检索结果-南通市图书馆

携带EGFP与rtTA双基因的逆转录病毒载体的构建及其在pa317细胞中的表达

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热带医学杂志 2012年第12期12卷 1430-1433,1441,F0004页

作者：赵宁邓新燕单于郭中敏深圳大学医学院过敏反应与免疫学研究所广东深圳518060 中山大学实验动物中心广东广州510080

目的构建表达增强型绿色荧光蛋白(EGFP)、rtTA双基因的重组逆转录病毒载体pLXSN-EGFP-rtTA,并在pa317细胞中表达。方法以质粒pEGFP-C1为模板进行PCR反应获得EGFP基因片段,定向插入逆转录病毒载体pLXSN,筛选出正确的重组逆转录病毒载体pL... 详细信息

目的构建表达增强型绿色荧光蛋白(EGFP)、rtTA双基因的重组逆转录病毒载体pLXSN-EGFP-rtTA,并在pa317细胞中表达。方法以质粒pEGFP-C1为模板进行PCR反应获得EGFP基因片段,定向插入逆转录病毒载体pLXSN,筛选出正确的重组逆转录病毒载体pLXSN-EGFP。PCR方法从pTet-on质粒中扩增出rtTA基因,酶切纯化后克隆于逆转录病毒载体pLXSN-EGFP中,限制性内切酶酶切分析及PCR鉴定筛选出正确的重组载体pLXSN-EGFP-rtTA,脂质体介导转染pa317细胞,PCR方法检测pa317细胞内EGFP、rtTA基因,RT-PCR方法检测pa317细胞内rtTA基因的mRNA表达,荧光显微镜观察EGFP基因的表达情况。以NIH3T3细胞为靶细胞测定重组逆转录病毒滴度。结果成功构建了表达EGFP、rtTA双基因的重组逆转录病毒载体,转染pa317细胞后,RT-PCR方法可检测到rtTA基因的mRNA表达,荧光显微镜下可观察到EGFP基因表达所产生的绿色荧光,说明连接有EGFP和rtTA双基因的逆转录病毒载体在pa317细胞中可正常表达,转染pLXSN-EGFP-rtTA载体的pa317细胞可产生4.8×104CFU/ml病毒滴度的重组病毒。结论成功构建表达EGFP、rtTA双基因的重组逆转录病毒载体,该载体可在pa317细胞内正常表达,获得较高滴度的病毒上清。

关键词： pLXSN逆转录病毒载体 rtTA基因 EGFP基因 pa317细胞

携带猪γ干扰素基因逆转录病毒载体的构建及其在猪肾细胞(PK-15)中的表达

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微生物学报 2007年第1期47卷 141-144页

作者：姚清侠刘新文钱平郭东春陈焕春华中农业大学畜牧兽医学院动物病毒室武汉430070

将梅山猪γ干扰素基因定向插入逆转录病毒载体pLXSN(neor),构建逆转录病毒重组质粒,利用脂质体介导法将重组质粒转染逆转录病毒包装细胞系pa317,转染细胞经含G418(400μg/mL)培养基筛选一周后获得稳定产毒的pa317细胞系。从细胞培养上... 详细信息

将梅山猪γ干扰素基因定向插入逆转录病毒载体pLXSN(neor),构建逆转录病毒重组质粒,利用脂质体介导法将重组质粒转染逆转录病毒包装细胞系pa317,转染细胞经含G418(400μg/mL)培养基筛选一周后获得稳定产毒的pa317细胞系。从细胞培养上清中提取RNA,进行RT-PCR检测,扩增到目的片段;将上清感染猪肾细胞(PK-15),经含G418(400μg/mL、600μg/mL和800μg/mL)的DMEM筛选一周,间接免疫荧光表明表达的猪γ干扰素主要锚定于细胞膜。收取PK-15细胞上清,在牛肾细胞(MDBK)上进行干扰素抗病毒活性检测,结果显示重组病毒表达的猪γ干扰素抗水泡性口炎病毒(VSV)的活性为1200IU/106cells.48h。以表达的干扰素处理PK-15细胞后,经细胞病变抑制法测定,重组猪γ干扰素可以抵抗口蹄疫病毒(FMDV)感染。试验结果表明猪γ干扰素基因已成功插入逆转录病毒基因组并在PK-15细胞中表达,表达的重组猪γ干扰素具有较强的抗病毒生物活性。

关键词：猪γ干扰素逆转录病毒 pa317细胞 PK-15细胞表达抗病毒活性水泡性口炎病毒口蹄疫病毒

乳腺癌耐药蛋白(BCRP)高表达耐药细胞系的建立及其耐药机制的初步研究

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中国肿瘤临床 2009年第13期36卷 768-771,776页

作者：张会来孙燕宋拯刘贤明王华庆乳腺癌防治教育部重点实验室天津市肿瘤防治重点实验室天津医科大学附属肿瘤医院淋巴瘤科天津市300060

目的:建立稳定表达乳腺癌耐药蛋白(Breast cancer resistance protein,BCRP)的小鼠成纤维细胞系pa317/BCRP,初步探讨其耐药机制。方法:从乳腺癌耐药细胞系MCF-7/ADR中克隆BCRP基因。将编码序列克隆导入真核表达载体pcDNA3.1,转化感受态*... 详细信息

目的:建立稳定表达乳腺癌耐药蛋白(Breast cancer resistance protein,BCRP)的小鼠成纤维细胞系pa317/BCRP,初步探讨其耐药机制。方法:从乳腺癌耐药细胞系MCF-7/ADR中克隆BCRP基因。将编码序列克隆导入真核表达载体pcDNA3.1,转化感受态*** DH5α,获得重组质粒pcDNA3.1/BCRP,酶切并测序鉴定。用电穿孔法将质粒转染pa317细胞,同时转染pcDNA3.1/EGFP。G418筛选阳性克隆。阳性转染细胞提取细胞总RNA,RT-PCR检测BCRP的mRNA表达,Western blot检测BCRP蛋白表达。MTT法检测耐药克隆pa317/BCRP细胞对米托蒽醌(Mitoxantrone,MTZ)耐药性,罗丹明123外排实验验证转染后细胞外排罗丹明123功能。Western blot检测PI3K-AKT信号转导通路下游靶点AKT表达变化。结果:构建质粒pcDNA3.1/BCRP,转染pa317细胞,G418筛选。RT-PCR和Western blot,均检测到细胞中BCRP基因转录及蛋白表达。与空质粒转染细胞、未转染细胞对照组相比,pa317/BCRP细胞对MTZ耐药性增强,且外排罗丹明123能力增强。检测PI3K-AKT途径下游靶点AKT蛋白磷酸化水平在pa317/BCRP细胞内明显增高。结论:1、成功获得稳定表达BCRP的pa317细胞系—pa317/BCRP,经MTF和罗丹明123外排实验证实,其耐药和外排功能增强。2、检测pa317/BCRP细胞PI3K-AKT途径下游靶点AKT的表达,观察到耐药细胞的AKT表达含量明显高于转染空质粒和未转染的pa317细胞。推测BCRP可能通过影响AKT表达上调发挥其耐药作用。

关键词：乳腺癌耐药蛋白转染 pa317细胞耐药信号转导

葡萄糖转运蛋白-2逆转录病毒表达载体构建/包装及其鉴定

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第三军医大学学报 2010年第11期32卷 1207-1209页

作者：方芳凌贤龙第三军医大学新桥医院消化内科重庆400037

目的构建葡萄糖转运蛋白-2(glucose transporter-2,GLUT-2)基因逆转录病毒表达载体及其稳定产毒细胞系,为新型"人工胰岛β细胞"的构建奠定基础。方法质粒pCB7/GLUT2经EcoRⅠ、BamHⅠ双酶切,克隆至逆转录病毒载体PLXSN,构建成重组逆转录... 详细信息

目的构建葡萄糖转运蛋白-2(glucose transporter-2,GLUT-2)基因逆转录病毒表达载体及其稳定产毒细胞系,为新型"人工胰岛β细胞"的构建奠定基础。方法质粒pCB7/GLUT2经EcoRⅠ、BamHⅠ双酶切,克隆至逆转录病毒载体PLXSN,构建成重组逆转录病毒表达载体pL-GLUT2-SN,经酶切及测序鉴定;转pL-GLUT2-SN至包装细胞系pa317,G418抗性筛选,检测上清病毒滴度,挑选滴度较高的稳定产毒细胞克隆行PCR及RT-PCR鉴定。结果建立GLUT-2基因逆转录病毒表达载体pL-GLUT2-SN,经酶切及测序证实目的基因插入位点及读码框架正确;所建稳定产毒细胞克隆pa317/GLUT2,其最高病毒滴度达7.1×105CFU/ml,PCR及RT-PCR证实GLUT-2基因整合入其中并稳定表达。结论成功构建GLUT-2基因逆转录病毒表达载体及其稳定产毒细胞系,为"人工胰岛β细胞"的构建奠定了基础。

关键词：葡萄糖转运蛋白-2 逆转录病毒载体 pa317细胞包装鉴定

615小鼠MHC Ⅰ cDNA重组逆转录病毒基因治疗载体的构建和包装

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华西口腔医学杂志 2002年第6期20卷 404-407页

作者：龚浩李龙江温玉明王昌美陈俊杰彭文珍四川大学华西口腔医学院 610041 四川大学华西基础医学与法医学院分子生物学开放实验室

目的:制备615小鼠MHCⅠ目的基因(H-2Kk)载体,获得高表达MHCⅠ分子功能的单克隆细胞株。方法:将615小鼠MHCⅠ(H-2Kk)cDNA定向连接至PLXSN逆转录病毒质粒,转染*** JM109,限制性酶切分析法筛选出重组质粒PLXSN-H-2Kk,继而转染pa317细胞,经G... 详细信息

目的:制备615小鼠MHCⅠ目的基因(H-2Kk)载体,获得高表达MHCⅠ分子功能的单克隆细胞株。方法:将615小鼠MHCⅠ(H-2Kk)cDNA定向连接至PLXSN逆转录病毒质粒,转染*** JM109,限制性酶切分析法筛选出重组质粒PLXSN-H-2Kk,继而转染pa317细胞,经G418筛选获得抗性pa317单克隆细胞株,并转染NIH3T3细胞,依抗性NIH3T3细胞克隆数目,鉴定病毒液的滴度和pa317单克隆细胞株。结果:转染成功的病毒液滴度位于1.6×104～1.1×105 CFU/ml之间,pa317单克隆细胞株成片生长良好,并高表达H-2Kk产物。结论:H-2Kk cDNA重组逆转录病毒质粒的成功构建、包装和滴度鉴定为在615小鼠上进行恶性肿瘤的MHC Ⅰ转基因治疗奠定了物质基础。

关键词：基因治疗 MHCⅠ目的基因 pa317细胞基因载体重组逆转录病毒质粒肿瘤治疗

可溶性TGF-β_1Ⅱ型受体逆转录病毒表达载体的构建

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世界华人消化杂志 2005年第6期13卷 760-765页

作者：高巍周永兴张惠中聂青和中国人民解放军第四军医大学唐都医院全军感染病诊治中心陕西省西安市710038 中国人民解放军第四军医大学唐都医院中心实验室陕西省西安市710038

目的:构建表达人TGF—β1Ⅱ型受体细胞外结合区和人IgG1 Fc的融合蛋白逆转录病毒载体,为进一步肝纤维化的基因治疗奠定实验基础. 方法:以RT—PCR方法扩增目的基因TβRⅡ-IgG1 Fc,扩增产物纯化后克隆至测序载体pGEM—T—Easy,挑取阳性克... 详细信息

目的:构建表达人TGF—β1Ⅱ型受体细胞外结合区和人IgG1 Fc的融合蛋白逆转录病毒载体,为进一步肝纤维化的基因治疗奠定实验基础. 方法:以RT—PCR方法扩增目的基因TβRⅡ-IgG1 Fc,扩增产物纯化后克隆至测序载体pGEM—T—Easy,挑取阳性克隆酶切鉴定后测序;利用重组DNA 技术,将TβRⅡ-IgG1 Fc基因亚克隆至逆转录病毒载体pLXSN中,重组质粒pL(TβRⅡ-IgG1 Fc)SN在脂质体介导下转染pa317包装细胞,G418筛选,直至出现抗性克隆,扩大培养,测定病毒滴度. 结果:经测序、限制性酶切分析及PCR方法鉴定,载体插入基因序列、大小、位置均正确,并用pa317细胞进行包装、病毒滴度测定、筛选,建立具有较高滴度的感染性重组病毒产生细胞系. 结论:成功构建了重组质粒pL(TβRⅡ-IgG1 Fc)SN, 可望为肝纤维化的基因治疗提供有效途径.

关键词： TGF-β1Ⅱ型受体逆转录病毒表达载体逆转录病毒载体可溶性重组DNA技术 pa317细胞 PCR方法病毒滴度测定基因治疗肝纤维化 TβRⅡ 重组质粒人IgG1 pLXSN 脂质体介导限制性酶切构建表达融合蛋白目的基因产物纯化

过表达葡萄糖转运蛋白-2基因的INS-1细胞构建研究

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过表达葡萄糖转运蛋白-2基因的INS-1细胞构建研究

作者：方芳第三军医大学

学位级别：硕士

研究目的: 慢性胰腺炎患者由于反复的炎症刺激,致胰岛β细胞损伤逐渐加重,β细胞数目明显减少,胰岛功能显著下降;同时长期高糖毒性作用亦可引起胰腺炎的反复发作,进一步加速胰岛β细胞凋亡,从而最终发展为继发性糖尿病。因此,控制高血... 详细信息

研究目的: 慢性胰腺炎患者由于反复的炎症刺激,致胰岛β细胞损伤逐渐加重,β细胞数目明显减少,胰岛功能显著下降;同时长期高糖毒性作用亦可引起胰腺炎的反复发作,进一步加速胰岛β细胞凋亡,从而最终发展为继发性糖尿病。因此,控制高血糖是慢性胰腺炎后期治疗的一个重要环节,而目前的治疗方法尚存在诸多弊端。传统的体外胰岛素注射治疗,由于与胰岛素分泌的生理模式不符,易致血糖波动而引起相关并发症。细胞移植治疗虽为研究热点,但胰岛β细胞分离与储存技术难度较大、代价昂贵,因此寻找新的移植细胞来源是该方法亟需解决的关键难题。本课题应用逆转录病毒载体将调节胰岛素分泌的葡萄糖传感器——葡萄糖转运蛋白-2(glucose transporter-2, GLUT-2)基因转染于INS-1细胞,使INS-1细胞的胰岛素分泌更接近于生理条件,从而建成新型的“胰岛代理细胞”系,为细胞移植治疗提供新的、易供的移植细胞来源。研究背景: 1、INS-1细胞源于辐射诱导的胰岛β细胞瘤,胰岛素含量为8μg/106细胞,超过80代仍可稳定表达,其胰岛素含量与原代培养的胰岛β细胞相似,同时该细胞自身无分泌胰高血糖素与生长抑素,更有助于在研究中排除其他因素对胰岛素分泌的影响。 2、胰岛素分泌量与胰岛β细胞内的葡萄糖代谢率成正比,故控制葡萄糖流入β细胞的蛋白或酶类被认为是调节胰岛素释放的葡萄糖传感器,葡萄糖转运蛋白-2(glucose transporter 2,GLUT-2)就是β细胞内的葡萄糖传感器,其活性直接或间接受葡萄糖浓度调节,从而改变葡萄糖在胰岛β细胞内的代谢速率,进而调节胰岛素的分泌。因此,通过GLUT-2基因转染,可能实现对胰岛素分泌的调控。 3、逆转录病毒载体可携带靶基因于宿主细胞内长期、稳定表达,并且其在一定间隔期内多次重复感染可提高基因转染效率。因而,该载体是构建“胰岛代理细胞”最常用的载体系统之一。第一部分INS-1细胞GSIS检测目的:对培养的INS-1细胞进行葡萄糖刺激的胰岛素分泌(glucose-stimulated insulin secretion,GSIS)检测,从而掌握INS-1细胞的GSIS特点,为其改进奠定基础。方法:(1)INS-1细胞培养于含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中;(2)对INS-1细胞进行GSIS检测。结果:(1)INS-1细胞在含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中生长良好;(2)GSIS检测显示INS-1细胞存在胰岛素分泌,但其胰岛素分泌与生理模式存在显著差异。结论:成功培养INS-1细胞,该细胞有成熟胰岛素的分泌,但其GSIS与生理模式存在显著差异。第二部分葡萄糖转运蛋白-2基因逆转录病毒表达载体构建/包装及鉴定目的:构建GLUT-2基因逆转录病毒表达载体pL-GLUT2-SN,并于pa317细胞中进行包装,获取高滴度的稳定产毒细胞克隆pa317/GLUT-2,为GLUT-2基因稳定转染INS-1细胞奠定基础。方法:(1)质粒pcB7/GLUT-2以EcoRI、BamH1双酶切,获得GLUT-2 cDNA,与同样酶切的逆转录病毒载体pLXSN在T4DNA连接酶作用下连接,构建成重组逆转录病毒表达载体pL-GLUT2-SN,经酶切及测序鉴定;(2)Lipofectamine2000介导pL-GLUT2-SN转染包装细胞pa317,分别以PCR、RT-PCR对pa317/GLUT-2细胞中GLUT-2基因的整合与转录进行检测。结果:(1)构建的pL-GLUT2-SN重组载体经EcoRI、BamH1双酶切有1996bp的GLUT-2 cDNA及5.9kb的载体片段,GLUT-2 cDNA序列经测序证实正确;(2)所获稳定产毒细胞克隆pa317/GLUT-2,其最高病毒滴度可达7.1×10 CFU/mL;pa317/GLUT-2细胞RT-PCR扩增出158bp的目的片段;而pa317/pLXSN细胞检测结果为阴性,证实在pa317/ GLUT-2细胞中已获得GLUT-2基因的转录。结论:所获GLUT-2 cDNA序列正确,成功构建了高滴度的稳定产毒细胞克隆pa317/GLUT-2,为GLUT-2基因稳定转染INS-1细胞奠定了基础。第三部分过表达葡萄糖转运蛋白-2基因的INS-1细胞构建及GSIS检测目的:构建稳定过表达GLUT2基因的INS-1细胞,并进行GSIS检测。方法:(1)以GLUT2病毒感染INS-1细胞,通过RT-PCR及Western-blot对INS-1/GLUT-2细胞中GLUT-2基因的转录及表达情况进行检测;(2)对INS-1/GLUT-2细胞进行GSIS检测。结果:(1)所获INS-1/GLUT-2细胞经RT-PCR检测显示有更多的GLUT-2基因转录;(

关键词： INS-1细胞 GSIS GLUT-2 cDNA pa317细胞包装鉴定 GLUT-2基因过表达

乳腺癌耐药蛋白高表达耐药细胞系的建立及其耐药机制

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乳腺癌耐药蛋白高表达耐药细胞系的建立及其耐药机制

作者：孙燕天津医科大学

学位级别：硕士

目的: 建立稳定表达乳腺癌耐药蛋白(Breast resistance protein,BCRP)的小鼠成纤维细胞系pa317/BCRP,进一步研究BCRP相关的耐药功能,初步探讨其耐药机制,为逆转其耐药提供依据。方法: 首先,从表达BCRP的乳腺癌耐阿霉素细胞系MCF-7/Adr... 详细信息

目的: 建立稳定表达乳腺癌耐药蛋白(Breast resistance protein,BCRP)的小鼠成纤维细胞系pa317/BCRP,进一步研究BCRP相关的耐药功能,初步探讨其耐药机制,为逆转其耐药提供依据。方法: 首先,从表达BCRP的乳腺癌耐阿霉素细胞系MCF-7/Adr中,克隆出BCRP基因。将BCRP编码序列克隆入真核表达载体pcDNA3.1,转化感受态***5α,获得重组质粒pcDNA3.1/BCRP,酶切并测序鉴定。我们将测序正确的质粒用电穿孔法转染pa317细胞,同时转染pcDNA3.1/EGFP以观察转染率。G418筛选阳性克隆,有限稀释法获取单克隆后扩大培养。从G418筛选出的阳性转染细胞中提取细胞总RNA,RT-PCR法检测BCRP的mRNA表达,运用WESTERNBLOT法和免疫组织化学法检测BCRP蛋白在细胞膜上的表达。经验证正确的耐药克隆命名为pa317/BCRP,扩大培养并冻存。为验证其耐药功能,我们采用MTT法检测pa317/BCRP细胞对米托蒽醌(Mitoxantrone,MTZ)耐药性,罗丹明123外排实验验证转染后细胞外排罗丹明123功能,均以转染空质粒的pa317细胞及未转染细胞作为对照。此外,应用Western blot检测PIK-AKT信号转导通路下游靶点AKT表达含量的变化,以初步探讨其细胞耐药机制。结果: 成功构建质粒pcDNA3.1/BCRP,转染pa317细胞后经G418筛选,克隆化培养后获得两株抗药性细胞系。经RT-PCR法,Western blot和免疫组化法验证,均检测到细胞中BCRP基因转录及蛋白表达。遂将验证正确的细胞系命名为pa317/BCRP,扩大培养并冻存。与空质粒转染细胞、未转染细胞对照组相比,pa317/BCRP细胞对MTZ耐药性增强,且外排罗丹明123能力增强。耐药机制方面,我们经检测PIK-AKT途径下游靶点AKT蛋白磷酸化水平在pa317/BCRP细胞内明显增高,其磷酸化AKT蛋白含量为pa317/pcDNA3.1细胞的10.87倍,为未转染pa317细胞的13.18倍。结论: 1、成功获得稳定表达BCRP的pa317细胞系——pa317/BCRP,经MTT和罗丹明123外排实验证实,相对于转染空质粒和未转染的pa317细胞,其耐药和外排功能增强。该耐药细胞系的建立,为研究BCRP肿瘤多药耐药提供了研究平台。 2、通过检测pa317/BCRP细胞PIK-AKT途径下游靶点AKT的表达,我们观察到耐药细胞的AKT表达含量明显高于转染空质粒和未转染的pa317细胞。因此,我们认为BCRP可能通过影响AKT表达上调发挥其耐药作用,这为我们发现高效低毒的逆转剂提供了实验依据。

关键词： BCRP 转染 pa317细胞耐药信号转导

pSLX-CMV/TβRII-IgG1Fc载体的构建

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胃肠病学和肝病学杂志 2005年第3期14卷 230-234页

作者：高巍周永兴张惠中聂青和西安市第四军医大学唐都医院西安710038

目的构建表达人TGFβ1II型受体细胞外结合区和人IgG1Fc的融合蛋白逆转录病毒载体,为进一步肝纤维化的基因治疗奠定实验基础。方法以RTPCR方法扩增目的基因TβRIIIgG1Fc,扩增产物纯化后克隆至测序载体pGEMTEasy,挑取阳性克隆酶切鉴定后测... 详细信息

目的构建表达人TGFβ1II型受体细胞外结合区和人IgG1Fc的融合蛋白逆转录病毒载体,为进一步肝纤维化的基因治疗奠定实验基础。方法以RTPCR方法扩增目的基因TβRIIIgG1Fc,扩增产物纯化后克隆至测序载体pGEMTEasy,挑取阳性克隆酶切鉴定后测序;利用重组DNA技术,将TβRIIIgG1Fc基因亚克隆至逆转录病毒载体pSLXCMV中,重组质粒pSLXCMV/TβRIIIgG1Fc在脂质体介导下转染pa317包装细胞,G418筛选,直至出现抗性克隆,扩大培养,测定病毒滴度。结果经测序、限制性酶切分析及PCR方法鉴定,载体插入基因序列、大小、位置均正确无误,并用pa317细胞进行包装、病毒滴度测定、筛选,建立具有较高滴度的感染性重组病毒产生细胞系。结论成功构建了重组质粒pSLXCMV/TβRIIIgG1Fc,可望为肝纤维化的基因治疗提供有效途径。

关键词： Fc 逆转录病毒载体 RT-PCR方法重组DNA技术 pa317细胞病毒滴度测定基因治疗肝纤维化重组质粒人IgG1 TGF-β 脂质体介导限制性酶切 1型受体构建表达融合蛋白目的基因产物纯化酶切鉴定阳性克隆包装细胞抗性克隆