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Structural basis of interaction between protein tyrosine phosphatase pcp-2 and β-catenin

Science China(Life Sciences) 2005年第2期48卷 163-167页

作者： HE Yaqin YAN Hexin DONG Hui ZHANG Peng TANG Liang QIU Xiuhua WU Mengchao WANG Hongyang International Co-operation Laboratory on Signal Transduction Eastern Hepatobiliary Surgery HospitalSecond Military Medical UniversityShanghai 200438China

pcp-2 is a member of receptor-like protein tyrosine phosphatase of the MAM do-main *** investigate which part of pcp-2 was involved in its interaction withβ-catenin,we constructed various deletion mutants of *** pcp-2 mutants and wild-type pcp-2 were co-transfected into BHK-21 cells withβ-catenin *** in vivo binding assay revealed that the expression of wild-type pcp-2,pcp-2?C1C2(deleted pcp-2 without both PTP domains)and pcp-2?C2(deleted pcp-2 without the second PTP domain)could be immunoprecipitated by anti-catenin antibody in every co-transfection,but pcp-2 EXT(deleted pcp-2 without the juxtamembrane region and both PTP domains)was missing,which implied that pcp-2 andβ-catenin could associate directly and the juxtamembrane region in pcp-2 was sufficient for the process.

关键词： pcp-2 β-catenin protein tyrosine phosphatase interaction.

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受体型蛋白酪氨酸磷酸酶pcp-2与β-catenin相互作用的结构基础

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中国科学（C辑） 2004年第4期34卷 360-363页

作者：何雅琴鄢和新董辉张鹏唐亮邱秀华吴孟超王红阳第二军医大学东方肝胆外科医院国际合作信号转导研究室上海200438

pcp-2是MAM型受体型蛋白酪氨酸磷酸酶亚家族的新成员.为研究pcp-2与β-catenin 相互作用的结构基础,构建了pcp-2胞内区各结构域的缺失突变体,将其及野生型pcp-2分别与β-catenin共转染至BHK-21细胞,采用免疫共沉淀和Western印迹分析pcp-... 详细信息

pcp-2是MAM型受体型蛋白酪氨酸磷酸酶亚家族的新成员.为研究pcp-2与β-catenin 相互作用的结构基础,构建了pcp-2胞内区各结构域的缺失突变体,将其及野生型pcp-2分别与β-catenin共转染至BHK-21细胞,采用免疫共沉淀和Western印迹分析pcp-2与β-catenin相互作用的结构基础.结果表明,在野生型pcp-2及上述缺失突变体中,除pcp-2 EXT(缺失包括近膜区在内的整个胞内区的pcp-2)外,野生型pcp-2,缺失胞内区两个磷酸酶结构域的pcp-2(pcp-2ΔClC2)及缺失胞内区第2个磷酸酶结构域的pcp-2(pcp-2ΔC2)均能与抗β-catenin CT抗体发生免疫共沉淀.提示pcp-2与β-catenin通过直接结合发生相互作用,且pcp-2的近膜区是pcp-2与β-catenin结合所必需的结构基础,它介导二者结合.

关键词： pcp-2 β-catenin 蛋白质酪氨酸磷酸酶相互作用免疫共沉淀结构域缺失

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受体型酪氨酸磷酸酶PCP-2与肿瘤相关蛋白β-catenin在肿瘤细胞中...

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作者：张瑞第四军医大学

学位级别：硕士

蛋白质酪氨酸残基的可逆磷酸化是细胞正常生命活动调控的重要方式之一，其磷酸化水平受酪氨酸激酶(PTKs)和酪氨酸磷酸酶(PTPs)的双相调节，通过它们的协同作用维持蛋白质酪氨酸磷酸化的平衡，从而保证细胞的生长、代谢、迁移、增殖和分... 详细信息

蛋白质酪氨酸残基的可逆磷酸化是细胞正常生命活动调控的重要方式之一，其磷酸化水平受酪氨酸激酶(PTKs)和酪氨酸磷酸酶(PTPs)的双相调节，通过它们的协同作用维持蛋白质酪氨酸磷酸化的平衡，从而保证细胞的生长、代谢、迁移、增殖和分化等一系列重要生命活动的正常进行。由于许多PTKs是癌基因或生长因子受体，因此已得到了广泛的研究，但PTPs的重要性直到近些年来才得到充分的认识。 pcp-2基因由第二军医大学王红阳教授于1996年首先克隆并鉴定，其结构与PTPμ和PTPκ高度同源，同属受体型酪氨酸磷酸酶(RPTPs)Ⅱb亚家族。与其它RPTPs不同的是，上述三者胞外区具有一个MAM(meprin／A5／PTPμ)功能域和胞内较长的近膜区。现已证实MAM功能域参与PTPμ和PTPκ介导的非钙离子依赖的同源性粘附;而胞内近膜区含有与细胞粘附分子钙依赖性粘附素(E-cadherin)同源的结构域，通过该结构使胞内区与β-连环蛋白(β-catenin)结合，后者通过结合α-连环蛋白(α-catenin)与细胞骨架相联系。第四军医大学硕士学位论文日一catenin是一种具有双重功能的蛋白质，它一方面参与细胞粘附，对细胞骨架发挥功能具有重要作用;另一方面又是Wnt途径的效应分子，与转录因子LEFI/TCF4结合后激活下游基因(c一myc，CyclinDI 等)表达，在发育和肿瘤发生中占有重要地位，是目前生物学研究的热点问题之一。越来越多的证据表明可逆的酪氨酸磷酸化是调节 E一cadherin/p一eatenin复合体的粘附功能及旦一eatenin转录活性的重要机制。但目前国际上对RPTPs调控该复合体的研究较少，尤其是对日一catenin转录功能的调节尚无报道。前期研究发现pcp一2 与该复合体共同定位于细胞联结部位，提示pcp可能参与对其功能的调控。本研究旨在通过对pcp理与该复合体相互作用的研究，阐明pcp一2对细胞粘附和p一。atenin转录活性的影响，为进一步揭示其在肿瘤发生中的作用机制提供线索，并探讨其潜在的应用价值。本实验应用RT一PCR及重组PCR技术获得了p一catenin不同功能区缺失基因融合或不融合GFP基因的真核表达载体。运用共转染技术和荧光素酶报告基因系统检测pcp一2及RPTPllb家族成员PT即和PTPK对p一catenin转录活性的调节作用，并在此基础上进一步检测了目一catenin转录调控下游基因表达的变化。而后，建立了稳定表达pcp一2的肿瘤细胞株，使用免疫印迹、免疫共沉淀及荧光素酶报告基因系统检测了这种建株细胞中p一catenin转录活性的变化和受p一catenin调控的下游基因表达的改变。运用间接免疫荧光和免疫沉淀技术观察了p一catenin在建系细胞中的亚细胞定位及酪氨酸磷酸化状态的改变;并运用免疫沉淀和免疫印迹方法观察了 pcp一2与E一cadherin/p一catenin复合体的相互作用;应用免疫沉淀、GST Pundown以及免疫荧光技术研究陀P一2对 E一cadherin/p一caten加复合体稳定性的调节;通过细胞增殖实验、划痕实验和集落形成实验等检测了pcp一2稳定表达对细胞粘附、迁移、生长和增殖的影响;通过裸鼠成瘤实验观察稳定转染pcp一2对第四军医大学硕士学位论文肿瘤细胞SW48O成瘤性的影响。实验结果显示:pcp一2能够与p一catenin特异性结合，并且由 p一eatenin梭基末端介导;pcp一2可以下调日一eatenin转录活性，该作用依赖于pcp一2磷酸酶活性结构域和胞内近膜区结构;pcp一2 稳定转染SW48O细胞后可显著抑制细胞的迁移、增殖及集落形成能力:对稳定表达pcp一2的SW480细胞株进一步的研究发现其 p一catenin转录活性下调，E一 cadherin表达水平升高而游离的 p一eatenin减少，E一eadherin/p一eatenin复合体稳定性提高，并伴随p一catenin酪氨酸磷酸化水平的下降;裸鼠成瘤实验显示该细胞株成瘤能力显著减弱。本研究首次发现受体型酪氨酸磷酸酶pcp一与重要的肿瘤相关蛋白p一eatenin相互作用，并证实pcp一2既可以与p一eatenin发生直接结合，也可通过调节其酪氨酸磷酸化水平间接提高 E一cadherin/p一catenin复合体稳定性，从而促进细胞间粘附，降低 p一catenin转录活性，实现其抑制细胞迁移，增殖和转化的能力。本研究首次证实了受体型酪氨酸磷酸酶pcp一2与p一catenin的相互作用不仅抑制了日一catenin的转录活性和促转化能力，而且促进细胞间粘附并抑制细胞迁移，从而发挥抑癌作用。说明

关键词：受体型酪氨酸磷酸酶 pcp-2 E-钙粘素/β-连环蛋白复合体蛋白相互作用磷酸化转录活性

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