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甘蔗线虫病抗性基因的pcr检测研究

作物学报 2006年第6期32卷 939-942页

作者：吴杨周会潘大仁福建农林大学作物学院福建福州350002

以38份未经线虫病常规鉴定的甘蔗种质资源为供试材料,根据番茄抗根结线虫病基因和甜菜抗胞囊线虫病基因的保守序列区域,分别设计了2条上游引物2、条下游引物,对设计的引物进行组合后,应用pcr特异扩增从中分别筛选出各1对特异引物。用抗... 详细信息

以38份未经线虫病常规鉴定的甘蔗种质资源为供试材料,根据番茄抗根结线虫病基因和甜菜抗胞囊线虫病基因的保守序列区域,分别设计了2条上游引物2、条下游引物,对设计的引物进行组合后,应用pcr特异扩增从中分别筛选出各1对特异引物。用抗根结线虫基因设计的特异引物进行扩增最终获得了1条大约460 bp大小的特异片段;用抗胞囊线虫基因设计的特异引物进行扩增最终获得了1条大约690 bp大小的特异片段,进一步进行了pcr-southern杂交,确认了该2条特异引物的真实性。

关键词：甘蔗抗线虫基因基因检测 pcr-southern杂交

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PEX法提取植物组织DNA

广东农业科学 2010年第5期37卷 178-180页

作者：雷海英孙毅仪治本段永红王志军长治学院生物科学与技术系山西长治046011 山西省农业生物技术研究中心山西太原030031 中北大学山西太原030051

介绍了一种简单而实用的DNA提取法,利用PEX试剂从高粱与转基因玉米的新鲜叶片中提取植物组织DNA。所得DNA经定量检测后,可满足AFLP分析及pcr-southern杂交等要求。

关键词： DNA提取 PEX AFLP pcr-southern杂交

EBV感染与SLE患者外周血B淋巴细胞异常活化的相关性研究

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EBV感染与SLE患者外周血B淋巴细胞异常活化的相关性研究

作者：李毅青岛大学

学位级别：硕士

目的探讨Epstein-Barr virus(EBY)感染在系统性红斑狼疮(systemic lupuserythematosus,SLE)患者外周血B淋巴细胞异常活化中的作用,分析EBV活化B淋巴细胞的可能机制以及EBV感染和B淋巴细胞异常活化与疾病活动性的关系。方法应用pcr-Sout... 详细信息

目的探讨Epstein-Barr virus(EBY)感染在系统性红斑狼疮(systemic lupuserythematosus,SLE)患者外周血B淋巴细胞异常活化中的作用,分析EBV活化B淋巴细胞的可能机制以及EBV感染和B淋巴细胞异常活化与疾病活动性的关系。方法应用pcr-southern杂交技术检测52例SLE患者和23例正常对照组外周血中EBV特异性BamH I-W基因片段;应用酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清ANA及EBV-VCA-IgM水平;同时应用流式细胞术检测外周血中CD19、CD23/CD19、CD21/CD19以及HLA-DR/CD19阳性细胞的表达情况。结果①pcr-southern杂交检测结果显示SLE患者组EBV基因组BamH I-W片段阳性率为61.54%,正常对照组阳性率为30.44%,统计学分析表明两者间有显著性差异(P＜0.01);活动期和稳定期SLE患者组阳性率分别为65.62%和70.00%,与对照组相比均有显著性差异(P＜0.05);活动期和稳定期SLE患者组EBV DNA阳性率无显著性差异(P＞0.05)。 ②活动期SLE患者组CD19,CD23/CD19及HLA-DR/CD19细胞阳性率与稳定期及对照组比较差异均有显著性意义(P＜0.01);稳定期SLE患者组CD23/CD19与正常对照组比较无显著性差异(P＞0.05);稳定期SLE HLA-DR/CD19细胞阳性率与正常对照组比较无显著性差异(P＞0.05)。且CD23/CD19细胞阳性率与病情积分及ANA均成正相关(P＜0.01),而HLA-DR/CD19双阳性细胞与病情积分和ANA无相关关系(P＞0.05)。 ③CD21/CD19细胞在SLE患者组、活动期SLE组、稳定期SLE组及正常对照组阳性率均较低,各组之间比较无显著性差异(P＞0.05)。CD23/CD21/CD19三阳性细胞在各组之间比较亦无显著性差异(P＞0.05)。 ④EBV-DNA阳性患者组CD19及CD23/CD19细胞阳性率明显高于EBV-DNA阴性SLE组,统计学分析有显著性差异(P＜0.05);CD21/CD19细胞阳性率在两组之间无显著性差异(P＞0.05);EBV-DNA阳性患者组CD19B淋巴细胞CD21和CD23分子的平均荧光强度明显高于EBV-DNA阴性患者组,且统计学分析有显著性差异(P＜0.01)。 ⑤52例SLE组中有5例EBV特异性IgM抗体阳性,阳性率为9.62%,阳性标本的均值为65.23arbU/ml;23例对照组EBV特异性IgM抗体均为阴性,统计学分析表明两者之间无显著性差异。5例EBV VCA-IgM阳性者均为SLE活动期患者,且均不是初发病例。经方差分析,VCA-IgM含量在各组间无显著性差异(P＞0.05),经精确卡方检验P值均大于0.05,即EBV VCA-IgM阳性率在各组间亦无显著性差异。结论①EBV感染与SLE的发生发展有一定关系,EBV感染是SLE环境致病因子之一。②EBV可能通过上调B淋巴细胞持续高水平表达CD21和CD23参与SLE患者B淋巴细胞的异常活化;③B淋巴细胞异常活化与SLE患者疾病活动密切相关。

关键词： EBV 系统性红斑狼疮活化B淋巴细胞流式细胞 pcr-southern杂交

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柑橘特异分子标记与进化关系分析

柑橘特异分子标记与进化关系分析

作者：李明惠华中农业大学

学位级别：硕士

柑橘(Citrus)是多年生木本果树,具有复杂的遗传背景,经过长期杂交和芽变选种,其进化关系更为复杂。为了能有效区分和鉴定柑橘种质资源,前人通过DNA分子标记等方法区分和鉴定柑橘种质资源。柑橘RAPD分析筛选出的一个特异随机引物OPA08能... 详细信息

柑橘(Citrus)是多年生木本果树,具有复杂的遗传背景,经过长期杂交和芽变选种,其进化关系更为复杂。为了能有效区分和鉴定柑橘种质资源,前人通过DNA分子标记等方法区分和鉴定柑橘种质资源。柑橘RAPD分析筛选出的一个特异随机引物OPA08能区分柑橘三属八大类的种质资源。为了揭示该引物所具有的特殊性,本研究深入分析了随机引物OPA08与柑橘遗传信息之间的关系。本研究采集了涵盖柑橘三属的22个材料用OPA08引物进行RAPD扩增,对扩增结果进行了pcr-southern杂交分析,并从电泳特征带中回收了23条特异片段进行测序分析。通过序列比对和聚类分析,印证了各种质之间的进化关系,支持前人对于柑橘进化关系的分析,并发现这些序列与反转录转座子具有较高同源性,说明反转录转座子对柑橘的进化具有重要作用。主要结果如下: 1.建立了稳定的RAPD扩增体系:2μl 10×buffer;2.0 mmol/L Mg;0.2 mmol/LdNTPs 0.5μmol/L OPA08引物;100 ng模板DNA和0.5 U Taq酶。通过此体系扩增得到清晰的电泳特征带。 2.对RAPD扩增电泳产物的pcr-southern杂交结果显示,以纽荷尔OPA08-280bp特征带标记的探针仅与酸橙、桠柑、葡萄柚的相同位置带有强杂交信号。而宜昌橙OPA08-280bp特征带标记的探针则与宽皮柑橘OPA08-200bp、柚子OPA08-280bp、柠檬OPA08-400bp和OPA08-500bp特征带有较强的杂交信号,而且在大片段处杂交带较多。这些结果表明,纽荷尔OPA08-280bp特征带代表的是较新产生的橙类特异遗传信息,而宜昌橙OPA08-280bp特征带则携带有属于柑橘类植物共有的一些遗传信息,说明宜昌橙应该是较为原始的基本种之一。 3.聚类分析和序列比对结果表明,柚子、枳壳、柠檬的OPA08-310bp特征带及宽皮柑橘类OPA08-200bp特征带有较高的同源性,含有一部分相同的遗传信息。甜橙、酸橙、桠柑的OPA08-280bp特征带相似度较高,且与金柑OPA08-500bp特征带有部分同源。宜昌橙OPA08-280bp特征带与柠檬、粗柠檬OPA08-500bp特征带的相似度较高。 4.测序序列的生物信息学分析结果显示,OPA08引物在不同柑橘植物中扩增得到的片段均与反转录转座子有较高同源性,说明反转录转座子对柑橘变异和进化具有重要作用。反转录转座子的传递可以为人们研究和分析柑橘类植物的遗传进化关6系提供有效的证据。

关键词：柑橘 RAPD 反转录转座子 pcr-southern杂交

青岛地区婴儿肝炎综合征患儿CMV和EBV感染的检测与分析

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青岛地区婴儿肝炎综合征患儿CMV和EBV感染的检测与分析

作者：刘薇青岛大学

学位级别：硕士

目的探讨青岛地区婴儿肝炎综合征患儿人巨细胞病毒（Humancytomegalovirus,CMV）和EB病毒（Epstein-Barr virus,EBV）感染情况。方法采用实时荧光定量pcr技术检测80例婴肝患儿外周血EBV-DNA的拷贝数,同时检测尿标本中HCMV-DNA的拷贝数,... 详细信息

目的探讨青岛地区婴儿肝炎综合征患儿人巨细胞病毒（Humancytomegalovirus,CMV）和EB病毒（Epstein-Barr virus,EBV）感染情况。方法采用实时荧光定量pcr技术检测80例婴肝患儿外周血EBV-DNA的拷贝数,同时检测尿标本中HCMV-DNA的拷贝数,并对其中48例CMV肝炎患儿在出院半年和一年后进行尿标本HCMV-DNA含量和肝功的动态监测。采用pcr-southern方法检测患儿咽分泌物EBV DNA;酶联免疫吸附法（ELISA）检测80例婴肝患儿血清HCMV-IgM和EBV VCA-IgM。结果①80例患儿尿标本HCMV-DNA阳性率为63.8%（51/80）,40例正常对照婴儿尿标本中HCMV-DNA阳性率为10%（4/40）,统计学分析表明:婴肝患儿组HCMV-DNA阳性率明显高于对照组,差异有显著性（x=31.032,P＜0.01）。80例患儿血清HCMV-IgM阳性率为46.25%（37/80）,40例正常对照儿童HCMV-IgM阳性率为2.5%（1/40）,统计学分析表明婴肝患儿组血HCMV-IgM阳性率明显高于对照组,差异有显著性（x=23.588,P＜0.01）。②80例患儿血标本EBV DNA阳性率为20%（16/80）,40例正常对照儿童有1例外周血EBV DNA阳性,阳性率为2.5%,统计学分析表明:婴肝患儿组外周血EBV DNA阳性率明显高于对照组,差异有显著性（x=6.716,P＜0.05）。80例患儿咽分泌物标本EBV DNA阳性率为31.25%（25/80）,40例正常对照儿童有1例咽分泌物EBV DNA阳性,阳性率为2.5%（1/40）,患儿组咽分泌物EBV DNA阳性率也明显高于对照组,差异有显著性（x=12.987,P＜0.01）。80例患儿血EBV VCA-IgM阳性率为11.25%（9/80）,40例正常对照儿童EBV VCA-IgM检测结果均为阴性,统计学分析表明差异无显著性（校正x=3.378,P=0.066）。③80例患儿乙肝5项检测仅有2例HBsAg阳性,感染率为1.25%,RPR阳性1例,HSV-IgM、抗-HAV抗体和抗-HCV抗体检测均为阴性。④CMV和EBV合并感染6例,这6例患儿ALT和AST平均值比单独CMV或EBV感染患儿ALT和AST平均值高4～5倍。⑤治疗后出院时80例婴肝患儿中治愈55例,病毒拷贝数仍阳性的有21例,死亡4例。结论HCMV感染是引起婴肝的主要原因;部分患儿肝功恢复正常后,HCMV不能完全转阴,并有复发的可能性,所以出院后要进行动态监测。EBV感染是部分婴儿肝炎综合征的致病因子,临床对年龄较小伴肝功能损害的患儿,在排除巨细胞病毒、乙肝病毒感染后,应考虑EBV感染的可能,CMV和EBV合并感染患儿肝功损害更严重;HBV感染导致的婴肝患儿比例明显下降。

关键词：婴儿肝炎综合征人巨细胞病毒 EB病毒 pcr-southern杂交实时荧光定量pcr法抗体

应用pcr技术检测甘蔗线虫病抗性基因的研究

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应用PCR技术检测甘蔗线虫病抗性基因的研究

作者：吴杨福建农林大学

学位级别：硕士

本研究以43份未经线虫病常规鉴定的甘蔗质资源为供试材料，首先提取供试甘蔗基因组DNA，然后根据番茄抗根结线虫病基因和甜菜抗胞囊线虫病基因的保守序列区域，分别设计了两条上游引物、两条下游引物，对引物组合后，进行了pcr特异扩增... 详细信息

本研究以43份未经线虫病常规鉴定的甘蔗质资源为供试材料，首先提取供试甘蔗基因组DNA，然后根据番茄抗根结线虫病基因和甜菜抗胞囊线虫病基因的保守序列区域，分别设计了两条上游引物、两条下游引物，对引物组合后，进行了pcr特异扩增，从中分别筛选出一对特异引物，并优化了pcr扩增反应体系中的各个影响因素。用抗根结线虫基因设计的引物进行扩增最终获得了一条大约460bp大小的特异片段;用抗胞囊线虫基因设计的引物进行扩增最终获得了一条大约690bp大小的特异片段，并进一步做了pcr-southern杂交，以确认这两条特异片段的同源性程度和真实性，本实验所得结果如下： 1．建立了适合于甘蔗pcr特异扩增的反应体系：反应总体积为20μl，含10mmol／L Tris-HCl(pH8.3)，50mmol／L KCl，2.0mmol／L MgCl，100μmol／L dNTP，0.2μmol／L引物，40ng模板DNA，1.0U Taq酶;反应程序为：94℃，5min，1 cycle;94℃，40s，60℃，50s，72℃，90s，35 cycles;72℃延伸10min。 2．对43份未经线虫病常规鉴定的甘蔗种质资源根据不同的引物进行pcr检测。其中，用抗根结线虫病基因设计的引物进行扩增，结果有37份甘蔗出现特异条带，6份未出现任何条带;用抗胞囊线虫病基因设计的引物进行扩增，结果有39份甘蔗出现特异条带，4份未出现任何条带。 3．对两种pcr特异产物进行了pcr-southern杂交，结果显示它们有杂交信号，说明这两个片段分别与两个抗线虫病基因有较高的同源性，为克隆甘蔗抗线虫病基因奠定了基础。

关键词：甘蔗抗线虫基因基因检测 pcr-southern杂交

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甘薯抗线虫病基因的分子检测

甘薯抗线虫病基因的分子检测

作者：郭金平福建农林大学

学位级别：硕士

本研究以11个经线虫病常规鉴定的甘薯品种(6个高抗，2个抗病，3个感病)和11个未经线虫病常规鉴定的甘薯品种为供试材料，首先对CTMB法和 SDS法提取甘薯基因组DNA进行了方法探讨，然后根据甜菜抗线虫病基因的保守序列区域，设计了三条... 详细信息

本研究以11个经线虫病常规鉴定的甘薯品种(6个高抗，2个抗病，3个感病)和11个未经线虫病常规鉴定的甘薯品种为供试材料，首先对CTMB法和 SDS法提取甘薯基因组DNA进行了方法探讨，然后根据甜菜抗线虫病基因的保守序列区域，设计了三条上游引物，三条下游引物，共产生了9组组合，进行了pcr特异扩增，从中筛选出一对特异引物，并优化了pcr扩增的反应体系中的各个影响因素，通过特异扩增最终获得了一条630bp大小的特异片段，并进一步做了pcr-southern杂交，以确认该特异片段的同源性程度和真实性，最后对11个未经线虫病常规鉴定的甘薯品种进行了初步的检测，所得结果如下： 1．建立了适合于甘薯的pcr特异扩增的反应体系：20μl反应体系中，含10mmol/L Tris-HCI(pH8.3)，50mmol/L KCl，1.5 mmol/L MgCl，100μ mol/L dNTP,0.3μ mol/L特异引物，50ng模板DNA，1.0U Taq DNA聚合酶;反应程序为：94℃，5min，1 cycle;94℃，40s，58℃，50s，72℃，90s，35 cycles;72℃ 延伸10min。 2．通过对CTAB法和SDS法提取甘薯的基因组DNA的比较，结果表明CTAB法比较适合提取甘薯基因组DNA。 3．对11个经线虫病常规鉴定的甘薯品种的pcr检测结果与线虫病常规鉴定基本一致，吻合度达10/11，表明pcr检测是可行的。 4．对特异pcr产物进行了pcr-Southem杂交，结果显示它们有杂交信号，说明该片段与甜菜抗线虫病基因有较高的同源性，为克隆甘薯抗线虫病基因奠定了基础。 5．11个未经线虫病常规鉴定的甘薯品种中，8个出现抗线虫病基因的特异条带，3个未出现任何条带，此结果需进一步做田间常规鉴定来验证。

关键词：甘薯抗线虫墓因基因检测 pcr-southern杂交

水曲柳SOC1、AG基因的克隆和遗传转化分析

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水曲柳SOC1、AG基因的克隆和遗传转化分析

作者：付德山东北林业大学

学位级别：硕士

SOC1基因是开花时间调控基因,AG基因是控制高等植物花器官发育基因,这两个基因在花发育过程中起着重要的调控作用。本研究对水曲柳SOC1和AG基因编码区进行了克隆,分别命名为FmSOC1和FmAG。并成功构建了植物表达载体pROK Ⅱ-35S::FmSOC1... 详细信息

SOC1基因是开花时间调控基因,AG基因是控制高等植物花器官发育基因,这两个基因在花发育过程中起着重要的调控作用。本研究对水曲柳SOC1和AG基因编码区进行了克隆,分别命名为FmSOC1和FmAG。并成功构建了植物表达载体pROK Ⅱ-35S::FmSOC1和 pCAMBIA1301-35S::FmAG,通过根癌农杆菌介导的遗传转化技术,成功转入烟草中,获得了转FmSOC1口FmAG烟草T0植株。主要结果如下：1、FmSOC1和FmAG基因编码区全长的克隆及生物信息学分析本研究获得了FmSOC1和FmAG基因全长序列,FmSOC1基因编码区全长为654bp,与水曲柳转录组中SOCl序列核苷酸一致性为93%,预测编码氨基酸长度为218aa,编码蛋白的分子量为24920.43,等电点pI为9.40,不稳定系数为61.33,是不稳定蛋白,亚细胞定位分析显示FmSOC1基因在细胞核、叶绿体和线粒体中均表达,聚类分析显示FmSOC1蛋白与芝麻、宽叶车前和金鱼草中SOC1同源蛋白亲缘关系最近;FmAG基因编码区全长为726bp,与水曲柳转录组中AG序列核苷酸一致性为98%,预测的氨基酸长度为242aa,编码蛋白的分子量为27913.51,等电点pI为9.25,不稳定系数为67.48,是不稳定蛋白,亚细胞定位分析显示FmAG基因在细胞核中,聚类分析显示FmAG蛋白与美国红梣、金鱼草和芝麻中AG同源蛋白亲缘关系最近。2、植物表达载体pROK Ⅱ-35S::FmSOC1和pCAMBIA1301-35S::FmA G的构建及遗传转化体系的优化构建了Xba Ⅰ/Sac Ⅰ双酶切pROK Ⅱ-35S:.FmSOCl和Nco Ⅰ单酶切pCAMBIA1301-35S:: FmAG植物表达载体,转入根癌农杆菌LBA4404中,本研究优化了农杆菌介导的烟草遗传转化体系,结果为：外植体经预培养2d,用OD值0.8的农杆菌LBA4404转入植物表达载体pROK Ⅱ-35S::FmSOCl 和 pCAMBIA1301-35S::FmAG菌液浸染25min,再共培养3d,有利于提高遗传转化效率。不定芽筛选中,卡那霉素和潮霉素浓度分别为50mg/L和2Omg/L时适于农杆菌侵染后的脱菌和抑菌操作。3、转基因烟草遗传转化及分子鉴定pcr和pcr-southern杂交检测转基因烟草To代植株,初步证实外源FmSOC1基因整合到了烟草的基因组中,转化率为31.58%。随机选取经pcr检测为阳性的烟草苗5株进行RT-pcr分析,发现有3株SOC1基因检测到基因转录,从形态学上观察发现转SOC1基因的烟草比野生型烟草提前开花。

关键词：水曲柳 SDC1基因 AG基因 pcr-southern杂交

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EB病毒感染与系统性红斑狼疮相关性的研究

EB病毒感染与系统性红斑狼疮相关性的研究

作者：张炜青岛大学

学位级别：硕士

目的探讨Epstein-Barr virus（EBV）感染在系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus,SLE）病因学中的作用，通过检测EBV阳性SLE标本中EBV潜伏期基因和增殖期基因的表达，对获得的结果进行综合分析，以探讨EBV基因表达与SLE发生... 详细信息

目的探讨Epstein-Barr virus（EBV）感染在系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus,SLE）病因学中的作用，通过检测EBV阳性SLE标本中EBV潜伏期基因和增殖期基因的表达，对获得的结果进行综合分析，以探讨EBV基因表达与SLE发生发展的关系，为SLE的预防和治疗提供新的思路。方法应用pcr-southern杂交技术检测44例SLE病人和43例正常对照外周血单个核细胞中EBV特异性DNA片段BamH I-W，筛选出EBV阳性标本，对EBV阳性标本进行RT-pcr和southern杂交，检测病毒潜伏期基因EBNA2，LMP1和LMP2A以及增殖期基因BZLF1，BRLF1，BARF1，BcLF1和BLLF1的表达。同时采用酶联免疫吸附法（ELISA）检洲血清EBV特异性IgM抗体。结果 ①pcr-southern杂交检测结果显示44例SLE病人标本中有32例检测到EBV基因组BamH I-W片段，阳性率为72.7％，43例正常对照有3例检测到EBV基因组BamH I-W片段，阳性率为6.98％，统计学分析表明SLE病人组EBV阳性率明显高于正常对照组（x=39.1779，P=0），SLE活动期和稳定期病人EBV DNA检出率无显著性差异（q=0.4025，P=0.7764），其中SLE活动期病人17例阳性，阳性率为70.83％（17／24），与对照组相比有显著性差异（q=7.9070，P=0），SLE稳定期病人15例阳性，阳性率75.00％（15／20），与对照组相比有显著性差异（q=7.9250，P=0.0001）。②32例EBV性标本中有20例EBNA2 mRNA阳性，其中活动期病人9例，稳定期病人11例，阳性率在活动期和稳定期病人之间的差别无统计学意义（P=0.2907）。32例病人标本中有1例LMP1 mRNA阳性且为活动期病人，活动期和稳定期之间的差别无统计学意义（P=1.000），该例标本同时表达EBNA2;32例EBV阳性标本均未检测到LMP2A mRNA的表达。③32例EBV阳性标本中EBV早期基因BARF1 mRNA2例阳性，均为活动期病人，活动期和稳定期的差别无统计学意义（P=0.4859）;EBV晚期基因BcLF1 mRNA 14例阳性，其中活动期病人11例，稳定期病人3例，活动期和稳定期病人之间的差别有统计学意义（P=0.0155）;32例EPV基因组阳性标本均未检测到即刻早期基因BZLF1，BRLF1和晚期基因BLLF1表达。④ELISA结果显示44例SLE病人组中有8例EBV特异性IgM抗体阳性，阳性率为18.18％，中文摘要43例对照组EBV特异性工gM抗体均为阴性，SLE病人组阳性率高于正常对照组（P=0.0011）;SLE活动期和稳定期病人EBV工gM抗体检出率无显著性差异（q二0 .7398，P=0.2210）。结论本研究结果提示EBv感染与sLE的发生有一定关系，EBv感染有诱发自身免疫的可能，EBV在SLE中处于低水平活动状态。

关键词： EBV SLE pcr-southern杂交 RT-pcr