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pcsk6对可溶性corin的活化作用研究

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中国生物工程杂志 2016年第7期36卷 15-20页

作者：李枫周田甜刘萌董宁征苏州大学附属第一医院苏州215006 江苏省血液研究所卫生部血栓与止血重点实验室苏州215006 苏州大学唐仲英血液学研究中心苏州215123

目的:研究前蛋白转化酶枯草溶菌素6(proprotein convertase subtilisin/kextin type 6,pcsk6)对可溶性corin的活化作用,以及pcsk6作用后的可溶性corin是否具有生物学活性。方法:以野生型corin质粒为模板,通过PCR扩增出不含跨膜区的cori... 详细信息

目的:研究前蛋白转化酶枯草溶菌素6(proprotein convertase subtilisin/kextin type 6,pcsk6)对可溶性corin的活化作用,以及pcsk6作用后的可溶性corin是否具有生物学活性。方法:以野生型corin质粒为模板,通过PCR扩增出不含跨膜区的corin基因片段,并将目的基因克隆至真核表达载体p SEC得到重组质粒p SECsol Corin,测序验证。分别将可溶性corin、pcsk6及心钠肽前体(pro-atrial natriuretic peptide,pro-ANP)的表达载体转染人胚胎肾(human embryonic kidney,HEK)293细胞,收取上清液。然后将可溶性corin上清液与不同体积的pcsk6上清液共同孵育,免疫印迹(Western blot)方法检测corin蛋白的活化情况。再将pcsk6作用后的可溶性corin与pro-ANP上清液共孵育,检测可溶性corin的生物学活性。结果:构建了可溶性corin的表达质粒,并在HEK293细胞成功表达可溶性corin蛋白。可溶性corin的上清液与pcsk6上清液共同孵育后可检测到活化条带,并可使pro-ANP活化为ANP。结论:pcsk6同样可以剪切活化可溶性corin蛋白,活化后的corin具有生物学活性。为可溶性corin用于心衰的临床治疗提供了重要基础。

关键词：可溶性corin pcsk6 pro-ANP 心力衰竭

pcsk6对类风湿关节炎和胶原诱导性关节炎滑膜细胞生物学的作用及分子机制研究

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PCSK6对类风湿关节炎和胶原诱导性关节炎滑膜细胞生物学的作用及...

作者：姜慧钰济南大学

学位级别：硕士

目的1.探讨si RNA沉默pcsk6基因对胶原诱导性关节炎(CIA)成纤维样滑膜细胞(FLS)生物学行为的影响。2.探讨外源性pcsk6重组蛋白对类风湿关节炎(RA)成纤维样滑膜细胞生物学行为的影响及其分子机制。方法1.采用牛Ⅱ型胶原诱导大鼠CIA模型,... 详细信息

目的1.探讨si RNA沉默pcsk6基因对胶原诱导性关节炎(CIA)成纤维样滑膜细胞(FLS)生物学行为的影响。2.探讨外源性pcsk6重组蛋白对类风湿关节炎(RA)成纤维样滑膜细胞生物学行为的影响及其分子机制。方法1.采用牛Ⅱ型胶原诱导大鼠CIA模型,取膝关节滑膜组织原代培养FLS;采用人工合成的大鼠P CSK6特异si RNA特异性抑制pcsk6在CIA FLS中的表达,以negative si RNA为阴性对照组,瞬时转染24 h、36 h,采用RT-q PCR法检测抑制效率,同时检测pcsk6基因沉默后各相关基因的表达;采用MTT、Transwell、细胞划痕、流式细胞术、ELISA等方法检测干扰pcsk6表达后对大鼠CIA FLS增殖、侵袭、迁移、细胞周期和相关炎性因子分泌的影响。2.采用pcsk6重组蛋白诱导RA FLS,采用MTT、Transwell、细胞划痕、流式细胞术、E LISA等方法检测pcsk6重组蛋白对RA FLS增殖、侵袭、迁移、细胞周期和凋亡以及相关炎性因子分泌的影响;采用R T-q PCR法检测pcsk6重组蛋白刺激后各相关基因的表达;采用W estern blot法检测pcsk6重组蛋白对基质金属蛋白酶M MP9以及ERK、STAT3、Wnt3a、Nodal、m TOR、NF-κB p65、NF-κB p105/p50信号转导通路的影响。采用通路抑制剂P D98059、Stattic、PDTC分别抑制ERK、STAT3、NF-κB p65通路,与pcsk6重组蛋白共同作用于RA FLS,利用MTT、Transwell、细胞划痕、流式细胞术、E LISA等方法检测ERK、STAT3、NF-κB p65通路抑制剂对pcsk6重组蛋白诱导的R A FLS增殖、侵袭、迁移、细胞周期和凋亡以及相关炎性因子分泌的影响。结果1.转染特异性si RNA-pcsk6后,干扰组与阴性对照组相比,pcsk6 m RNA水平明显被抑制(Ppcsk6下游基因CXCL9、MMP2、MMP9、NOSTRIN、HIF-1α、MPZL2、IGF2、PADI4表达均明显下降(P6重组蛋白诱导RA FLS后,与空白对照组相比,150ng/m L pcsk6重组蛋白促进效果最显著,能使RA FLS的增殖速率显著提高(P6和TNF-α分泌均升高(Ppcsk6下游基因C10ORF116、CXCL9、CXCL10、HIF-1α、IL-6、IL-10、IL-26、MMP9、NOSTRIN、TNF-α表达均明显升高(P6h时可显著激活FLS中的ERK、STAT3、NF-κB p65信号转导通路。加入通路抑制剂P D98059、Stattic和PDTC后,150ng/m L pcsk6重组蛋白诱导的R A FLS的增殖(P6和TNF-α)分泌(Ppcsk6重组蛋白对细胞周期的诱导(Ppcsk6重组蛋白对F LS的细胞凋亡的影响(Ppcsk6基因沉默对CIA FLS的生物学行为具有一定抑制作用,为进一步研究C IA发病机制奠定基础。2.外源性pcsk6重组蛋白对RA FLS的增殖、迁移、侵袭和炎症因子分泌等生物学行为具有一定促进作用;P CSK6通过参与ERK、STAT3、NF-κB p65信号转导通路来调控RA FLS的生物学行为。pcsk6可以作为研究RA发病机制、药物筛选以及免疫治疗的新靶点。

关键词： pcsk6 SiRNA 重组蛋白胶原诱导性关节炎类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞信号转导通路

siRNA沉默pcsk6基因对胶原诱导性关节炎的影响

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山东大学学报（医学版） 2015年第12期53卷 20-26页

作者：姜慧钰王林潘继红山东省医药生物技术研究中心山东济南250062 国家卫生部生物技术药物重点实验室山东济南250062 山东省罕少见病重点实验室山东济南250062 济南大学山东省医学科学院医学与生命科学学院山东济南250200

目的探讨siRNA沉默pcsk6基因对胶原诱导性关节炎(CIA)成纤维样滑膜细胞(FLS)生物学行为的影响。方法采用牛Ⅱ型胶原诱导大鼠CIA模型,取膝关节滑膜组织原代培养FLS;采用人工合成的siRNA oligo-433干扰剂、siRNA oligo-688干扰剂、siRNA o... 详细信息

目的探讨siRNA沉默pcsk6基因对胶原诱导性关节炎(CIA)成纤维样滑膜细胞(FLS)生物学行为的影响。方法采用牛Ⅱ型胶原诱导大鼠CIA模型,取膝关节滑膜组织原代培养FLS;采用人工合成的siRNA oligo-433干扰剂、siRNA oligo-688干扰剂、siRNA oligo-2506干扰剂特异性抑制pcsk6在CIA FLS中的表达,阴性siRNA为阴性对照组,瞬时转染24、36 h后,采用RT-q PCR法检测抑制效率,同时检测pcsk6基因沉默后各相关基因的表达;采用MTT、Transwell、细胞划痕、流式细胞术、ELISA等方法检测干扰pcsk6表达后对细胞增殖、侵袭、迁移、细胞周期和相关炎性因子分泌的影响。结果转染特异性siRNA-pcsk6后,各干扰组与阴性对照组相比,siRNA oligo-2506干扰剂转染24 h时,pcsk6 mRNA水平抑制效果显著(Ppcsk6下游基因CXCL9、MMP2、MMP9、NOSTRIN、HIF-1α、M PZL2、IGF2、PADI4表达均明显下降(Ppcsk6基因沉默对CIA FLS的生物学行为具有一定作用,为进一步研究CIA发病机制奠定基础。

关键词： pcsk6 siRNA 胶原诱导性关节炎类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞

pcsk6在胃癌细胞增殖、侵袭转移中的作用及机制的初步研究

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PCSK6在胃癌细胞增殖、侵袭转移中的作用及机制的初步研究

作者：王吉伟南京医科大学

学位级别：硕士

目的:检测pcsk6在胃癌组织与细胞株中的表达水平,分析pcsk6表达与胃癌患者临床病理参数之间的关系。探讨pcsk6基因沉默与过表达对胃癌细胞增殖、侵袭转移中的作用及分子机制。方法:应用实时定量PCR,免疫组织化学及western blot检测103... 详细信息

目的:检测pcsk6在胃癌组织与细胞株中的表达水平,分析pcsk6表达与胃癌患者临床病理参数之间的关系。探讨pcsk6基因沉默与过表达对胃癌细胞增殖、侵袭转移中的作用及分子机制。方法:应用实时定量PCR,免疫组织化学及western blot检测103例胃癌样本组织与配对癌旁组织及胃癌细胞株中pcsk6蛋白表达水平并分析pcsk6表达与临床病理参数之间的关系。CCK8、集落生成实验、细胞划痕实验与trans-well实验检测各组胃癌细胞增殖、迁移侵袭能力;应用裸鼠皮下种植瘤模型与肺转移模型进一步验证pcsk6在体内影响成瘤及转移方面的作用。免疫组化方法检测胃癌组织样本中TGF-β1与E-cadherin的表达水平,分析pcsk6,TGF-β1,E-cadherin三者的相关性。ELISA检测各组胃癌细胞上清中TGF-β1蛋白表达差异。western blot检测处理组与对照组细胞株中增殖相关通路分子表达差异,同时检测EMT相关指标及其他侵袭转移相关分子在各组细胞中的表达差异。结果:1、pcsk6在胃癌组织中表达高于相应的癌旁组织,pcsk6的表达与肿瘤大小、TNM分期以及淋巴结转移相关。pcsk6在胃癌细胞株中普遍高表达。2、CCK8、集落生成实验、细胞划痕实验以及trans-well实验显示,pcsk6可显著增强胃癌细胞增殖、克隆形成以及迁移侵袭能力。3、裸鼠皮下种植瘤模型显示,pcsk6可显著提高胃癌细胞的致瘤性并促进移植瘤增殖。肺转移模型结果显示,pcsk6可显著提高胃癌细胞肺转移内转移灶数目。观察裸鼠生存情况,绘制K-M曲线,应用Log Rank统计P值,成瘤裸鼠过表达组中位生存时间更短。5、免疫组化检测结果显示,TGF-β 1阳性表达较高,与pcsk6表达水平呈正相关(r=0.217,Ppcsk6表达水平呈负相关(r=-0.307,P6、ELISA结果显示,TGF-β 1在胃癌细胞上清中表达处理组与对照组有显著差异,与western blot检测各组细胞内TGF-β 1表达水平趋势基本一致。Western blot显示,过表达细胞株中PI3K/AKT与TGF-β信号通路激活,p-AKT上调,P21下调,EMT相关指标E-cadherin下调,N-cadherin上调,Vimentin上调,细胞外基质降解相关蛋白MMP2及MMP9上调,干扰后则出现相反的结果。结论:1、pcsk6在胃癌组织及细胞株中呈高表达,且与肿瘤大小、TNM分期及淋巴结转移侵袭转移相关。2、pcsk6在体内体外可促进胃癌细胞的增殖、侵袭转移能力。pcsk6可通过PI3K/AKT/P21信号通路介导胃癌细胞的增殖。pcsk6可通过调控TGF-β信号通路诱导EMT及MMP2、MMP9的表达从而促进胃癌的侵袭转移。

关键词：胃癌 pcsk6 增殖侵袭转移 TGF-β EMT MMP2 MMP9 PI3K/AKT/P21

绝经后骨质疏松症肾阳虚证的关联基因LTBP1 mRNA的表达研究

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中国骨质疏松杂志 2014年第5期20卷 476-480页

作者：许惠娟谢丽华李生强陈娟赖玉链葛继荣福建省中医药研究院骨质疏松证候基因组学重点研究室福州350003

目的研究绝经后骨质疏松症肾阳虚证的关联基因LTBP1及pcsk6的mRNA表达水平,探讨绝经后骨质疏松症肾阳虚证与LTBP1及pcsk6基因表达的关联性。方法随机选择绝经后骨质疏松症患者,中医辨证肾阳虚证组25例,32例健康绝经后妇女为对照组,RT-PC... 详细信息

目的研究绝经后骨质疏松症肾阳虚证的关联基因LTBP1及pcsk6的mRNA表达水平,探讨绝经后骨质疏松症肾阳虚证与LTBP1及pcsk6基因表达的关联性。方法随机选择绝经后骨质疏松症患者,中医辨证肾阳虚证组25例,32例健康绝经后妇女为对照组,RT-PCR法检测外周血LTBP1及pcsk6 mRNA的表达。结果肾阳虚证组LTBP1 mRNA表达水平低于健康对照组(F=7.473,P=0.008),差异有统计学意义;肾阳虚证组pcsk6 mRNA表达水平较健康对照组比较,有降低趋势,但差异无统计学意义;通过GO分析参与到的生物途径有细胞外组织形成、代谢过程、磷酸化作用、蛋白磷酸化、TGF-β的细胞外基质合成、BMP信号通路、细胞分泌等;通过Pathway分析参与到弹性纤维形成、细胞外基质组织、整合胰腺癌的通路、TGF-β信号通路、发育生物学、神经生长因子信号转导等通路相关。结论骨质疏松症肾阳虚证与LTBP1基因表达下调相关联。

关键词：绝经后骨质疏松症肾阳虚证 LTBP1 pcsk6 mRNA

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可溶性Corin的表达、纯化及功能研究

可溶性Corin的表达、纯化及功能研究

作者：李枫苏州大学

学位级别：硕士

第一部分pcsk6对可溶性Corin活化作用的研究研究目的:Corin是一种从心脏中克隆出的Ⅱ型跨膜丝氨酸蛋白酶,其主要功能是将心房利钠肽前体(pro-atrial natriuretic peptide,pro-ANP)转化为有活性的心钠肽(ANP),从而发挥排钠利尿、舒张血... 详细信息

第一部分pcsk6对可溶性Corin活化作用的研究研究目的:Corin是一种从心脏中克隆出的Ⅱ型跨膜丝氨酸蛋白酶,其主要功能是将心房利钠肽前体(pro-atrial natriuretic peptide,pro-ANP)转化为有活性的心钠肽(ANP),从而发挥排钠利尿、舒张血管、降低血压和调节心脏功能的作用。在前期研究中,我们及其他课题组研究发现多个与高血压病发生相关的Corin基因突变及多态性,并证实这些基因变异影响Corin的功能。还发现心力衰竭患者血浆中可溶性Corin水平显著低于正常人,且降低程度与心衰严重程度相关。这些结果说明Corin缺乏或功能障碍可能会导致高血压及心衰等心血管疾病的发生。同时还有研究报道,在小鼠心衰模型研究中发现,过表达Corin能改善心功能,延长小鼠生存期。提示,补充外源性Corin,提高机体内Corin水平及活性,或许可作为治疗心衰的新方法。由于Corin是一个膜蛋白,不利于大量表达纯化,如能制备分泌型的可溶性Corin将解决这一难题。据报道缺失胞内段及跨膜区结构不影响Corin的表达及活性。这一发现也使我们研制有活性的可溶性Corin成为可能。同其他Ⅱ型跨膜丝氨酸蛋白酶一样,Corin是以酶原形式合成的,需要在其它蛋白酶的活化后才具有功能。因此,Corin的活化是其作为心血管蛋白酶发挥作用的关键环节。最近Chen等研究发现前蛋白转化酶枯草溶菌素6(Proprotein convertase subtilisin/kextin type 6,pcsk6)为Corin的活化酶。然而目前尚不清楚可溶性Corin能否被pcsk6剪切活化,从而使可溶性Corin具有活性。本部分研究中,我们将构建可溶性Corin和pcsk6的表达载体,转染细胞,表达可溶性Corin和pcsk6,并检测pcsk6对可溶性Corin的活化作用。研究方法:1.以野生型Corin质粒为模板,利用PCR方法、酶连等方法构建出可溶性Corin的表达载体“p SECsol Corin”及Corin突变体“R801A”和“S985A”。2.将野生型、可溶性Corin及突变Corin质粒转染入人胚胎肾(Human embryonic kidney,HEK)293细胞,收集培养上清,并制备细胞裂解液,蛋白质免疫印迹法(Western blotting)检测重组Corin蛋白在上清及胞浆内的表达。3.建立HEK293-pcsk6稳定表达细胞系,分别收集表达可溶性Corin及pcsk6的细胞上清,将可溶性Corin上清与不同体积的pcsk6上清孵育,Western blotting检测可溶性Corin的活化情况。4.收集pro-ANP上清液,将pcsk6活化的可溶性Corin上清以体积梯度加入pro-ANP上清中并孵育,用免疫共沉淀(Immunoprecipitation,IP)和Western blotting检测的pro-ANP活化情况,从细胞水平研究可溶性Corin的活化、表达及生物学功能。研究结果:1.我们构建了缺失胞内段及跨膜区的可溶性Corin表达载体。将野生型、可溶性Corin及突变体R801A和S985A分别转染HEK293细胞,Western blotting检测Corin蛋白在上清及胞浆内的表达。发现胞浆中Corin质粒均成功表达,在还原条件下,二硫键打开,在野生型Corin及蛋白酶活化位点突变体S985A可检测到0 k Da的还原条带,而可溶性Corin和活化切割位点突变体R801A则未检测到还原条带。同时,检测到可溶性Corin在上清中的表达,相对分子量约150 k Da。提示我们成功构建可溶性Corin表达载体。2.我们向HEK293细胞转染pcsk6表达载体,进行筛选,1月后得到6株HEK293-pcsk6稳定表达细胞系。收集上清,与含可溶性Corin的上清共同孵育,Western blotting检测发现pcsk6可以切割可溶性Corin使其产生0 k Da的活化条带,并呈现剂量依赖性。3.我们将已与pcsk6作用过的可溶性Corin加入到pro-ANP上清液中,发现可溶性Corin具有将pro-ANP活化为ANP的功能,并呈现剂量依赖性。结论:我们构建了可溶性Corin表达载体,DNA测序正确,并能在HEK293中表达。建立HEK293-pcsk6稳定表达细胞系。发现pcsk6可以活化可溶性Corin,活化后的可溶性Corin具有将pro-ANP转化为ANP的功能。本研究为我们进一步将可溶性Corin蛋白纯化并活化后用于心力衰竭的治疗打下重要的基础。第二部分重组可溶性EKCorin蛋白的表达、纯化及活性研究研究目的:Corin作为一种重要的心血管蛋白酶,具有排钠利尿、舒张血管、降低血压和调节心脏功能的作用。C

关键词：可溶性Corin pcsk6 pro-ANP 活化 EKsol Corin 心衰 EK 活性