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pck2蛋白序列特征、分子进化与突变分析

石河子大学学报（自然科学版） 2022年第6期40卷 749-757页

作者：薛振左瑶马海东王令王珊珊路宏朝张涛陕西理工大学生物科学与工程学院陕西汉中723001

磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶2(phosphoenolpyruvate carboxykinase 2,pck2)是连接TCA循环、糖酵解和糖异生的枢纽分子,动态调节细胞内的合成代谢以提供足够的能量和代谢中间体。pck2广泛参与糖代谢、脂代谢、衰老、糖尿病以及肿瘤细胞增殖... 详细信息

磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶2(phosphoenolpyruvate carboxykinase 2,pck2)是连接TCA循环、糖酵解和糖异生的枢纽分子,动态调节细胞内的合成代谢以提供足够的能量和代谢中间体。pck2广泛参与糖代谢、脂代谢、衰老、糖尿病以及肿瘤细胞增殖和凋亡等代谢和生物学进程。因此,深入挖掘其潜在功能将为疾病治疗靶点的探究提供帮助。本研究以pck2蛋白为研究对象,对其分子进化特征,蛋白结构信息等方面进行全面分析。首先从蛋白质数据库UniportKB中获取32种代表性物种氨基酸序列,对其进行理化特性分析、多序列比对、Motif分析及系统进化树构建,结果显示,该蛋白包含629~646个氨基酸残基,不同物种pck2蛋白具有高度保守性,且进化树结构基本符合物种亲缘进化规律。基于前期研究发现的pck2突变位点,本研究采用重叠延伸PCR技术构建小鼠pck2基因的突变载体pCD513B-MU-pck2-C3657T。通过多个软件预测分析小鼠pck2突变对其蛋白的影响,结果显示pck2-MU蛋白的理化特性与结构特征均发生明显的改变。进一步在细胞水平分析pck2突变导致HEK293T细胞增殖能力显著降低。研究结果和突变载体可为后续pck2的研究和应用提供借鉴与支撑。

关键词： pck2 突变载体分子进化细胞增殖

pck2在低氧微环境中的表达及功能初步研究

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PCK2在低氧微环境中的表达及功能初步研究

作者：胡云南华大学

学位级别：硕士

[目的]喉癌是常见头颈部恶性肿瘤之一,男性多见。课题组通过定量蛋白质组学技术,筛选得到喉癌相关蛋白磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶2(Phosphoenolpyruvate carboxykinase 2,pck2),通过瞬时转染技术干扰pck2后,初步探讨pck2在低氧微环境中的... 详细信息

[目的]喉癌是常见头颈部恶性肿瘤之一,男性多见。课题组通过定量蛋白质组学技术,筛选得到喉癌相关蛋白磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶2(Phosphoenolpyruvate carboxykinase 2,pck2),通过瞬时转染技术干扰pck2后,初步探讨pck2在低氧微环境中的表达及功能,为阐明喉癌发病的分子机制提供更多实验依据。[方法]1.分析低氧环境下喉癌SCC10A细胞的蛋白质组学结果,筛选出相关蛋白pck2。2.通过Western Blot验证低氧环境下pck2蛋白在喉癌中的表达。3.利用siRNA瞬时转染喉癌SCC10A细胞,采用Western Blot验证抑制pck2表达后SCC10A细胞增殖的影响。5.测定下调pck2后SCC10A细胞中ATP的含量及低氧环境下SCC10A细胞中ATP的含量。6.测定下调pck2后SCC10A细胞中葡萄糖的含量及低氧环境下SCC10A细胞中葡萄糖的含量。7.采用侵袭迁移实验观察下调pck2对SCC10A细胞侵袭迁移的影响。8.采用免疫组织化学的方法检测并分析喉癌组织切片及喉部非癌组织切片中pck2蛋白的表达情况。[结果]1.低氧环境下SCC10A细胞存在105个上调蛋白,50个下调蛋白,选取pck2这一上调蛋白作为目的蛋白。2.与常氧环境相比,在低氧环境下,pck2表达上调。***10A-pck2-siRNA组pck2蛋白表达水平较SCC10A组及SCC10A-NC-siRNA明显降低(Ppck2-siRNA1中pck2蛋白水平下降更明显,故选取pck2-siRNA1组进行后续实验。4.24h、48h、72h后下调pck2的SCC10A细胞的增殖均被抑制。5.下调pck2的SCC10A细胞中葡萄糖含量低于阴性对照组及空白组细胞(Ppck2的SCC10A细胞中ATP含量低于阴性对照组及空白组细胞(Ppck2的SCC10A细胞侵袭能力低于阴性对照组及空白组细胞(Ppck2的SCC10A细胞迁移能力低于阴性对照组及空白组细胞(Ppck2在喉癌组织中的表达多呈阳性,在喉部非癌组织中多呈阴性(P2在低氧微环境中高表达。2.下调pck2能抑制喉癌SCC10A细胞的增殖和侵袭迁移。***-1与pck2蛋白的表达与喉癌临床分期和淋巴结转移呈正相关。GLUT-1与pck2在喉癌组织中的表达呈正相关。

关键词：喉癌 pck2 ATP 低氧

pck2响应谷氨酰胺缺失影响肿瘤细胞生长和脂代谢的机制研究

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PCK2响应谷氨酰胺缺失影响肿瘤细胞生长和脂代谢的机制研究

作者：张巧霞河南大学

学位级别：硕士

背景和目的随着人口老龄化,癌症负担持续增长,癌症也成为最常见的死因。且随着人民生活方式的改变,消化系统肿瘤已成为重要的公共卫生问题,其中,结肠癌的发病率是胃肠道肿瘤中的第三名。肿瘤微环境中癌细胞的代谢重编程通常响应增加的... 详细信息

背景和目的随着人口老龄化,癌症负担持续增长,癌症也成为最常见的死因。且随着人民生活方式的改变,消化系统肿瘤已成为重要的公共卫生问题,其中,结肠癌的发病率是胃肠道肿瘤中的第三名。肿瘤微环境中癌细胞的代谢重编程通常响应增加的营养、翻译和增殖需求而发生,以最大限度地提高它们对不断变化的环境的适应性。癌细胞在糖和氧气存在下表现出很高的糖酵解率以促进增殖,但在糖有限制的情况下,糖异生中第一个限速酶的线粒体型磷酸烯醇式丙酮酸激酶2(Phosphoenolpyruvate carboxykinase,mitochondrial,pck2)可调节癌细胞的营养代谢方式,从谷氨酰胺提供碳源,维持癌细胞的能量来源;研究表明脂肪和肌肉组织中存在三种重要的脂质信号通路(丙酮酸代谢、胰岛素信号通路和脂肪细胞因子信号通路),这些途径中的关键常见差异表达基因(DEG)包括磷酸烯醇丙酮酸羧激酶2(pck2),乙酰辅酶A羧化酶ACC以及丝裂原活化蛋白激酶(AMPK)基因家族。乙酰辅酶A羧化酶(ACC)催化乙酰辅酶A的羧化形成丙二酰辅酶A,其在哺乳动物中,存在两种具有不同生理功能的同工酶:胞质型ACC1参与新生脂肪生成(DNL),线粒体型ACC2参与线粒体β氧化的负调节,然而,pck2是否影响人体内参与脂质信号通路尚不清楚。为研究谷氨酰胺饥饿处理后有哪些分子机制或者信号通路参与到应激后的代谢重编程调控,本课题组前期在人肝癌细胞系Hep G2中进行谷氨酰胺缺失处理48 h,随后进行RNA-seq测序,通过对测序结果进行差异基因筛选,筛选出在谷氨酰胺缺失处理后m RNA表达明显上调的8个基因:STC2、CHAC1、ASNS、TRIB3、DDIT3、pck2、OSGIN1、GDF15,本研究选择pck2作为研究对象,前期研究表明pck2在谷氨酰胺缺失条件下表达升高,且参与肿瘤细胞代谢重编程,但是否影响肿瘤细胞增殖尚不清楚,pck2参与代谢后如何发挥作用尚待研究。综上,本研究重点探讨pck2在谷氨酰胺缺失条件下表达升高及其对细胞的增殖、代谢产生影响的相关分子机制,为未来癌证的预防、诊断及治疗提供新的理论依据和治疗靶点。方法1.选择HCT116和HepG2细胞株作为细胞模型,采用含有谷氨酰胺和不含谷氨酰胺的DMEM培养基培养细胞0 h、24 h、48 h,通过蛋白免疫印迹(Western blot)和实时荧光定量PCR(q PCR)实验检测pck2蛋白和m RNA表达水平的变化情况。2.选择239 T细胞作为包装慢病毒的工具细胞,采用慢病毒包装针对pck2的sh RNA,并感染HCT116和Hep G2细胞,筛选稳定敲低pck2细胞株。3.构建PCDH-pck2过表达质粒,通过慢病毒包装并感染HCT116和Hep G2细胞,筛选稳定过表达细胞株,联合谷氨酰胺缺失模型,通过细胞单克隆、CCK-8的增殖及Ed U实验,检测pck2对细胞增殖的影响;另构建3x Flag-PCDH-pck2载体,用于外源性IP实验。***116细胞敲低pck2检测细胞周期相关蛋白的表达水平。***116细胞中敲低pck2,通过Western blot检测糖酵解、三羧酸循环、脂质合成过程关键蛋白表达水平。6.采用RNA Immunoprecipitation(RIP)实验检测pck2蛋白与p53的m RNA是否结合。*** G2细胞中敲低pck2,加入转录抑制剂放线菌素D(Actinomycin D),分别收取0 min、15 min、30 min、45 min、60 min的细胞,通过q PCR检测P53的m RNA表达水平。8.在稳定敲低pck2的HCT116和Hep G2细胞中,采用中性脂肪酸的尼罗红(Nile red)染色检测脂质沉积情况,以探讨敲低pck2后,影响脂质沉积的分子机制。结果***116和Hep G2细胞在谷氨酰胺缺失条件下分别培养0 h、24 h、48 h之后,Western blot和q PCR结果表明pck2的蛋白水平及m RNA水平均随缺失时间延长呈升高趋势;2.在HCT116和Hep G2细胞中稳定敲低pck2,通过细胞单克隆、CCK-8增殖及Ed U标记实验表明,敲低pck2可显著抑制细胞增殖,且谷氨酰胺缺失后仍显示抑制增殖;过表达pck2可促进细胞增殖;3.在HCT116细胞敲低pck2,结果表明周期蛋白Cyclin E1和Cyclin B1表达水平明显降低;4.敲低pck2后,糖酵解、三羧酸循环相关蛋白表达没有明显变化,脂质合成酶ACC1蛋白水平明显升高;pck2过表达后ACC1蛋白水平明显降低;***116和Hep G2中敲低pck2,尼罗红染色实验表明脂质沉积明显增加,过表达pck2,脂质沉积明显减少。结论:***2定位在线粒体,响应

关键词：结直肠癌肝癌脂质合成 pck2 ACC1 p53

代谢酶pck2在非小细胞肺癌中的表达及功能

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临床与实验病理学杂志 2019年第9期35卷 1065-1069页

作者：陈德和于观贞陈颖李和根四川省巴中市中心医院呼吸内科巴中636000 上海中医药大学附属龙华医院肿瘤科上海200032 海军军医大学附属长海医院消化内科上海200433

目的探讨pck2在非小细胞肺癌组织中的表达及临床意义,干扰或过表达pck2对肺癌细胞增殖和迁移能力的改变。方法构建含有75例非小细胞肺癌的组织芯片,采用免疫组化SP法检测pck2在肺癌组织中的表达,分析pck2过表达与临床病理特征的关系。构... 详细信息

目的探讨pck2在非小细胞肺癌组织中的表达及临床意义,干扰或过表达pck2对肺癌细胞增殖和迁移能力的改变。方法构建含有75例非小细胞肺癌的组织芯片,采用免疫组化SP法检测pck2在肺癌组织中的表达,分析pck2过表达与临床病理特征的关系。构建pck2-siRNA和过表达质粒,分别转染肺癌细胞,CCK8实验检测细胞增殖能力和Transwell小室实验检测细胞迁移能力。结果所有肺癌组织和癌旁非肿瘤组织中pck2均呈不同程度表达,pck2在肺癌组织中的过表达率为66.7%(50/75),pck2过表达与淋巴结转移和TNM分期密切相关(Ppck2表达后肺癌细胞增殖能力改变不显著,但迁移能力明显抑制,抑制率高达70.1%(Ppck2后肺癌细胞增殖能力无变化,但迁移能力上调2.5倍(Ppck2与肺癌转移和TNM分期相关,pck2具有促进转移功能,pck2有望成为预测肺癌转移的重要标志物,甚至可能成为肺癌治疗的潜在靶点。

关键词：肺肿瘤非小细胞肺癌 pck2 转移

PURA调控pck2转录促进食管癌发生发展的机制研究

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PURA调控PCK2转录促进食管癌发生发展的机制研究

作者：孙艳北京协和医学院

学位级别：硕士

食管鳞状细胞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)由于其局部浸润和远处转移的特点,是最致命的胃肠道恶性肿瘤之一。PURA基因编码的富含嘌呤元件结合蛋白 α(purine-rich element binding protein alpha,PURα)是一种在进化上... 详细信息

食管鳞状细胞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)由于其局部浸润和远处转移的特点,是最致命的胃肠道恶性肿瘤之一。PURA基因编码的富含嘌呤元件结合蛋白 α(purine-rich element binding protein alpha,PURα)是一种在进化上高度保守的DNA/RNA结合蛋白,在基因的转录调控、mRNA的运输和翻译以及DNA修复中发挥重要作用。本实验室一直研究PURA基因在ESCC中潜在的功能和作用机制。为了探究PURα在ESCC中的功能和作用机制,我们首先构建了 KYSE510-PURα稳定细胞系来进行ChIP-seq实验。在全基因组层面,功能富集分析PURα所调控的基因,发现PURα与转录起始、蛋白结合和突触小泡膜等功能和代谢通路、单纯疱疹病毒1感染和阿米巴病等通路相关,这提示PURα可能参与多种功能的生物学过程。PURα结合motif特征分析发现,PURα结合的特征主要为己报道过的“GGN”,“GA”和“GC”motif,还发现了一些新的 motif,如“TTN”,“TA”和“TC”。为了探究PURα在ESCC中是否具有其他功能和作用,我们重新分析了前期KYSE510-pCMV6/PURα的RNA-seq数据,发现PURα与氧化磷酸化和脂肪酸代谢呈正相关。然后整合RNA-seq和ChIP-seq数据综合分析并筛选出20个与代谢相关的上调基因,其中排名前三的基因分别是ATP5J2,COX5B和pck2。为了进一步探究PURα调控基因的具体机制,我们利用ALLGEN PROMO在线网站预测分析发现线粒体型磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(mitochondrial phosphoenolpyruvate carboxykinase,pck2)基因的启动子区存在PURα的结合位点,可能受其调控。结合ChIP-seq数据的可视化分析,进一步证实了PURα结合pck2启动子区的区域为Chr14:24093172-24093825。通过点突变和截短体的双荧光素酶报告基因实验以及ChIP-PCR/qPCR验证,发现PURα可以直接结合pck2启动子区的S1位点(GGGAGGCGGA),且PURα结合的核心区域为转录起始位点(transcriptional start site,TSS)上游的-727/-382。分别干扰KYSE170和KYSE510细胞中PURα的表达,通过Western blotting检测发现KYSE510细胞中外源过表达PURα,促进了 pck2的转录和蛋白水平,而在KYSE170细胞中敲降PURα,显著抑制了 pck2的转录和蛋白水平。为了初步探究PURα和pck2对ESCC的代谢影响和其他功能,我们分别构建了稳定敲降PURα的KYSE170细胞、稳定敲降pck2的KYSE510细胞和稳定过表达pck2的KYSE170细胞,然后进行了代谢表型实验。结果显示相比对照组,KYSE1 70-shPURα32/34细胞显示出更低的糖酵解和线粒体呼吸能力,而KYSE510-shpck2-1/2细胞仅显示出更低的糖酵解能力,KYSE170-Lv5-pck2细胞也仅显示出更高的糖酵解能力,对细胞的线粒体呼吸能力都没有影响。回复性实验发现,KYSE510-shCtrl/shpck2-1/2 细胞中过表达 PURα-NLS 仅能回复 shCtrl组的 pck2蛋白水平,对shpck2-1/2组中的pck2蛋白水平几乎没有影响。功能性实验发现,KYSE170-Lv5/Lv5-pck2细胞中过表达的pck2能促进KYSE170细胞的增殖、侵袭和迁移能力。综上研究结果提示,ESCC细胞中异常表达的PURα可以通过结合于pck2启动子区的GGGAGGCGGA位点,促进其转录和表达。PURα可以促进ESCC细胞的糖酵解和线粒体呼吸的能力,而pck2仅能促进ESCC细胞的糖酵解能力,还可以促进其增殖、侵袭和迁移的能力。

关键词： PURα pck2 ESCC 转录调控肿瘤代谢

曲古菌素A基于pck2调控缺血心肌代谢的机制研究

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曲古菌素A基于PCK2调控缺血心肌代谢的机制研究

作者：惠文婷吉林大学

学位级别：硕士

心肌缺血伴随着心脏能量产生和利用的失衡,近年由于代谢组学检测技术的发展,丰富了目前对缺血心肌能量代谢变化的认知。这些代谢变化主要是由于氧供应的减少,导致氧化磷酸化、三羧酸循环等代谢途径受阻,无氧糖酵解产能途径被激活,糖酵... 详细信息

心肌缺血伴随着心脏能量产生和利用的失衡,近年由于代谢组学检测技术的发展,丰富了目前对缺血心肌能量代谢变化的认知。这些代谢变化主要是由于氧供应的减少,导致氧化磷酸化、三羧酸循环等代谢途径受阻,无氧糖酵解产能途径被激活,糖酵解产物乳酸的蓄积,会造成细胞内酸中毒,诱发进一步的心肌功能障碍。因此,调节心肌缺血状态下三羧酸循环与糖酵解,可能为干预缺氧诱导的心肌损伤的新策略。线粒体磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(Phosphoenolpyruvate Carboxykinase 2,pck2)是连接三羧酸循环与糖酵解、糖异生的关键酶。文献报道,磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶各亚型参与生理过程和多种疾病的进展。pck2过表达可能导致肿瘤细胞等能量代谢异常,抑制pck2表达可缓解心肌病理学肥大,提示pck2参与调控损伤心肌的代谢过程。但pck2在缺血心肌代谢中发挥的作用尚未阐明。课题组前期研究表明,曲古菌素A(Trichostatin A,TSA)可明显减轻大鼠心肌缺血损伤,参与心肌缺血的损伤修复。但目前TSA对缺血心肌代谢的调控作用尚未阐明。已有研究表明,TSA可以通过调控肿瘤细胞代谢重编程,包括三羧酸循环和糖代谢等过程,干预细胞增殖与功能。据此,我们推测TSA可能通过调控缺血心肌代谢,影响心肌缺血性损伤。研究目的:本研究拟采用生物信息学方法分析TSA的作用通路,筛选参与调控缺血心肌代谢的信号通路及关键基因,并通过体内外实验验证关键差异基因在缺血心肌中的作用;进一步探究TSA基于调控心肌缺血代谢的关键差异基因,影响缺血心肌代谢紊乱,干预心肌缺血的作用机制。实验方法:本实验采用结扎冠状动脉左前降支的方法建立大鼠心肌缺血模型;采用TTC染色方法,检测TSA对大鼠心肌梗死面积的影响;采用MTT方法,检测TSA对氧糖剥夺条件下大鼠心肌细胞H9c2存活率的影响;通过DAVID网络分析平台对TSA作用靶点及心肌缺血代谢物调控基因进行富集分析;采用RT-q PCR方法,验证调控大鼠缺血心肌代谢的差异表达基因及TSA对其表达的影响;通过瞬时转染si RNA抑制H9c2细胞关键差异基因表达,观察相关代谢指标变化;采用Western blot和免疫荧光方法,检测不同条件下大鼠心肌缺血组织和氧糖剥夺条件下H9c2细胞中目的蛋白表达;使用JASPAR数据库分析转录因子与关键差异基因作用位点;采用比色法检测大鼠心肌组织及H9c2细胞中三羧酸循环关键酶琥珀酸脱氢酶活性,以及大鼠血清和H9c2细胞上清中糖代谢关键产物丙酮酸、乳酸含量,评价心肌代谢情况。实验结果:***对缺血心肌的保护作用TTC染色结果显示,TSA可显著降低心肌缺血大鼠的心肌梗死面积(P2的存活率(P2位。对参与调控代谢通路的TSA靶基因进行Go Terms富集和KEGG pathway分析,获得代谢相关通路165条,其中TSA对磷脂酰肌醇信号通路和糖代谢通路具有重要调控作用。基于Pubmed数据库检索心肌缺血代谢生物标志物,通过构建metabolitegene网络分析获得调控代谢标志物基因,并筛选出651个尚未被证明与心肌缺血相关的代谢调控基因。采用蛋白质互作网络分析等方法确定183个核心基因并进行Go Terms富集和KEGG pathway分析,明确三羧酸循环在富集到的代谢通路中占重要地位。***影响缺血心肌代谢的潜在调控基因pck2表达基于TSA靶基因生物信息学分析,采用Western Blot方法验证结果表明,TSA可激活缺血7天后心肌组织中Akt,抑制m TOR(Ppck2是缺血心肌组织中与三羧酸循环相关差异表达最明显的基因(Ppck2 m RNA表达(P2细胞中,pck2蛋白的表达均有显著下调(Ppck2对缺血心肌代谢的调控作用机制三羧酸循环关键酶琥珀酸脱氢酶检测结果显示,心肌缺血大鼠的心肌组织中琥珀酸脱氢酶活性显著降低(P2细胞中琥珀酸脱氢酶活性显著降低(Ppck2后,增加琥珀酸脱氢酶活性(P<

关键词：心肌缺血代谢曲古菌素A pck2

PRAK负调控pck2促进黑色素瘤A375细胞侵袭和迁移的作用研究

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PRAK负调控PCK2促进黑色素瘤A375细胞侵袭和迁移的作用研究

作者：肖瑶锦州医科大学

学位级别：硕士

目的通过在人黑色素瘤A375细胞中,建立过表达和沉默表达线粒体磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（Mitochondrial phosphoenolpyruvate carboxykinase,pck2）的体外肿瘤模型,探究p38调节/激活激酶（p38 Regulated/activated protein kinase,PRAK）负调控pck2对A375细胞增殖、侵袭和迁移的影响。方法首先利用Illumina高通量测序平台（HiSeq）对小鼠黑色素瘤的野生型细胞（B16-F10）和PRAK敲除型（Prak-/-B16-F10）细胞进行测序,并采用DESeq2差异分析法对PRAK敲除后的差异表达基因进行筛选,利用GO和KEGG数据库对差异基因进行功能显著性富集分析。采用实时荧光定量PCR（Quantitative real-time PCR,qRT-PCR）法,检测B16-F10、Prak-/-B16-F10细胞及不同浓度PRAK抑制剂XZP-0353处理的人黑色素瘤细胞（A375）、人结肠癌细胞（HCT116）和人乳腺癌细胞（MDA-MB-231）中差异基因mRNA的表达。进一步地,设计并构建针对pck2的siRNA以及pck2过表达载体质粒,瞬时转染至A375细胞,采用CCK-8实验检测细胞的增殖能力,采用Transwell侵袭实验检测细胞的侵袭能力,采用划痕实验检测细胞的迁移能力。结果通过分析RNA-seq的结果,共获得差异表达基因1000个,其中上调表达基因828个（82.8%）,下调表达基因172个（17.2%）。差异表达基因GO富集的生物过程主要包括细胞运动、细胞黏附和细胞发育等;富集的细胞成分主要包括细胞膜、应力纤维和细胞质核周区等;富集的分子功能主要有糖蛋白结合、细胞骨架蛋白结合和纤连蛋白结合等。KEGG富集分析表明显著差异表达基因富集在MAPK、p53和糖酵解/糖异生等10个信号通路中。根据差异基因筛选结果,选出6个与肿瘤增殖、侵袭及迁移密切相关的基因（上调表达基因:Id3、Cst6和St3gal1;下调表达基因:Timp3、Ccng2和pck2）。B16-F10及Prak-/-B16-F10细胞的qRT-PCR检测结果显示,上述6个基因的mRNA表达情况与RNA-seq结果一致。用不同浓度的PRAK抑制剂XZP-0353分别处理A375、HCT116和MDA-MB-231细胞,并检测上述6个基因mRNA的表达,最终筛选出pck2基因用于后续实验。CCK-8实验表明pck2过表达或敲减对A375细胞的增殖能力均无影响,且PRAK负调控pck2亦对A375细胞的增殖能力无影响;Transwell侵袭实验表明pck2过表达能显著抑制A375细胞的侵袭能力,而pck2敲减能显著促进A375细胞的侵袭能力,且PRAK负调控pck2能增强A375细胞的侵袭能力;划痕实验表明pck2过表达能显著抑制A375细胞的迁移能力,而pck2敲减能显著促进A375细胞的迁移能力,且PRAK负调控pck2能增强A375细胞的迁移能力。结论pck2过表达能够显著抑制A375细胞的侵袭和迁移;pck2敲减能够显著促进A375细胞的侵袭和迁移;PRAK负调控pck2能增强A375细胞的侵袭和迁移能力;pck2过表达或敲减以及PRAK抑制剂的加入均对A375细胞的增殖能力无影响。

关键词： PRAK pck2 肿瘤侵袭肿瘤转移黑色素瘤

苦参碱抑制高糖诱导的人腹膜间皮细胞凋亡的相关研究

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苦参碱抑制高糖诱导的人腹膜间皮细胞凋亡的相关研究

作者：梁靖梅广西医科大学

学位级别：硕士

目的:腹膜透析(Peritoneal dialysis,PD)是常见的肾脏替代疗法之一。腹膜透析有着较低的经济成本、更佳的残余肾功能保护作用和更为便捷的操作方式,使得终末期肾脏病(End-stage Renal Disease,ESRD)人群在排出体内素毒超滤体内过多水分... 详细信息

目的:腹膜透析(Peritoneal dialysis,PD)是常见的肾脏替代疗法之一。腹膜透析有着较低的经济成本、更佳的残余肾功能保护作用和更为便捷的操作方式,使得终末期肾脏病(End-stage Renal Disease,ESRD)人群在排出体内素毒超滤体内过多水分时享有更高的生活质量。然而,在不断交换腹膜透析液的过程中,腹膜将逐步发生纤维化,最终导致透析效率低下,是PD患者被迫退出腹膜透析更换肾脏替代治疗方式的主要诱因。选择腹膜透析的人数在全球范围内不断增长,对腹膜透析技术也提出更高的要求。因此,如何防治透析相关并发症是当前亟待解决的重要临床问题。所以,腹膜形态及功能的存续和防治并发症的药物开发成为腹膜透析研究的热点。尽管腹膜纤维化的分子机制尚未被详细阐述,研究人员发现,腹膜间皮细胞凋亡水平升高这一现象在腹膜发生纤维化的早期过程中已经出现,同时伴随着细胞凋亡相关的分子及信号通路被激活等情况发生。所以,为了更好地保护腹膜的形态与功能完整,延长腹膜透析患者的透析龄,调节腹膜间皮细胞的异常凋亡是基础而核心的方式。本研究设计实验,探讨苦参碱(Matrine,Mat)对高糖(high glucose,HG)诱导的人腹膜间皮细胞异常凋亡的作用,为探索保护腹膜功能和延长透析时间的药物开发提供科学依据。方法:使用100mM HG刺激人腹膜间皮细胞,诱导细胞凋亡率升高,同时给予0.4、0.6、0.8 mg/ml三个浓度梯度的苦参碱溶液进行处理,使用流式细胞术(Flow cytometry)检测细胞凋亡水平,通过实时荧光定量PCR(RT-PCR)和免疫蛋白印迹(Western blotting,WB)检测凋亡相关基因Bcl-2的mRNA和蛋白表达水平,根据流式细胞术、RT-PCR和Western Blot实验结果综合判断HG能否诱导细胞凋亡率升高,以及苦参碱是否能抑制人腹膜间皮细胞的凋亡异常。如果苦参碱能够缓解高糖诱导的细胞凋亡异常情况,则选抑制凋亡的最佳苦参碱浓度进行后续实验。查阅文献并分析比对其他课题组的测序结果,推测磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶2(pck2)可能是苦参碱抑制细胞凋亡的潜在调控基因,进一步验证苦参碱是否通过调控pck2的表达量变化抑制高糖诱导的细胞凋亡。使用RNAi技术敲减差异基因,观察腹膜间皮细胞的凋亡变化,继而在敲减该差异基因后再次给予高糖和苦参碱进行干预,探讨苦参碱对高糖诱导的人腹膜间皮细胞凋亡是否仍具有抑制作用。结果:(1)100mM HG可使人腹膜间皮细胞的活力降低,0.4、0.6和0.8mg/ml苦参碱均能恢复细胞活力。同时,100mM HG显著诱导人腹膜间皮细胞凋亡率升高,三个浓度的苦参碱均对HG诱导的人腹膜间皮细胞凋亡率升高具有缓解作用。RT-PCR和Weston Blot结果提示,HG能使凋亡相关基因Bcl-2的mRNA和蛋白表达量减少,0.4mg/ml苦参碱干预后,Bcl-2的mRNA和蛋白表达量增加。综合分析后选择0.4mg/ml苦参碱进行后续实验。(2)实时荧光定量PCR结果提示,HG诱导pck2的mRNA和蛋白表达水平降低,苦参碱可使pck2的mRNA和蛋白表达水平恢复。(3)通过RNAi技术成功敲减pck2基因,流式细胞术检测发现敲减pck2后人腹膜间皮细胞凋亡率增加,实时荧光定量PCR和Weston Blot检测发现Bcl-2的mRNA和蛋白表达含量降低。(4)敲减pck2后,再次使用HG和苦参碱对细胞进行干预。流式细胞术发现,敲减pck2后苦参碱无法逆转HG诱导的细胞凋亡率增加,分析RT-PCR实验和Western Blot检测结果发现苦参碱未能恢复HG诱导的pck2和Bcl-2的mRNA和蛋白表达含量发生变化。结论:通过调节pck2的表达,苦参碱对高糖诱导的人腹膜间皮细胞凋亡具有抑制作用。

关键词：苦参碱人腹膜间皮细胞 pck2 细胞凋亡腹膜纤维化