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Ang-（1-7）对低氧诱导pasmcs增殖及PKCα/ERK1/2信号分子表达的影响

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Ang-（1-7）对低氧诱导PASMCs增殖及PKCα/ERK1/2信号分子表达的...

作者：王晓亮山西医科大学

学位级别：硕士

目的:熟练掌握小鼠原代pasmcs获得方法。探讨Ang-(1-7)对氯化钴诱导的小鼠pasmcs的影响,以及PKCα、ERK1/2信号分子的影响。方法:1.选择C57BL/6J小鼠,将含铁粉的恒温琼脂糖经右心室灌肺内,获取肺叶,切碎消化,利用磁性分离器获取含铁肺... 详细信息

目的:熟练掌握小鼠原代pasmcs获得方法。探讨Ang-(1-7)对氯化钴诱导的小鼠pasmcs的影响,以及PKCα、ERK1/2信号分子的影响。方法:1.选择C57BL/6J小鼠,将含铁粉的恒温琼脂糖经右心室灌肺内,获取肺叶,切碎消化,利用磁性分离器获取含铁肺动脉进行原代及传代细胞培养。用平滑肌细胞特异性抗体对细胞进行免疫荧光鉴定。2.在24 h、48 h、72 h时间点,以不同浓度的氯化钴(0、50、100、200、400μmol/L)对pasmcs进行处理,并用CCK-8测定各实验组的OD值,探讨氯化钴对pasmcs的最适作用时间和最佳实验浓度。3.将pasmcs用氯化钴、Ang-(1-7)及其Mas受体拮抗剂A779进行干预,分组:常氧组、常氧+Ang-(1-7)组、氯化钴组、氯化钴+Ang-(1-7)组、氯化钴+Ang-(1-7)+A779组和氯化钴+A779组。4.CCK-8和流式细胞术检测各处理组pasmcs的增殖情况。用qRT-PCR和Western-blot检测PKCα、ERK1/2信号分子表达情况。结果:1.我们熟练掌握了小鼠原代pasmcs培养和传代技术。使用pasmcs特异性α-SMA抗体免疫荧光鉴定提示,超过90%的细胞呈阳性表达。2.CCK-8法检测不同浓度氯化钴处理24 h、48 h、72 h后pasmcs的增殖情况:处理24 h后,与常氧组比较,50μmol/L氯化钴组和100μmol/L氯化钴组OD值均较常氧组大(均P0.05)。3.CCK-8法检测Ang-(1-7)及其拮抗剂A779处理后pasmcs细胞增殖情况:不同药物组作用24 h后,与常氧组相比,50组、50+Ang-(1-7)组、50+Ang-(1-7)+A779组和50+A779组OD值增大(均P0.05)。4.流式细胞术检测Ang-(1-7)及其拮抗剂A779处理后pasmcs细胞增殖情况:与常氧组相比,50组、50+Ang-(1-7)+A779组和50+A779组的S+G2期细胞占比明显增多(P0.05)。5.qRT-PCR检测Ang-(1-7)及其拮抗剂处理后PKCα的mRNA表达情况:与常氧组相比,50组、50+Ang-(1-7)组、50+Ang-(1-7)+A779组和50+A779组的PKCα的mRNA表达水平增高(P0.05)。与50组相比,50+Ang-(1-7)+A779组和50+A779组表达均增大(均P>0.05),而50+Ang-(1-7)组的表达无明显差异。6.Westen blot检测Ang-(1-7)及其拮抗剂A779处理后PKCα、ERK1/2蛋白分子表达变化:与常氧组比较,50组、50+Ang-(1-7)组、50+Ang-(1-7)+A779和50+A779组PKCα蛋白表达均升高(均P0.05)。结论:1.运用磁性分离法,可获肺远端小动脉的高纯度原代小鼠pasmcs,可重复性较高,且经济实惠。2.我们成功的完成了化学诱导低氧细胞模型,氯化钴能促进小鼠原代pasmcs增殖,并且最适宜的作用条件为24 h、50μmol/L;随着氯化钴的作用时间和浓度的增加,出现不同程度细胞毒性作用。3.Mas受体拮抗剂A779可加强氯化钴诱导的小鼠pasmcs的增殖,并刺激了PKCα和ERK1/2信号分子的表达。研究发现Ang-(1-7)未对pasmcs的增殖和PKCα、ERK1/2信号分子的表达产生明显影响。

关键词：肺动脉高压 PKC ERK1/2 pasmcs Ang(1-7) 氯化钴

Ang-（1-7）对低氧诱导原代小鼠pasmcs增殖及PKCα/Akt信号分子表达的影响

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Ang-（1-7）对低氧诱导原代小鼠PASMCs增殖及PKCα/Akt信号分子表...

作者：李杰娜山西医科大学

学位级别：硕士

目的:原代培养小鼠pasmcs,建立稳定的小鼠pasmcs培养技术。探讨Ang-(1-7)对低氧诱导小鼠pasmcs的影响,及PKCα、Akt信号分子在低氧诱导小鼠pasmcs中表达的影响。方法:1.选取C57BL/6J健康成年小鼠,自右心室向肺动脉灌注含铁粉的琼脂糖溶... 详细信息

目的:原代培养小鼠pasmcs,建立稳定的小鼠pasmcs培养技术。探讨Ang-(1-7)对低氧诱导小鼠pasmcs的影响,及PKCα、Akt信号分子在低氧诱导小鼠pasmcs中表达的影响。方法:1.选取C57BL/6J健康成年小鼠,自右心室向肺动脉灌注含铁粉的琼脂糖溶液,后将离体肺组织切碎,结合酶消化法和磁性分离法获取小鼠含铁肺动脉血管,置于二氧化碳培养箱中进行原代及传代培养。采用SMCs特异性α-SMA抗体对细胞进行免疫荧光染色鉴定。2.将小鼠pasmcs置于低氧培养箱中低氧处理,使用Ang-(1-7)及Mas受体拮抗剂A779进行药物干预。实验分为六组:常氧组(Normoxia)、常氧+Ang-(1-7)组、低氧组(Hypoxia)、低氧+Ang-(1-7)组、低氧+Ang-(1-7)+A779组和低氧+A779组。3.CCK-8检测各实验组小鼠pasmcs增殖情况。免疫荧光、Western-blot检测各实验组PKCα、Akt蛋白分子表达变化情况。结果:1.成功培养出原代小鼠pasmcs,并顺利传至第3代开展后续试验。经特异性α-SMA抗体免疫荧光染色鉴定显示约90%的细胞呈阳性表达。2.CCK-8法检测各实验组pasmcs低氧培养24h、48h、72h后增殖情况。结果显示,低氧24h后,与常氧组相比,低氧+Ang-(1-7)+A779组和低氧+A779组细胞生存力明显提高;与低氧组比较,低氧+Ang-(1-7)+A779组及低氧+A779组生存力提高明显;低氧+Ang-(1-7)+A779组和低氧+A779组间比较无统计学差异。低氧48h、72h后,与常氧组相比各低氧处理组均显示细胞生存力下降。3.免疫荧光定性分析各实验组PKCα、Akt蛋白分子表达变化。结果显示:与常氧组相比,PKCα蛋白分子在低氧组、低氧+Ang-(1-7)组的表达降低,低氧+Ang-(1-7)+A779组和低氧+A779组的表达升高。而Akt蛋白分子在常氧组、常氧+Ang-(1-7)组、低氧组间表达无明显差异,在低氧+Ang-(1-7)组、低氧+Ang-(1-7)+A779组和低氧+A779组表达有所升高。4.采用免疫印迹技术定量分析各实验组PKCα、Akt蛋白分子表达变化。与常氧组比较,常氧+Ang-(1-7)组、低氧组、低氧+Ang-(1-7)组PKCα蛋白表达均降低,低氧+Ang-(1-7)+A779组及低氧+A779组表达升高;与低氧组相比,低氧+Ang-(1-7)+A779组及低氧+A779组表达显著升高,低氧+Ang-(1-7)组表达无统计学差异;低氧+Ang-(1-7)+A779组与低氧+A779组比较无统计差异。常氧组、常氧+Ang-(1-7)组和低氧组间Akt蛋白表达无统计学差异;与低氧组相比,低氧+Ang-(1-7)组、低氧+Ang-(1-7)+A779组和低氧+A779组Akt蛋白表达均升高;与低氧+Ang-(1-7)组比较Akt蛋白在低氧+Ang-(1-7)+A779组表达升高,同时发现低氧+A779组Akt蛋白表达比低氧+Ang-(1-7)+A779组增多。结论:1.通过酶消化法及磁性分离法结合,可稳定获取较高纯度的小鼠pasmcs。该方法利于获取小鼠远端肺小动脉,易操作,重复性高。2.单纯低氧可能对体外培养原代pasmcs增殖无显著影响,且随着低氧时间的延长细胞可能出现明显的凋亡。抑制Ang-(1-7)特异性Mas受体可促进低氧环境下小鼠pasmcs增殖,该过程可能通过提高PKCα、Akt信号分子的表达实现;Ang-(1-7)可抑制该过程中Akt信号分子表达,但尚未发现对PKCα信号分子表达及细胞增殖的影响。

关键词： pasmcs 增殖低氧蛋白激酶C 蛋白激酶B Ang-(1-7) A779 肺动脉高压

葛根素对PI3K/AKT通路介导pasmcs凋亡的影响

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中国中药杂志 2015年第15期40卷 3041-3046页

作者：张晓丹杨艳南王淑静朱大岭王力维盛洁静宋莎莎哈尔滨商业大学药学院黑龙江哈尔滨150076 哈尔滨医科大学大庆校区黑龙江大庆163319

探讨葛根素(puerarin,Pue)对缺氧抑制的大鼠肺动脉平滑肌细胞(pasmcs)凋亡的影响,并研究细胞外信号PI3K/AKT通路是否参与了Pue诱导pasmcs凋亡的过程。以血清饥饿组(SD组)为对照组,通过噻唑蓝比色法(MTT)、Annexin VFITC凋亡检测试剂盒... 详细信息

探讨葛根素(puerarin,Pue)对缺氧抑制的大鼠肺动脉平滑肌细胞(pasmcs)凋亡的影响,并研究细胞外信号PI3K/AKT通路是否参与了Pue诱导pasmcs凋亡的过程。以血清饥饿组(SD组)为对照组,通过噻唑蓝比色法(MTT)、Annexin VFITC凋亡检测试剂盒和蛋白免疫印迹法检测Pue对大鼠pasmcs凋亡情况的影响。采用蛋白免疫印记法检测PI3K/AKT通路是否参与了Pue诱导缺氧抑制的pasmcs凋亡的进程中。结果显示,1常氧条件下Pue对pasmcs细胞凋亡无影响,缺氧可抑制pasmcs凋亡,常氧及缺氧条件下Pue对TNF-α表达无影响。Pue可以逆转缺氧诱导的Bcl-2(Ppasmcs凋亡,并且可能是通过PI3K/AKT通路调控的。

关键词：葛根素 pasmcs Bcl-2 Bax P-AKT

葛根素通过调控活性氧对缺氧诱导的pasmcs增殖的影响

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中国中药杂志 2015年第15期40卷 3027-3033页

作者：张晓丹王力维王淑静朱大岭杨艳南盛洁静宋莎莎哈尔滨商业大学药学院黑龙江哈尔滨150076 哈尔滨医科大学大庆校区黑龙江大庆163319

探讨葛根素（puerarin,Pue）对缺氧所引起的大鼠肺动脉平滑肌细胞（pasmcs）增殖的影响,并探讨其机制是否通过调控活性氧来实现的。原代培养大鼠pasmcs,选用2~5代用于实验。利用体外噻唑蓝比色法（MTT）、蛋白免疫印记法、流式细胞、DCF... 详细信息

探讨葛根素（puerarin,Pue）对缺氧所引起的大鼠肺动脉平滑肌细胞（pasmcs）增殖的影响,并探讨其机制是否通过调控活性氧来实现的。原代培养大鼠pasmcs,选用2~5代用于实验。利用体外噻唑蓝比色法（MTT）、蛋白免疫印记法、流式细胞、DCFH-DA荧光观察Pue对pasmcs增殖能力的影响。利用蛋白免疫印记法检测ROS是否参与Pue抑制pasmcs增殖的过程。实验分组为：常氧组、缺氧组、缺氧＋Pue组、缺氧＋Pue＋Rotenone组、缺氧＋Rotenone组。其中Rotenone为ROS阻断剂。结果显示,Pue对常氧条件下的pasmcs增殖无影响,可抑制缺氧引起的pasmcs增殖。在常氧和缺氧状态下Pue对pasmcs的肿瘤坏死因子-α（TNF-α）表达均无影响;可以使缺氧导致的细胞周期蛋白（Cyclin A）、细胞增殖核抗原（PCNA）表达下调;DCFH-DA探针证明Pue能逆转缺氧引起的ROS含量升高。Rotenone与Pue均可抑制因缺氧诱导的HIF-1α,Cyclin A,PCNA表达上调且存在协同作用。这些结果说明,Pue可抑制缺氧引起的pasmcs增殖,这一作用可能是通过调控ROS来完成的。

关键词：葛根素 pasmcs 增殖 PCNA Cyclin A HIF-1α ROS

ERK1/2通路在低氧上调大鼠pasmcs钙激活性氯离子通道表达的作用

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中国应用生理学杂志 2017年第1期33卷 47-50页

作者：赵美平马迎春张聪聪黄林静郑梦晓黎关龙应磊王万铁温州医科大学基础医学院病理生理学教研室兰州军区兰州总医院病理科甘肃兰州7300504 浙江省医学科学院卫生学研究所毒理学研究室杭州310013 温州医科大学缺血-再灌注损伤研究所浙江温州325035

目的:探讨钙激活性氯离子通道(CLCA2)在大鼠低氧性肺动脉平滑肌细胞(pasmcs)中m RNA和蛋白表达的变化及其与ERK1/2信号通路的关系。方法:pasmcs随机分为:常氧组(N组),低氧组(H组),DMSO对照组(D组),U0126干预组(U组),Staurosporine aglyc... 详细信息

目的:探讨钙激活性氯离子通道(CLCA2)在大鼠低氧性肺动脉平滑肌细胞(pasmcs)中m RNA和蛋白表达的变化及其与ERK1/2信号通路的关系。方法:pasmcs随机分为:常氧组(N组),低氧组(H组),DMSO对照组(D组),U0126干预组(U组),Staurosporine aglycone干预组(SA组),采用免疫印迹法检测CLCA2蛋白的表达;选用半定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术测定CLCA2 m RNA水平的表达。结果:pasmcs中CLCA2m RNA和蛋白的表达量,H组较N组明显上调(Ppasmcs的表达;ERK1/2通路激活剂-Staurosporine aglycone能下调CLCA2在pasmcs中m RNA和蛋白的表达量;ERK1/2通路抑制剂-U0126可上调CLCA2在pasmcs中m RNA和蛋白的表达量。

关键词：钙激活性氯离子通道低氧 pasmcs ERK1/2 大鼠

牛磺酸通过PI3K/AKT途径对缺氧大鼠pasmcs增殖的影响

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牛磺酸通过PI3K/AKT途径对缺氧大鼠PASMCs增殖的影响

作者：井丽巍哈尔滨商业大学

学位级别：硕士

目的：探讨牛磺酸(Taurine,Tau)在缺氧大鼠肺动脉平滑肌细胞(pulmonary arterial smooth cells,pasmcs)中,是否通过调控PTEN蛋白来抑制PI3K/AKT通路,进而抑制PSMCs的增殖。方法：培养原代pasmcs,选择状态良好的细胞放置培养箱中培养,常... 详细信息

目的：探讨牛磺酸(Taurine,Tau)在缺氧大鼠肺动脉平滑肌细胞(pulmonary arterial smooth cells,pasmcs)中,是否通过调控PTEN蛋白来抑制PI3K/AKT通路,进而抑制PSMCs的增殖。方法：培养原代pasmcs,选择状态良好的细胞放置培养箱中培养,常氧培养箱中培养对照组的细胞,缺氧箱中培养缺氧细胞。Tau浓度为80mmol · L-1, mTOR阻断剂雷帕霉素(Rapamycin)浓度为10μmol · L-1, PI3K/AKT阻断剂LY294002浓度为10μmol · L-1。①MTT法检测不同剂量的Tau对pasmcs增殖活力的影响。采用蛋白免疫印迹法、免疫荧光法检测PTEN的表达。实验分组：常氧组、常氧+Tau组、缺氧组、缺氧+Tau。②采用MTT法、蛋白免疫印记法、免疫荧光法、流式细胞术研究Tau影响pasmcs增殖的信号通路。实验分组：常氧组、缺氧组、缺氧+Tau、缺氧+Tau+LY294002、缺氧+LY294002与常氧组、缺氧组、缺氧+Tau、缺氧+Tau+Rapamycin、缺氧+Rapamycin。结果：①MTT结果显示Tau在缺氧条件下,从80mmol · L-1时牛磺酸可显著抑制pasmcs增殖活力;②Tau可以促进缺氧状态下PTEN(ppasmcs进入S期,从而抑制其增殖。结论：Tau可在缺氧条件促进pasmcs中PTEN蛋白的表达,抑制PI3K/AKT通路的激活,进而抑制缺氧诱导的pasmcs增殖。

关键词：牛磺酸 pasmcs PI3K/AKT PTEN

葛根素对PI3K/AKT通路介导pasmcs凋亡的影响

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葛根素对PI3K/AKT通路介导PASMCS凋亡的影响

作者：杨艳南哈尔滨商业大学

学位级别：硕士

目的：本文研究了葛根素(Pue)对缺氧抑制的大鼠肺动脉平滑肌细胞(pasmcs)凋亡的影响及Pue诱导pasmcs凋亡的分子机制,即Pue是否通过调节PI3K/AKT通路发挥该作用。方法：培养初代pasmcs,2-5代可以给药干预并分组培养,分别在常规培养箱中... 详细信息

目的：本文研究了葛根素(Pue)对缺氧抑制的大鼠肺动脉平滑肌细胞(pasmcs)凋亡的影响及Pue诱导pasmcs凋亡的分子机制,即Pue是否通过调节PI3K/AKT通路发挥该作用。方法：培养初代pasmcs,2-5代可以给药干预并分组培养,分别在常规培养箱中与缺氧培养箱中培养细胞。实验首先观察了Pue对缺氧pasmcs凋亡的影响。以血清饥饿(SD)组为对照组,将细胞分为四组：常氧组(SD组)、常氧+Pue组、缺氧组、缺氧+Pue组,培养24h。采用体外噻唑蓝比色法(MTT)测定常氧及缺氧状态下不同浓度梯度的Pue对pasmcs活力的影响。吖啶橙染色法观察细胞形态,AnnexinV-FITC细胞凋亡检测试剂盒检测细胞凋亡情况,Westernblot测定肿瘤坏死因子(TNF-α)、Bax, Bcl-2及P-AKT的表达。在研究Pue影响pasmcs凋亡的信号通路中。实验分组为：常氧组(SD组)、缺氧组、缺氧+Pue组、缺氧+Pue+LY294002组、缺氧+LY294002组。Pue给药浓度为250μmol·L-。AKT抑制剂(LY294002)浓度为10pmol·L-1,给药时间24h。采用Westernblot法检测PI3K/AKT通路是否参与到Pue诱导缺氧抑制pasmcs凋亡的过程中,分别测定Bax, Bcl-2和P-AKT的表达。结果：MTT结果显示,缺氧可使细胞凋亡减少,抑制了pasmcs凋亡,且浓度为250μmol·L-1时Pue作用效果开始显著,常氧情况下Pue对(?)'ASMCs细胞凋亡无影响;常氧及缺氧条件下Pue对TNF-a的表达无影响。Pue可以逆转缺氧诱导的Bcl-2(ppasmcs的凋亡,而Pue可以诱导缺氧抑制的pasmcs凋亡,并且这种作用可能是通过PI3K/AKT通路调控的。

关键词：葛根素 pasmcs Bcl-2 Bax P-AKT

葛根素通过调控活性氧对缺氧诱导的pasmcs增殖的影响

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葛根素通过调控活性氧对缺氧诱导的PASMCs增殖的影响

作者：王力维哈尔滨商业大学

学位级别：硕士

目的：本文研究了葛根素(Pue)对缺氧的大鼠肺动脉平滑肌细胞(]pasmcs)增殖的作用及Pue抑制pasmcs增殖的作用机制,探讨Pue是否通过活性氧(ROS)来发挥该作用。方法：培养原代pasmcs,第2-5代即可以分组给药培养,细胞分别在正常培养箱与缺... 详细信息

目的：本文研究了葛根素(Pue)对缺氧的大鼠肺动脉平滑肌细胞(]pasmcs)增殖的作用及Pue抑制pasmcs增殖的作用机制,探讨Pue是否通过活性氧(ROS)来发挥该作用。方法：培养原代pasmcs,第2-5代即可以分组给药培养,细胞分别在正常培养箱与缺氧培养箱中进行培养。实验采用体外噻唑蓝比色法(MTT法)测定常氧及缺氧状态下不同浓度梯度的Pue对pasmcs增殖活力的影响。Western blot法检测Pue对大鼠pasmcs中肿瘤坏死因子(TNF-α)表达的影响。采用流式细胞仪测定Pue对pasmcs增殖周期的影响。Western blot法检测Pue对大鼠pasmcs中细胞周期蛋白A(CyclinA).细胞增殖核抗原(PCNA)表达的影响。利用DCFH-DA探针观察Pue对缺氧所产生的活性氧(ROS)含量的影响和Western blot法检测低氧诱导因子(HIF-1α)表达的影响。研究Pue影响I(?)ASMCs增殖的分子机制。根据MTT结果统计Pue给药浓度为250μmol·L-1。ROS的阻断剂鱼藤酮(Rotenone)浓度为2.5μmol·L-1,药物作用时间24h。采用Western blot法检测ROS是否参与到Pue抑制缺氧诱导pasmcs增殖的过程中,分别测定CyclinA、PCNA、HIF-1α的表达。实验分组为：常氧组、缺氧组、缺氧+Pue、缺氧+Pue+Rotenone.缺氧+Rotenone。结果：MTT结果显示缺氧可使细胞增殖活力增加并诱导pasmcs增殖,且从250μmol·L-1浓度时Pue既有显著性差异,常氧状态下Pue对pasmcs细胞增殖无影响;常氧及缺氧条件下Pue对TNF-a的表达也无影响。流式细胞仪检测结果证实,与对照组相比,Pue对常氧状态下的细胞无明显影响,而却对缺氧诱导增殖的细胞有抑制其增殖的作用。Pue能够使缺氧诱导的CyclinA、PCNA、HIF-1α表达下调。Pue可以使缺氧条件下产生的ROS显著下降,说明Rotenone与Pue对ROS有类似的阻断作用。并且均可抑制因缺氧诱导的PCNA、CyclinA、HIF-1α的表达上调,与缺氧单独加Pue或缺氧单独加入Rotenone对比,缺氧+Pue+Rotenone组PCNA、CyclinA、HIF-1α表达下调更显著。结论：缺氧可以诱导pasmcs的增殖,通过以上实验结果表明,Pue可以显著抑制因缺氧诱导的pasmcs增殖,这种作用可能通过抑制缺氧条件下ROS生成来抑制pasmcs增殖。

关键词：葛根素 pasmcs PCNA CyclinA HIF-1α ROS

Cartilage oligomeric matrix protein on the phenotype transformation of pasmcs via BMPRⅡ signaling pathway

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