛋白C末端插入了flag标签,用pcv2-cap蛋白特异性单抗与抗flag标签单抗,经IPMA与IFA试验法检测均能够在U4位置表达pcv2-cap-flag蛋白。为了验证rPRV-JF-TK/gE/g G/3cap在动物体内的免疫原性,选用了6周龄健康仔猪进行免疫攻毒试验。通过临床症状观察,检测血清中PRV和pcv2抗体水平,对构建的重组病毒表达pcv2-cap在猪体内的免疫原性进行了评价。用IDEXX PRV gB试剂盒检测到针对PRV-gB抗体,随着时间推移,抗体滴度逐渐增高;然而用IPMA法对pcv2抗体检测结果显示,免疫后28 d未检测出针对pcv2-cap蛋白的抗体,表明构建的重组病毒株表达的pcv2-cap蛋白抗原在猪体内没有产生良好的免疫应答。本研究成功地构建了3基因缺失的重组病毒株rPRV-JF-TK/gE/gG/3cap,体外试验证实了该毒株能够表达pcv2-cap蛋白抗原,利用构建的重组病毒株免疫仔猪后仅能产生针对PRV的抗体应答,未产生针对外源的pcv2-cap蛋白抗原免疫应答,导致该重组毒株PRV表达pcv2-cap蛋白的免疫原性不良的原因有待进一步探索。

关键词：猪圆环病毒2型 pcv2-cap蛋白重组伪狂犬病病毒免疫原性

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表达猪圆环病毒Ⅱ型cap蛋白的伪狂犬重组病毒的构建及其免疫原性研究

表达猪圆环病毒Ⅱ型Cap蛋白的伪狂犬重组病毒的构建及其免疫原性...

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作者：张白玉四川农业大学

学位级别：硕士

猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪圆环病毒2型(pcv2)分别引起猪伪狂犬病和猪圆环病,对我国猪养殖业造成了重大经济损失且严重阻碍了猪养殖业发展,被国家农业农村部归为二类动物疫病。近年来猪伪狂犬病病毒出现了新的变异毒株,其传染性及病毒毒... 详细信息

猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪圆环病毒2型(pcv2)分别引起猪伪狂犬病和猪圆环病,对我国猪养殖业造成了重大经济损失且严重阻碍了猪养殖业发展,被国家农业农村部归为二类动物疫病。近年来猪伪狂犬病病毒出现了新的变异毒株,其传染性及病毒毒力均强于经典毒株,导致Bartha-k61免疫猪群仍出现PRV大流行的态势;pcv2攻击猪的免疫系统,引发免疫抑制,常常呈现出与PRV、PRRSV、PEDV及某些细菌性病原体混合或继发感染,使防控难度更大。本研究以变异株PRV为基础材料,构建携带pcv2-ORF2基因的减毒PRV活载体病毒,并研究其免疫原性,研究结果如下:1.重组病毒PRV-FJ01 TK/g I/g E/2cap的构建基于CRISPR/Cas9基因编辑技术及同源重组原理,设计针对PRV-FJ01TK、g I、g E基因的Sg RNA并构建出带有e GFP及cap表达盒的转移载体p UC19-TK/e GFP、p UC19-TK/cap、p UC19-g I/g E/e GFP、p UC19-g I/g E/cap,旨在对PRV-FJ01进行三基因敲除的同时,将两个cap表达盒分别嵌合在TK基因和g I～g E位点。首先将PRV-FJ01与p UC19-TK/e GFP、p X459-TK-Sg RNA1及p X459-TK-Sg RNA2共转染PK-15细胞,挑取单个绿色荧光的噬斑,经噬斑纯化得到重组病毒PRV-FJ01 TK/e GFP。其次将重组病毒PRV-FJ01 TK/e GFP与质粒p UC19-TK/cap共转染PK-15细胞,挑取无荧光的单个噬斑,分离得到重组病毒PRV-FJ01 TK/cap。同理,对PRV-FJ01TK/cap进行g I和g E基因的敲除及e GFP基因的替换,构建重组病毒PRV-FJ01TK/g I/g E/e GFP/cap。利用同源重组替换e GFP基因,挑取单个噬斑进行数轮纯化并基因测序,最终成功构建出嵌合两个cap表达盒的重组病毒PRV-FJ01TK/g I/g E/2cap。PCR鉴定重组病毒TK、g I、g E基因均为阴性,测序结果表明TK、g I、g E基因被pcv2-ORF2基因成功替换。对小鼠接种重组病毒后进行PRV g B、g E抗体ELISA检测结果为g E抗体阴性、g B抗体阳性,表明重组病毒能诱导小鼠产生免疫应答反应并且野毒标志基因g E无表达。通过Western blotting对重组病毒PRV-FJ01 TK/cap及PRV-FJ01 TK/g I/g E/2cap分别进行pcv2-cap蛋白的检测,其结果表明仅PRV-FJ01 TK/g I/g E/2cap表达cap蛋白,说明g I、g E处嵌合的cap表达盒成功表达,而TK位点处的cap表达盒未表达。2.重组病毒PRV-FJ01 TK/g I/g E/2cap免疫原性研究对亲本毒株PRV-FJ01和重组病毒PRV-FJ01 TK/g I/g E/2cap进行TCID测定,其TCID分别为10TCID/m L和10TCID/m L。分别测定重组病毒PRV-FJ01TK/g I/g E/2cap及亲本株PRV-FJ01不同时间段的TCID并绘制病毒一步生长曲线,结果表明重组病毒PRV-FJ01 TK/g I/g E/2cap生长动力学低于亲本株PRV-FJ01。小鼠安全性实验表明重组病毒不引起小鼠出现发热、精神沉郁及瘙痒等临床症状,对小鼠具有安全性。重组病毒免疫家兔后,在第7d、14d、21d分别采血测定血清对亲本株PRV-FJ01的中和效价,测出其中和抗体效价分别可达2、2和2。同时ELISA实验表明第7d、14d、21d均测得cap抗体为阳性。小鼠保护性试验表明,当使用10TCID的亲本株PRV-FJ01侵袭小鼠时,10TCID的Bartha-k61疫苗株无法为小鼠提供完全保护,接毒后仍有20%的小鼠死亡,而10TCID的PRV-FJ01TK/g I/g E/2cap可为小鼠提供完全保护,小鼠全部存活且不表现临床症状。

关键词：猪伪狂犬FJ01株 CRISPR/Cas9系统 pcv2-cap蛋白重组病毒免疫原性

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