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非洲猪瘟病毒全长与截短p72蛋白的抗原性比较

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畜牧兽医学报 2022年第4期53卷 1182-1191页

作者：张文燕王亚文冯亚文滕召剑李潭清董炜刘涛宋勤叶任玉红河北农业大学动物医学院&河北省兽医生物技术创新中心保定071000 河北省兽药监察所石家庄050051 顺平县动物疫病预防与控制中心保定072250 瑞普生物药业有限公司保定071000

比较非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)全长p72与截短p72蛋白(p72s)的抗原性,为ASFV特异性抗体检测技术研究提供试验依据。应用大肠杆菌表达系统表达p72和p72s蛋白,应用Western blot和液相色谱-质谱联用(LC-MS/MS)技术鉴定... 详细信息

比较非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)全长p72与截短p72蛋白(p72s)的抗原性,为ASFV特异性抗体检测技术研究提供试验依据。应用大肠杆菌表达系统表达p72和p72s蛋白,应用Western blot和液相色谱-质谱联用(LC-MS/MS)技术鉴定表达的蛋白,分析蛋白的抗原表位;用纯化的重组全长和截短p72蛋白分别免疫小鼠,比较其免疫原性;通过ELISA和Western blot,评价重组p72和p72s蛋白与ASFV阳性血清的免疫反应性。结果:重组p72和p72s蛋白均以包涵体形式表达,相对分子质量分别约为76和42 ku,与预期大小相符;表达蛋白的酶解肽段对p72和p72s蛋白推测氨基酸序列的覆盖度分别为89.3%和88.39%,两者分别包含27和17个抗原表位;用p72与p72s蛋白免疫小鼠3次后,血清特异性抗体效价分别为1∶200~1∶25600和1∶12800~1∶409600;基于重组p72与p72s蛋白的ELISA从108份猪血清中分别检出78份(72.2%)和85份(78.7%)阳性血清,两者的检测结果具有很好的一致性(kappa=0.826,p=0.016);经Western blot检测的10份ASFV抗体阳性血清中有7份与p72蛋白反应,全部与p72s蛋白反应。截短p72蛋白比全长p72蛋白的抗原性好,更适合用于ASFV抗体检测。

关键词：非洲猪瘟病毒 p72蛋白截短p72蛋白原核表达抗原性

基于非洲猪瘟病毒p72蛋白的双抗体夹心ELISA检测方法的建立

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中国兽医科学 2022年第10期52卷 1223-1229页

作者：王彩霞于浩洋林祥梅仇松寅刘晓飞李昊轩冯春燕吴绍强中国检验检疫科学研究院动物检验与检疫研究所北京100176

为建立非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)p72蛋白的双抗体夹心ELISA(DAS-ELISA)检测方法,本研究以实验室前期制备的ASFV单克隆抗体32H5作为捕获抗体,以HRp标记的MAb 2B2-1作为检测抗体,经条件优化,建立了基于非洲猪瘟病毒p7... 详细信息

为建立非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)p72蛋白的双抗体夹心ELISA(DAS-ELISA)检测方法,本研究以实验室前期制备的ASFV单克隆抗体32H5作为捕获抗体,以HRp标记的MAb 2B2-1作为检测抗体,经条件优化,建立了基于非洲猪瘟病毒p72蛋白的双抗体夹心ELISA检测方法,并进行了敏感性、特异性和重复性试验,同时初步探索了两种抗体在试纸条方面的应用。结果显示,该夹心ELISA方法的最佳工作条件为:捕获抗体包被浓度为2μg/m L,酶标检测抗体的最适稀释倍数为1∶200;判定标准为:当检测样品D值大于等于0.252时判定为阳性;该方法检测猪伪狂犬病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪瘟病毒均呈阴性反应,具有良好的特异性;最低可检测到50 ng/m L p72重组蛋白;其批间和批内重复性变异系数均小于10%。利用两种抗体制备的蓝乳胶免疫层析试纸条也取得了较好的检测结果。这些结果表明本研究建立的ASFV p72双抗体夹心ELISA检测方法特异性强、灵敏度高、重复性好,为非洲猪瘟的快速诊断、p72蛋白的功能研究及检测提供了技术支持。

关键词：非洲猪瘟病毒 p72蛋白双抗体夹心ELISA 蓝乳胶免疫层析试纸条

非洲猪瘟病毒p72蛋白原核表达及单克隆抗体制备

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中国畜牧兽医 2023年第11期50卷 4646-4654页

作者：陈桂娥容芳冯夏宁孙荣航马绍钊郝文茜叶子安刘郁夫李作生陈瑞爱岭南现代农业科学与技术广东省实验室肇庆分中心肇庆526238 华南农业大学兽医学院广州510642 肇庆学院生命科学学院肇庆526060 华农(肇庆)生物产业技术研究院有限公司肇庆526238 肇庆大华农生物药品有限公司肇庆526238

【目的】表达与纯化非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)p72蛋白,并制备其单克隆抗体。【方法】构建原核表达载体pET-28b-p72,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞并进行诱导表达和蛋白纯化;用纯化后的p72蛋白免疫BALB/c小鼠,将... 详细信息

【目的】表达与纯化非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)p72蛋白,并制备其单克隆抗体。【方法】构建原核表达载体pET-28b-p72,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞并进行诱导表达和蛋白纯化;用纯化后的p72蛋白免疫BALB/c小鼠,将免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞进行细胞融合并制备单克隆抗体,通过间接ELISA法和亚克隆筛选出分泌抗体的阳性杂交瘤细胞;通过小鼠抗体类型检测试剂盒检测抗体类型;通过体内诱生法制备抗ASFV p72蛋白的单克隆抗体腹水,使用饱和硫酸铵沉淀法进行抗体纯化,通过间接ELISA法、间接免疫荧光试验(IFA)和Western blotting检测单克隆抗体效价和特异性。【结果】ASFV p72重组蛋白在大肠杆菌中以包涵体形式表达,将纯化的p72蛋白制备单克隆抗体,获得4株分泌IgG1抗体的单克隆细胞株,分别命名为6F8、7C3、8H7和9G2。间接ELISA结果显示,6F8与8H7细胞株分泌的抗体效价均为1∶6400,7C3与9G2细胞株的抗体效价均为1∶12800,且4株细胞株分泌的抗体与p72蛋白反应结果均呈阳性,与猪伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,pRV)、猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)、猪细小病毒(porcine parvovirus,ppV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,pRRSV)和猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,pEDV)反应均呈阴性。4株单克隆细胞株分泌的抗体均能与p72真核蛋白发生特异性反应。【结论】本研究成功制备了4株能稳定分泌与ASFV p72蛋白特异性结合的单克隆抗体的细胞株,为进一步探究ASFV p72蛋白的功能以及非洲猪瘟的防控和诊断建立了基础。

关键词：非洲猪瘟病毒 p72蛋白原核表达单克隆抗体

非洲猪瘟病毒p72蛋白阻断ELISA检测方法的建立

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畜牧兽医学报 2022年第5期53卷 1509-1516页

作者：张路捷高雁怩夏婷婷白娟姜平南京农业大学农业农村部动物细菌学重点实验室南京210095 南京农业大学动物传染病实验室南京210095

本研究旨在建立一种非洲猪瘟病毒(ASFV)p72蛋白阻断ELISA抗体检测方法。以纯化的重组p72蛋白作为包被抗原,HRp标记的6E5抗体作为阻断抗体,通过对反应条件进行优化,建立了基于ASFV p72蛋白的阻断ELISA方法。用建立的阻断ELISA方法检测11... 详细信息

本研究旨在建立一种非洲猪瘟病毒(ASFV)p72蛋白阻断ELISA抗体检测方法。以纯化的重组p72蛋白作为包被抗原,HRp标记的6E5抗体作为阻断抗体,通过对反应条件进行优化,建立了基于ASFV p72蛋白的阻断ELISA方法。用建立的阻断ELISA方法检测119份临床阴性血清,计算血清阻断率确定临界值,确定了该方法的判定标准:当阻断率pI≥50%时判定为ASFV抗体阳性;pI≤40%时判定为ASFV抗体阴性;当阻断率介于两者之间时,判定为可疑。该方法与猪伪狂犬病病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒、猪圆环病毒2型、A型塞内卡病毒、猪口蹄疫病毒、猪大肠杆菌、猪多杀性巴氏杆菌、副猪格拉瑟菌和猪胸膜肺炎放线杆菌的抗体阳性血清无交叉反应,批间、批内试验的变异系数均小于15%。用该方法与商品化ASFV抗体检测试剂盒同时检测447份猪临床血清样品,两种方法的相对敏感性和相对特异性分别为95.3%和94.5%,符合率为94.9%。本研究建立的阻断ELISA方法具有较高的敏感性和良好的特异性,可用于ASFV感染诊断和流行病学调查。

关键词：非洲猪瘟病毒 p72蛋白单克隆抗体阻断ELISA

非洲猪瘟病毒p72蛋白单克隆抗体的制备及阻断ELISA方法的建立

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中国预防兽医学报 2023年第5期45卷 488-493,547页

作者：石正发马源袁洪王由森朱晓霞车亮李甲羊倩倩孙晓林甘肃农业大学动物医学院甘肃兰州730070 中牧实业股份有限公司兰州生物药厂甘肃兰州730100

为建立检测非洲猪瘟病毒(ASFV)血清抗体的阻断ELISA方法,本研究对ASFV p72蛋白进行原核表达并纯化,将其免疫BALB/c小鼠并通过间接ELISA方法筛选到1株稳定分泌p72蛋白的杂交瘤细胞株3F8。以纯化的p72蛋白作为包被抗原,辣根过氧化物酶(HRp... 详细信息

为建立检测非洲猪瘟病毒(ASFV)血清抗体的阻断ELISA方法,本研究对ASFV p72蛋白进行原核表达并纯化,将其免疫BALB/c小鼠并通过间接ELISA方法筛选到1株稳定分泌p72蛋白的杂交瘤细胞株3F8。以纯化的p72蛋白作为包被抗原,辣根过氧化物酶(HRp)标记的单克隆抗体(MAb)作为检测抗体,采用方正滴定法对反应条件优化后初步建立了检测ASFV的阻断ELISA方法。利用该方法检测133份ASFV阳性血清和73份ASFV阴性血清,通过ROC曲线分析确定临界值。结果显示,该方法的临界值为25.62%时,ROC的曲线面积最大,为0.9989,诊断敏感性和特异性分别为98.63%和98.5%。利用该方法检测ASFV、O型口蹄疫病毒(FMDV)、A型FMDV、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪流行性腹泻病毒、猪伪狂犬病毒、猪瘟病毒阳性血清,结果显示,除ASFV阳性血清外,其他阳性血清均为阴性,表明特异性强;利用该方法和商品化试剂盒对2倍倍比稀释(1∶4~1∶2048)的两种ASFV灭活阳性血清(p1、p2)检测,结果显示该方法检测结果与商品化试剂盒基本一致,敏感性高。利用该方法对3份灭活的ASFV阳性血清进行批内和批间的重复性检测,结果显示批内和批间重复性试验的变异系数均小于10%,重复性好。利用该检测方法和商品化试剂盒同时检测216份临床血清样品,两种方法检测结果符合率为99.07%。本研究所建立的阻断ELISA方法特异性强,敏感性高,重复性好,可用于ASFV抗体的检测,为非洲猪瘟流行病学调查及弱毒株疫苗抗体评价提供技术支撑。

关键词：非洲猪瘟病毒 p72蛋白单克隆抗体阻断ELISA

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非洲猪瘟病毒p72蛋白可溶性表达及鉴定

动物医学进展 2023年第8期44卷 28-33页

作者：黄霞康喜龙韩顺子孟闯潘志明焦新安扬州大学江苏省人兽共患病学重点实验室/扬州大学江苏高校动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心/扬州大学农业农村部农产品质量安全生物性危害因子(动物源)控制重点实验室/扬州大学农业与农产品安全国际合作联合实验室江苏扬州225009

为获得可溶性的非洲猪瘟病毒(ASFV)p72蛋白,将重组质粒pColdⅠ-p72分别与5种分子伴侣质粒进行融合表达,SDS-pAGE鉴定表达产物;以重组蛋白His-p72免疫小鼠制备多克隆抗体,通过Western blot和间接免疫荧光方法鉴定多克隆抗体与真核表达蛋... 详细信息

为获得可溶性的非洲猪瘟病毒(ASFV)p72蛋白,将重组质粒pColdⅠ-p72分别与5种分子伴侣质粒进行融合表达,SDS-pAGE鉴定表达产物;以重组蛋白His-p72免疫小鼠制备多克隆抗体,通过Western blot和间接免疫荧光方法鉴定多克隆抗体与真核表达蛋白的免疫反应性。结果显示,重组蛋白His-p72与伴侣蛋白pG-Tf2或pTf16共表达后,实现了可溶性表达。以可溶性His-p72蛋白免疫小鼠后,获得His-p72多克隆抗体,抗体效价达到1∶512000;Western blot和间接免疫荧光的试验结果显示多抗血清可特异性识别真核表达的p72蛋白。说明利用分子伴侣融合表达的ASFV p72可溶性蛋白具有较好的免疫反应性,为抗ASFV药物的研发提供了候选蛋白。

关键词：非洲猪瘟病毒 p72蛋白分子伴侣可溶性表达多克隆抗体

非洲猪瘟病毒p72蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

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中国动物传染病学报 2023年

作者：王安铖李俊波胡一帆陈玲超孟鑫童武孔宁单同领于海童光志徐家萍郑浩中国农业科学院上海兽医研究所安徽农业大学生命科学学院东北林业大学野生动物学院

非洲猪瘟B646L基因编码的p72蛋白是病毒的重要抗原，常用来检测非洲猪瘟病毒。本研究将非洲猪瘟B464L的3端部分截短基因序列克隆至pColdⅠ载体中，构建了重组质粒pColdⅠ-p72，将重组质粒转化至大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中诱导表... 详细信息

非洲猪瘟B646L基因编码的p72蛋白是病毒的重要抗原，常用来检测非洲猪瘟病毒。本研究将非洲猪瘟B464L的3端部分截短基因序列克隆至pColdⅠ载体中，构建了重组质粒pColdⅠ-p72，将重组质粒转化至大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中诱导表达，并将纯化p72蛋白免疫小鼠制备单克隆抗体。融合杂交瘤细胞经ELISA筛选和有限稀释法亚克隆，获得了一株杂交瘤细胞R3E9。经Western blot和IFA实验鉴定，R3E9单抗识别变性的p72截断蛋白，也识别杆状病毒表达的p72蛋白三聚体。本文制备了一株非洲猪瘟病毒的特异性单克隆抗体R3E9，为非洲猪瘟病毒血清学检测方法的建立打下良好基础。

关键词：非洲猪瘟病毒原核表达 p72蛋白单克隆抗体

表达非洲猪瘟病毒p72蛋白的重组杆状病毒构建与鉴定

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中国动物传染病学报 2023年

作者：王安铖李俊波胡一帆孟鑫陈玲超童武单同领于海孔宁刘雪兰童光志徐家萍郑浩东北林业大学野生动物学院安徽农业大学生命科学学院中国农业科学院上海兽医研究所安徽农业大学动物医学院

为了制备高活性的非洲猪瘟病毒p72蛋白，本文优化合成了非洲猪瘟B646L和B602L全基因序列，并分别克隆进pFastBac Dual载体中，构建了重组质粒pBac-B602L-B646L。将pBac-B602L-B646L转化感受态细胞DH10Bac中，经过蓝白斑纯化和pCR鉴定，... 详细信息

为了制备高活性的非洲猪瘟病毒p72蛋白，本文优化合成了非洲猪瘟B646L和B602L全基因序列，并分别克隆进pFastBac Dual载体中，构建了重组质粒pBac-B602L-B646L。将pBac-B602L-B646L转化感受态细胞DH10Bac中，经过蓝白斑纯化和pCR鉴定，获得重组杆状质粒rBacmid-p72。将rBacmid-p72转染到sf9昆虫细胞中，获得重组杆状病毒。通过IFA和western bolting分析，证实rBac-p72感染sf9表达p72和pB02L。以rBac-p72感染悬浮培养的sf9细胞，并通过Ni柱亲和层析获得了纯化的p72蛋白。以p72蛋白包被酶标板，通过间接ELISA检测，显示纯化的p72蛋白能与ASFV阳性血清中的抗体良好结合。上述研究结果表明，本文通过杆状表达的p72蛋白具有较高的活性，为下一步开展p72蛋白功能及应用研究打下良好的基础。

关键词：非洲猪瘟病毒杆状病毒表达 p72蛋白抗原性

非洲猪瘟病毒p72蛋白原核表达及多克隆抗体的制备

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中国动物传染病学报 2022年第6期30卷 141-146页

作者：曹云雷高飞李国新姜一峰郑浩童武黄剑童光志中国农业科学院上海兽医研究所上海200241 扬州大学江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心扬州225009

本研究旨在用原核生物表达系统来表达非洲猪瘟病毒(ASFV)的B646L基因。获得其编码的p72重组蛋白,并针对纯化的p72重组蛋白制备多克隆抗体。将ASFV B646L全长基因连入pcold-Ⅰ表达载体,构建原核重组表达质粒,经1 mmol/L IpTG于16℃诱导1... 详细信息

本研究旨在用原核生物表达系统来表达非洲猪瘟病毒(ASFV)的B646L基因。获得其编码的p72重组蛋白,并针对纯化的p72重组蛋白制备多克隆抗体。将ASFV B646L全长基因连入pcold-Ⅰ表达载体,构建原核重组表达质粒,经1 mmol/L IpTG于16℃诱导16 h后,利用SDS-pAGE对重组蛋白进行表达鉴定和反应原性分析。然后用纯化的p72重组蛋白为免疫原制备鼠源抗p72多克隆抗体,经过4次免疫后获得p72蛋白的多克隆抗体,随后采取血清来检测多克隆抗体。结果显示,利用p72蛋白制备的多克隆抗体具有较高的抗体效价和特异性,为进一步对ASFV B646L基因建立快速、特异的血清学诊断技术奠定基础。

关键词：非洲猪瘟病毒 B646L基因 p72蛋白多克隆抗体