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pcv1-2m嵌合病毒Taqman荧光定量PCR检测方法的建立及其初步应用

中国兽医学报 2020年第11期40卷 2113-2118页

作者：吴好叶梁海英曾智勇汤德元王彬黄涛陈娟黄二素祝羊徐玉徐松平贵州大学动物科学学院贵州贵阳550025

为确定感染性克隆质粒免疫小鼠拯救获得的病毒量与诱导抗体之间的关系,以选择最佳免疫剂量,本研究建立了一种快速、灵敏的Taqman荧光定量PCR检测方法。根据pcDNA3.1(+)-pcv1-2m-V5质粒的ORF2和V5标签序列设计特异性引物和探针,并将该质... 详细信息

为确定感染性克隆质粒免疫小鼠拯救获得的病毒量与诱导抗体之间的关系,以选择最佳免疫剂量,本研究建立了一种快速、灵敏的Taqman荧光定量PCR检测方法。根据pcDNA3.1(+)-pcv1-2m-V5质粒的ORF2和V5标签序列设计特异性引物和探针,并将该质粒作为阳性标准品,优化荧光定量PCR条件后,按10倍倍比稀释,建立标准曲线,进行灵敏性、特异性和稳定性验证;而后,应用该方法对免疫不同质粒浓度的6组小鼠,分别在免疫后1~9周进行病毒血症检测;同时,应用ELISA方法分别对pcv2抗体滴度进行检测。结果表明,试验建立的荧光定量PCR方法具有良好的灵敏性、特异性和稳定性,检测范围可达1.29×10^1~1.29×10^9拷贝/μL;病毒血症可持续至第5周,抗体可维持至第8周。通过分析抗体滴度变化与病毒载量消长关系,确定使用200μg作为小鼠的最佳免疫剂量。本试验为感染性克隆质粒进一步在本体动物(猪)体内评估免疫效果奠定基础。

关键词： pcv1-2m 嵌合病毒 V5标签分子遗传标记荧光定量PCR

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携带V5标签的嵌合猪圆环病毒pcv1-2m感染性克隆质粒免疫小鼠效果研究

携带V5标签的嵌合猪圆环病毒PCV1-2m感染性克隆质粒免疫小鼠效果...

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作者：吴好叶贵州大学

学位级别：硕士

猪圆环病毒(Porcine circovirus,pcv)是圆环病毒科圆环病毒属的成员,系无囊膜病毒,其基因组为单股环状DNA。目前发现4种血清型,分别为pcv1、pcv2、pcv3和pcv4。其中,pcv2可引起断奶仔猪发生多系统衰竭综合征,仔猪先天性震颤,怀孕母猪流... 详细信息

猪圆环病毒(Porcine circovirus,pcv)是圆环病毒科圆环病毒属的成员,系无囊膜病毒,其基因组为单股环状DNA。目前发现4种血清型,分别为pcv1、pcv2、pcv3和pcv4。其中,pcv2可引起断奶仔猪发生多系统衰竭综合征,仔猪先天性震颤,怀孕母猪流产,成年猪的皮炎肾病综合征以及呼吸道疾病综合征等,给世界养猪业造成了严重危害。目前,疫苗免疫是防控pcv2的主要手段,现有商品化的pcv2疫苗均为灭活疫苗或亚单位疫苗,所诱导产生抗体不能与野毒感染产生的抗体相区别,难以将猪体内已感染的pcv2彻底清除。因此,研究开发一种既能激发机体产生体液免疫和细胞免疫,又能区分疫苗免疫抗体和野毒感染抗体,用以防控pcv2相关疫病的新型疫苗,具有重要意义。本研究利用新建立的Taq man荧光定量PCR检测方法,对实验室构建的携带有遗传标记的感染性克隆质粒pc DNA3.1(+)-pcv1-2m-V5(pcv1-2m iDNA)免疫小鼠后pcv1-2m病毒血症进行检测,以确定最佳免疫剂量,进而对pcv1-2m iDNA候选标记疫苗免疫昆明小鼠产生免疫效果进行研究,以期为评估pcv1-2m iDNA候选标记疫苗在本体动物(猪)的免疫效果奠定基础。具体研究内容如下:1、pcv1-2m拯救病毒Taq man荧光定量PCR方法的建立与初步应用为了解pcv1-2m iDNA候选标记疫苗免疫小鼠后拯救获得的pcv1-2m病毒血症载量与诱导抗体之间的关系,以确定最佳免疫剂量和二免时间。本研究根据pc DNA3.1-pcv1-2m-V5质粒的pcv2-ORF2和V5标签序列,设计了一对特异性引物和探针,以该质粒作为阳性标准品,经系列条件优化后,建立了可定量检测pcv1-2m病毒血症载量的Taq man荧光定量PCR方法。而后,应用该方法对免疫不同质粒浓度的6组小鼠,分别在免疫后1～9W进行病毒血症检测;同时,应用ELISA方法分别对pcv2抗体滴度进行检测。结果表明,实验建立的荧光定量PCR方法具有良好的灵敏性、特异性和稳定性,检测范围可达1.29×10～1.29×10拷贝/微升;病毒血症可持续至第5W,抗体可维持至第8W。通过分析抗体滴度变化与病毒载量消长关系,确定使用200μg作为小鼠的最佳免疫剂量。首免后,分别在1～5W不同时间二免,根据特异性抗体产生与病毒血症载量变化情况,确定首免后第4W作为最佳二免时间。2、pcv1-2m iDNA候选标记疫苗诱导小鼠免疫效果的研究为了解pcv1-2m iDNA候选标记疫苗诱导小鼠免疫情况,本研究使用最佳免疫剂量和二免时间,对6～8周龄SPF昆明小鼠分组免疫,首免后1～8W,每周分别断颈采血,无菌采集脾脏备检。使用流式细胞术,测定免疫小鼠外周血细胞中T、B淋巴细胞亚群含量;使用ELISA试剂盒检测Th1型和Th2型细胞因子;使用mTT法检测ConA和LPS刺激小鼠脾淋巴增殖情况。结果显示:与PBS和pc DNA3.1(+)组比较,实验组pcv1-2m iDNA候选标记疫苗免疫后,T、B淋巴细胞亚群中CD4+、CD19以及CD4/CD8比值以及Th1型和Th2型细胞因子极显著提高(Ppcv1-2m拯救病毒的传播方式和安全性,本研究分别比较了国内外四种不同商品化疫苗免疫小鼠后pcv2的抗体滴度、同群饲养和隔离饲养后病毒传播方式,以及免疫一段时间后内脏及注射部位注射质粒的整合情况。结果显示:本研究候选标记疫苗与国内外四种疫苗,免疫后抗体水平无显著性差异(P>0.05),但均与pc DNA3.1(+)、PBS对照组差异极显著(P<0.01);拯救病毒可以通过同群水平接触传播,但不能通过空气进行水平传播;未检测到目的片段整合到小鼠体内,表明本试验候选标记疫苗在基因整合方面对小鼠而言是安全性的。

关键词： pcv1-2m iDNA V5标签嵌合病毒标记疫苗体液免疫细胞免疫

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