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棉花抗早衰的转基因研究

棉花抗早衰的转基因研究

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作者：李静山东农业大学

学位级别：硕士

本研究以中棉所 10 号、中棉所 24 号、中棉所 36 号为试验材料,利用花粉管通道技术将该含有嵌合基因pcsag12-ipt(辽棉19号中的PSAG12与ipt基因连接组成)的质粒导入三种棉花品种,采取正交试验设计,探讨基因型、导入时间、导入 DNA 浓度... 详细信息

本研究以中棉所 10 号、中棉所 24 号、中棉所 36 号为试验材料,利用花粉管通道技术将该含有嵌合基因pcsag12-ipt(辽棉19号中的PSAG12与ipt基因连接组成)的质粒导入三种棉花品种,采取正交试验设计,探讨基因型、导入时间、导入 DNA 浓度和化学诱变剂浓度对棉花转化率的影响,优化棉花花粉管通道技术的转化体系,提高基因转化效率;采用优化体系,将该嵌合基因 pcsag12-ipt 导入早衰棉中棉所 10 号,获得转基因抗早衰棉花植株;通过细胞分裂素酶联免疫吸附测定,证明该外源基因在衰老叶片中正常表达,衰老叶片中细胞分裂素含量大大提高,从而提高了抗衰老生化物质的含量和活性,延缓了棉花的早衰。为获得该基因的遗传特性,对T2代转基因棉株的遗传分离规律进行分析。获得的主要结果如下: 1 在利用花粉管通道技术进行棉花转基因操作时,不同因素(基因型、导入时间、导入 DNA 的浓度和化学诱变剂的浓度)对转化率的重要性依次为:EMS 的浓度>棉花的基因型>导入 DNA 的浓度>导入时间。受体棉花的基因型和 EMS 的浓度对转化率的影响,各处理之间差异达到极显著水平;而导入 DNA 的浓度和时间对转化率的影响,各处理之间差异不显著。根据试验结果确定优选组合:基因型为中棉所 24,导入质粒 DNA 的浓度为 0.01μg/μl,EMS 的浓度为 0.01μg/μl,导入时间为棉花受粉后 36 小时。 2 为验证抗早衰基因的功能和优选转化体系的可靠性,选取早衰较重的中棉所 10 号作为受体,以棉花自花授粉 24 小时后(有明显的形态学标准,便于操作),导入浓度均为 0.01μg/μl 的 DNA 和 EMS 混合液;对照导入与 EMS 同体积的缓冲液,其它同优选体系。利用卡那霉素田间筛选、PCR 反应、GUS 组织化学染色进行转基因植株的鉴定,计算转化率。试验结果表明:优选体系的转化率比对照提高 2 倍多。 3 生育后期对中棉所 10 号 T1代转基因植株进行抗衰老鉴定。叶绿素、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)的活性及代谢产物 MDA 和可溶性蛋白的测定结果表明:同期内转基因植株的 SOD、POD、CAT 酶活性,叶绿素和可溶性蛋白的含量均高于未转基因株;转基因植株的 MDA 含量稍低于未转基因植株。转基因产物细胞分裂素酶联免疫吸附测定和转基因植株形态观察表明:同期内转基因植株的细胞分裂素含 - 1 -

关键词：棉花花粉管通道技术转化率 pcsag12-ipt 基因抗早衰

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