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中国兽医学报 2016年第3期36卷 469-474页

作者：童丽艳喻召武繆士涛郑雯王远宫兴文浙江工商大学食品与生物工程学院浙江杭州310018

大肠杆菌(***)是一种常见的致病菌,大肠杆菌的黏肽合成酶pbp1b对于它的细胞壁合成和存活具有至关重要的作用,是β-内酰胺类抗生素的作用靶点。但是,由于抗生素滥用等原因,目前已造成了大肠杆菌对β-内酰胺类抗生素较强的耐药性。本研究... 详细信息

大肠杆菌(***)是一种常见的致病菌,大肠杆菌的黏肽合成酶pbp1b对于它的细胞壁合成和存活具有至关重要的作用,是β-内酰胺类抗生素的作用靶点。但是,由于抗生素滥用等原因,目前已造成了大肠杆菌对β-内酰胺类抗生素较强的耐药性。本研究针对大肠杆菌的黏肽合成酶pbp1b,通过分子对接软件DOCK6.5进行虚拟筛选,以期得到具有全新结构的高亲和力的先导化合物,用作新型抗菌药物。我们对含104万个化合物的ZINC数据库进行了虚拟筛选,以grid score进行了第1轮打分,得到分值在-30kcal/mol以下的化合物约6万个,从中挑选出打分高的600个化合物进入第2轮筛选,采用amber score进行第2轮打分,筛出分值在-20kcal/mol以下的化合物约200个。对这些化合物进行分析,最终挑选2种打分高并且结构新颖的先导化合物,并进行了有机合成。采用MH肉汤稀释法检验了先导化合物的抗菌活性,发现先导化合物对常见革兰阳性菌和革兰阴性菌均有抗菌活性,并且抗菌活性比具有相似结构的磺胺嘧啶更强。因此,这2种先导化合物有望进一步开发为新型抗菌药物。

关键词：细菌耐药性虚拟筛选大肠杆菌黏肽合成酶 pbp1b DOCK6.5

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高表达GFP-pbp1b融合蛋白的猪链球菌菌株的构建及pbp1b蛋白细胞定位的研究

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中国预防兽医学报 2023年第11期45卷 1101-1107页

作者：武柳君卫东高广娟陈平刘思国张跃灵新疆农业大学动物医学学院新疆乌鲁木齐830052 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所动物疫病防控全国重点实验室/动物细菌病创新团队黑龙江哈尔滨150069

为鉴定猪链球菌(Streptococcus suis)A型青霉素结合蛋白pbp1b在***中的细胞定位,本研究经PCR扩增*** pbp1b基因融合位点上下游序列UP和DN、强启动子Peno基因片段及绿色荧光蛋白(GFP)gfp基因片段,再通过重叠延伸PCR扩增构建融合片段UP-Pe... 详细信息

为鉴定猪链球菌(Streptococcus suis)A型青霉素结合蛋白pbp1b在***中的细胞定位,本研究经PCR扩增*** pbp1b基因融合位点上下游序列UP和DN、强启动子Peno基因片段及绿色荧光蛋白(GFP)gfp基因片段,再通过重叠延伸PCR扩增构建融合片段UP-Peno-GFP-DN。利用同源重组的方法将UP-Peno-GFP-DN转化含反向筛选标记的PSS-pbp1b中间菌株,经含7%蔗糖的TSAS平板筛选,挑单菌落进行PCR及测序鉴定。PCR及测序鉴定结果显示,获得的重组菌株中Peno-gfp片段替换了PSS-pbp1b中的PSS片段,表明融合强启动子Peno、GFP及pbp1b(GFP-pbp1b)的重组菌株P-GFP-pbp1b正确构建。以*** 05ZYH33株和本实验室前期构建的GFP-pbp1b为对照,培养P-GFP-pbp1b菌株并测定OD600nm值,绘制各菌株的生长曲线;采用western blot检测P-GFP-pbp1b菌株中GFP-pbp1b融合蛋白的表达水平,并与GFP-pbp1b菌株进行比较;利用Alexa Fluor 633-WGA染色,经超高分辨显微镜观察GFP-pbp1b和P-GFP-pbp1b菌株形态及GFP-pbp1b融合蛋白在***细胞中的定位。生长曲线结果显示,***融合菌株GFP-pbp1b和P-GFP-pbp1b均正常生长;western blot结果显示,GFP-pbp1b和P-GFP-pbp1b菌株均能够表达GFP-pbp1b融合蛋白,但强启动子驱动的P-GFP-pbp1b菌株中GFP-pbp1b蛋白表达量较GFP-pbp1b菌株提高了6倍(P1);超高分辨显微镜观察结果显示,GFP-pbp1b和P-GFP-pbp1b菌株形态均正常,GFP-pbp1b菌株中GFP荧光较弱,难以定位GFP-pbp1b,而P-GFP-pbp1b菌株中GFP荧光较强,能够明显观察到融合蛋白GFP-pbp1b定位在***的细胞横隔和两极。本研究通过构建高表达GFP-pbp1b融合蛋白的P-GFP-pbp1b菌株首次观察到pbp1b在***中的细胞定位,为进一步研究pbp1b在***细胞壁肽聚糖合成中的作用奠定了基础。

关键词：猪链球菌荧光蛋白融合菌株 A型青霉素结合蛋白 pbp1b 细胞壁肽聚糖合成

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大肠杆菌pbp1b和铜绿假单胞菌pbp3的表达纯化

大肠杆菌PBP1b和铜绿假单胞菌PBP3的表达纯化

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作者：安艳冬浙江工商大学

学位级别：硕士

抗生素的滥用导致细菌的耐药性越来越严重,多重耐药菌株开始出现,甚至出现了对几乎所有抗生素都耐药的“超级细菌”,严重威胁人类健康。大肠杆菌(E. coli)和铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)是临床上的两种条件致病菌,由于大肠杆... 详细信息

抗生素的滥用导致细菌的耐药性越来越严重,多重耐药菌株开始出现,甚至出现了对几乎所有抗生素都耐药的“超级细菌”,严重威胁人类健康。大肠杆菌(E. coli)和铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)是临床上的两种条件致病菌,由于大肠杆菌黏肽合成酶pbp1b(penicillin-binding protein1b)和铜绿假单胞菌黏肽合成酶pbp3(penicillin-binding protein3)的结构和数量的改变造成两种细菌耐药。同时,这两种蛋白负责细菌细胞壁的合成,对这两种细菌的存活具有至关重要的作用。因此,本文通过基因工程方法制备这两种蛋白,作为筛选新型抗菌药的靶点。用基因组DNA提取试剂盒分别抽提大肠杆菌标准株CMCC44102和铜绿假单胞菌标准株CMCC10104基因组DNA作为PCR扩增模板,根据大肠杆菌标准株ATCC8739(Genbank登记编号为CP000946)的pbplb基因Mrcb序列和铜绿假单胞菌标准株PAO1(ATCC15692)(Genbank登记编号为NC002516)的pbp3基因ftsl序列设计引物,进行PCR扩增,获得Mrcb和ftsl片段。利用DNA凝胶回收试剂盒进行回收纯化,连接至pMD19-T+simple载体中构建克隆质粒pMD19-T-pbp1b和pMD19-T-pbp3,转化至E. coli DH5α。用限制性内切酶Nde I、Xho I从pMD19-T-pbp1b和pMD19-T-pbp3中切下Mrcb和ftsl片段,亚克隆至同样双酶切的质粒pET44b (+)中,构建重组表达质粒pET44b(+)-pbp1b和pET44b(+)-pbp3。将重组表达质粒pET44b(+)-pbp1b和pET44b(+)-pbp3分别转入E. coli bL21中,IPTG诱导表达。结果表明,重组蛋白在Amp浓度100μg/mL、培养温度37℃、培养时间3h、IPTG浓度2mM的条件下进行表达,SDS-PAGE表明pbp1b表达为包涵体形式而pbp3表达为可溶蛋白。将表达获得的可溶蛋白和包涵体分别用Ni2+-NTA亲和层析纯化,平衡缓冲液为20mM PbS、500mM NaCl、20mM咪唑、pH8.0,洗脱缓冲液为20mM PbS、500mM NaCl、200mM咪唑、pH8.0。纯化的包涵体进行缓慢透析复性,纯化、复性后的蛋白透析脱盐,超滤离心管浓缩。 Western-blot方法鉴定重组蛋白。用兔抗His抗体作一抗,螯合HRP的羊抗兔抗体作二抗,DAb显色,均有特异反应条带。将异硫氰酸荧光素(FITC)的活泼-SCN与氨苄青霉素(Amp)N端残基用化学合成方法连接,产物命名为FITC-Amp。作为荧光探针与本文纯化得到的青霉素结合蛋白pbp1b和pbp3反应,经由NATIVE-PAGE分离纯化后,在成像仪的特定波长紫外光照射下能看到荧光条带,表达纯化的蛋白有活性。

关键词：大肠杆菌铜绿假单胞菌 pbp1b pbp3 克隆表达纯化

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