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胞质M-CsF激活人乳腺癌MCF-7细胞pI3k/Akt/mTOR/p70s6k信号通路

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胞质M-CSF激活人乳腺癌MCF-7细胞PI3K/Akt/mTOR/P70S6K信号通路

作者：刘鑫南华大学

学位级别：硕士

目的:探讨胞质M-CsF对pI3k/Akt/mTOR/p70s6k信号通路的影响。方法:常规培养转染M-CsF的MCF-7细胞(命名为MCF-7-M细胞)、转染空载体MCF-7细胞(命名为MCF-7-C细胞)和MCF-7细胞,用Western blot方法检测其三种细胞pI3k,Akt,mTOR和p70s6k蛋白质及磷酸化的表达情况;同时用RT-pCR检测其三种细胞pI3k,Akt,mTOR和p70s6k基因表达水平;pI3k抑制剂LY294002预孵育上述三种细胞,观察LY294002对三种细胞AkT磷酸化的影响。结果: RT-pCR实验结果显示:MCF-7-M细胞的pI3k,Akt,mTOR和p70s6k基因的表达显著高于MCF-7-C细胞和MCF-7细胞(pstern blot实验结果显示:MCF-7-M细胞的pI3k,Akt,mTOR和p70s6k蛋白质的表达及其磷酸化显著高于MCF-7-C细胞和MCF-7细胞(ppI3k抑制剂LYZ94002预孵育细胞,可明显抑制MCF-7-M细胞明显抑制Akt蛋白的磷酸化。结论:胞质M-CsF可诱导MCF-7细胞pI3k,Akt,mTOR,p70s6k的mRNA与蛋白质的表达及其磷酸化。胞质M-CsF可激活pI3k/ Akt /mTOR/p70s6k信号通路。

关键词： M-CsF pI3k Akt mTOR p70s6k

肉碱通过AkT/p70s6k/FOXO3a信号通路改善小鼠癌症恶液质肌肉减少的体内研究

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肉碱通过AKT/p70S6K/FOXO3a信号通路改善小鼠癌症恶液质肌肉减少...

作者：朱明星中国人民解放军陆军军医大学

学位级别：硕士

研究背景:随着人口的增长和老龄化,以及经济的发展,与城市化环境的改变,癌症的发病率和死亡率不断的上升,根据GLOBOCAN的估计,2012年全球约有1410万新的癌症病例和820万人癌症死亡病例。多年来,癌症已成为发展中国家越来越重的负担,目... 详细信息

研究背景:随着人口的增长和老龄化,以及经济的发展,与城市化环境的改变,癌症的发病率和死亡率不断的上升,根据GLOBOCAN的估计,2012年全球约有1410万新的癌症病例和820万人癌症死亡病例。多年来,癌症已成为发展中国家越来越重的负担,目前这些国家癌症患者人数和癌症死亡人数占全球癌症病例的57%和65%。癌症也已成为我国人口死亡的主要原因,是我国公共卫生面临的一大棘手的问题。通过我国国家癌症中心登记处(National Central Cancer Registry of China)提供的数据显示,2015年中国约新增392.9万癌症病例和238.8万癌症死亡病例。其中,结直肠癌新增约38.8万癌症病例和18.7万死亡病例。2017年美国将新增135,430例结直肠癌患者,结直肠癌是美国第四大常见癌症,是西方国家癌症死亡的第二大原因。终末期癌症患者往往表现为极度消瘦、厌食、乏力、体能差甚至卧床,即出现恶液质症状。据报道,80%左右的胃癌或胰腺癌,50%左右的结肠癌、肺癌或前列腺癌,以及约40%的乳腺癌患者随癌症进展而出现恶液质。癌症恶液质的特点主要是脂肪组织和骨骼肌的损失,从而导致体重显著下降。进而导致癌症治疗耐受性降低,降低患者的生活质量和寿命。有数据显示30%以上的癌症患者是因恶液质死亡的。在癌症恶液质中,蛋白质的合成和降解之间存在着复杂的相互作用。癌症恶液质的一个重要特征是骨骼肌质量的逐渐减少,同时伴随着身体脂肪的损失。肌肉消耗极大地降低了生活质量,这可能会是导致致命后果的原因。癌症引起宿主肌肉质量损失的机制目前被认为是多因素的。各种激素、细胞因子和癌症源性因子已被证明通过几个主要的细胞内信号转导系统,在正常和疾病状态下影响肌肉蛋白平衡。AkT/p70s6k分子通路的激活与肌肉的生长密切相关,另一方面,肌肉萎缩的原因可能是FOXO(或Forkhead)家族、NF-κB和smad转录因子的激活,NF-κB可被TNF-α,TWEAk和IL-1等激活,这些分子可促进蛋白质降解。FOXO3a诱导肌肉萎缩相关的基因表达,特别是肌肉特异性泛素化连接酶MAFbx/Atrogin-1和MuRF-1,从而促进肌原纤维分解和自噬基因的激活。Myostatin和Activin A/B是TGF-β家族的成员。研究结果表明,Myostatin可抑制AkT,进而抑制其下游p70s6k通路,阻止蛋白质合成。在人以及多种动物中敲出肌肉生长抑制素,会导致骨骼肌肥大,而在成年小鼠中过表达肌肉生长抑制素则可导致全身肌肉萎缩。另外,在骨骼肌中激活TNF-α/TAk-1信号通路,可发现激活素A上调。这些TGF-β分子结合到ActRIIB受体上,起到信号级联放大,导致MAFbx和MuRF-1表达增加,进而促进肌纤维蛋白的降解。癌症恶液质是一种多因素的综合征,越来越多的证据表明,临床治疗恶液质的手段仍不能满足需要,营养支持虽不能完全逆转恶液质,但在疾病的预防和治疗中发挥关键作用。最近,研究者关注左旋肉碱(L-carnitine,LC)。左旋肉碱是调节长链脂肪酸β氧化的关键物,研究发现左旋肉碱在癌症恶液质患者的血清中明显减少。在癌症恶液质患者中,低水平的血清左旋肉碱被认为是恶液质进展的重要原因。补充左旋肉碱已被证明可以改善患者疲劳和生活的质量。例如,左旋肉碱已被证明可改善包括老年痴呆、神经退行性病变、艾滋病、肌病、心肌病和肾衰竭等几种疾病患者的病情。更好的理解恶病质的潜在机制,加上有效的治疗方案,将改善癌症患者生命质量。左旋肉碱改善癌症恶液质的机制尚需进一步阐明。在此,我们将对左旋肉碱对癌症恶液质的改善作用及其可能的机制进行研究和探讨。本研究结果显示,给荷瘤小鼠灌胃10 mg/kg的左卡尼汀被证明对癌症恶液质有良好的治疗效果,并可显著减少骨骼肌的损耗和小鼠血清血脂(包括胆固醇和甘油三酯)的浓度。实验方法:1.构建CT26荷瘤裸鼠模型:在本研究中,我们用结肠腺癌细胞(CT26)接种于裸鼠的右侧腹股沟处,每天测量食物摄入量、小鼠体重和癌症大小。旨在评估左旋肉碱对结肠腺癌癌症小鼠模型中小鼠癌症恶液质的改善作用。2.生化分析,血清总胆固醇、甘油三酯以及血糖等生化参数采用全自动生化分析仪进行分析。3.酶联免疫吸附测定法(ELIsA),ELIsA法检测血清IL-1、IL-6和TNF-α等细胞因子的浓度。4.苏木精-伊红染色(He)法,He染色观察腓肠肌肌纤维粗细和肿瘤组织的病理。5.蛋白免疫印迹法(Western Blotting,WB),肉碱干预后,Western Blotting检测肉碱对肌肉组织中Myostatin、AkT、p-AkT、p70s6k、p-p70s6k、FOXO3a、p-FOXO3a、MAFbx、MuRF1等相关蛋白表达的影响。研究结果:1.接种CT26

关键词：癌症恶液质左旋肉碱 CT26 AkT p70s6k FOXO3a

Akt/mTOR/p70s6k通路在HsC-T6的活化增殖中的作用及栀子苷抗肝纤维化作用研究

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Akt/mTOR/p70S6K通路在HSC-T6的活化增殖中的作用及栀子苷抗肝纤...

作者：占书箱安徽医科大学

学位级别：硕士

肝纤维化(fibrosis of liver)实质是一种由多种原因病毒、代谢、药物、酒精、血吸虫等引起的慢性肝损伤的伤口愈合反应，它的主要表现是肝内细胞外基质(extracelluar matrix，ECM)在狄氏间隙(space of Disse)的肝窦内皮细胞层大量过度... 详细信息

肝纤维化(fibrosis of liver)实质是一种由多种原因病毒、代谢、药物、酒精、血吸虫等引起的慢性肝损伤的伤口愈合反应，它的主要表现是肝内细胞外基质(extracelluar matrix，ECM)在狄氏间隙(space of Disse)的肝窦内皮细胞层大量过度沉积及所导致的肝脏功能的损伤，是慢性肝病发展到肝硬化必经阶段。大量实验研究已经证实，活化的肝星状细胞(hepatic stellate cell，HsC)是过度沉积的ECM的主要来源，而且HsC的活化是肝纤维化发生发展过程中的核心环节，通过抑制HsC活化增殖可以减缓肝纤维化的发生发展。栀子是药食两用的传统中药，又称为黄栀子、山栀子，药用栀子是茜草科植物栀子的成熟果实，具有利胆、镇痛、抗炎等作用。栀子苷(geniposide)，属于环烯醚萜类化合物，是栀子药效作用的主要有效成分，有研究表明，栀子苷具有利胆、保肝、抗炎等方面作用。本实验室前期研究结果表明，栀子苷具有肝脏保护作用，进一步研究发现，栀子苷能够抑制pDGF介导的HsC-T6细胞增殖活化，其具体作用机制可能与阻断了Akt/mTOR/p70s6k通路有关。核糖体70s小亚基s6蛋白激酶(p70s6k)是哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mamm--alian target of Rapamycin，mTOR)的下游底物，它是一种核糖体蛋白激酶，可以促进细胞的生长和增殖，研究表明，在癌症等疾病中，p70s6k活化水平明显升高，抑制其表达可明显抑制肿瘤细胞的增殖。鉴于p70s6k在细胞增殖中的重要作用，我们设想阻断p70s6k的活性可以抑制HsC的活化增殖。为验证这一设想，采用Western blot方法检测了磷酸化p70s6k在肝纤维化大鼠肝组织以及活化的HsC-T6中的表达水平，结果发现，在纤维化组织和活化的HsC-T6中，磷酸化p70s6k的表达水平都明显升高，提示，p70s6k有可能参与调节HsC的活化增殖，影响肝纤维化的发生发展。为进一步阐明p70s6k与HsC活化增殖之间的联系，本课题进行了以下研究。1.磷酸化p70s6k在肝纤维化大鼠肝组织和活化的肝星状细胞系HsC-T6中的蛋白表达sD大鼠灌胃给予CCl4，建立肝纤维化模型，Western blot检测磷酸化p70s6k、肝纤维化大鼠肝组织中的蛋白表达;pDGF(10ng/ml)诱导HsC-T6细胞活化，Western blot检测磷酸化p70s6k在活化的HsC-T6细胞中的蛋白表达。实验结果发现，磷酸化p70s6k在纤维化的肝组织和活化的HsC-T6细胞中表达均升高了。2.抑制p70s6k的活性对大鼠肝星状细胞系HsC-T6活化增殖的影响利用雷帕霉素(2，20，50ng/ml)预处理HsC-T6细胞2h后，再加pDGF(10ng/ml)作用24h或48h，运用MTT和流式细胞仪检测HsC-T6细胞增殖情况和细胞周期分布，Western blot和RT-pCR检测HsC-T6细胞磷酸化p70s6k、α-sMA和Collagen I的表达情况;利用LipofectamineTM2000将特异性p70s6k-siRNA转染到HsC-T6内，下调p70s6k的表达，降低其活性，运用MTT和流式细胞仪检测HsC-T6细胞增殖情况和细胞周期分布，Western blot和RT-pCR检测HsC-T6细胞磷酸化p70s6k、α-sMA和Collagen I的表达情况。实验结果发现，雷帕霉素和p70s6k-siRNA作用均降低了p70s6k的活性，抑制了HsC-T6的活化和增殖。3.栀子苷单体对pDGF诱导的HsC-T6活化增殖的影响不同浓度的栀子苷(20，50，100，200，400μg/ml)作用于HsC-T6细胞，MTT检测细胞活力，判断栀子苷的细胞毒性;用低、中、高浓度的栀子苷(20，50，100μg/ml)预处理HsC-T6细胞2h后，再加pDGF(10ng/ml)作用24h或48h，运用MTT检测细胞活力， Western blot检测HsC-T6细胞活化增殖MApk通路蛋白ERk、p38活化水平以及Akt/mTOR/p70s6k通路蛋白活化水平的表达。实验结果发现，栀子苷抑制了HsC-T6的活化增殖，同时降低了Akt/mTOR/p70s6k通路蛋白活化水平，对ERk、p38活化水平无显著影响。

关键词：栀子苷肝星状细胞 p70s6k siRNA 雷帕霉素肝纤维化

电针调节下丘脑mTOR/p70s6k信号通路的肥胖大鼠减重作用研究

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电针调节下丘脑mTOR/p70S6K信号通路的肥胖大鼠减重作用研究

作者：游翕成都中医药大学

学位级别：硕士

目的:本研究从饮食诱导的肥胖大鼠下丘脑入手,以影响肥胖发病的关键环节mi R-103介导的m TOR/p70s6k信号通路为切入点,探讨电针治疗肥胖的机制,以期为电针减肥的临床推广应用提供更严谨的科学依据,并为电针减重效应的机制研究提供新思... 详细信息

目的:本研究从饮食诱导的肥胖大鼠下丘脑入手,以影响肥胖发病的关键环节mi R-103介导的m TOR/p70s6k信号通路为切入点,探讨电针治疗肥胖的机制,以期为电针减肥的临床推广应用提供更严谨的科学依据,并为电针减重效应的机制研究提供新思路。方法:将50只spF级雄性Wistar大鼠随机分为普通组和高脂组。普通组以普通饲料喂养,高脂组以高脂饲料喂养。造模10周后,将普通组大鼠作为对照组;将造模成功的大鼠随机分为模型组、电针组和假电针组。对照组和模型组大鼠束缚固定不针刺;电针组大鼠针刺天枢、中脘、三阴交和足三里,并连接电针仪,其参数设置为疏密波2Hz/15Hz,强度0.5～1 m A。假电针组大鼠浅刺腧穴旁开5 mm处,不连接电针仪。干预时间为每日1次,每次30分钟,5天1疗程,每个疗程之间间隔2天,共干预4个疗程。干预期间,每日计算摄食量,每周记录1次体质量。干预结束后,观察大鼠体型、活动状态、毛发、摄食量等一般情况以及体质量、附睾脂肪重量等形态学指标;采用HE染色观察附睾脂肪细胞形态及大小;采用RT-pCR技术检测大鼠下丘脑mi R-103 m RNA表达;采用蛋白质印迹法检测大鼠下丘脑中m TOR、p70s6k、p-m TOR、p-p70s6k表达。结果:1.电针对肥胖的减重效应(1)各组大鼠一般情况干预4周后,模型组较普通组大鼠体型肥胖,出现脱毛、毛发油腻发黄,精神萎靡,大便色黄、时干时稀等表现。电针组大鼠与模型组大鼠相比,在体型、毛发、精神状态以及大便等方面有所改善。模型组与假电针组大鼠表现相似。干预期间各组大鼠摄食量相比发现:各组大鼠摄食量在第1周明显降低;后3周对照组、模型组、假电针组摄食量逐渐增加,电针组摄食量趋于平稳。(2)各组大鼠体质量及附睾脂肪重量比较干预前,模型组、电针组、假电针组大鼠体质量组间无明显差异(p>0.05),提示基线齐。干预4周后,与对照组相比,模型组大鼠体质量、附睾脂肪重量明显升高(ppppp>0.05,p>0.05)。与假电针组相比,电针组大鼠体质量、附睾脂肪重量明显下降(ppppppp>0.05,p>0.05)。与假电针组相比,电针组脂肪细胞直径、面积明显减小(ppp70s6k信号通路活性(1)各组大鼠下丘脑mi R-103表达水平比较干预4周后,与对照组相比,模型组mi R-103表达水平明显降低(ppp>0.05)。与假电针组相比,电针组mi R-103表达水平明显升高(pp70s6k、p-m TOR、p-p70s6k表达水平的比较干预4周后,与对照组相比,模型组m TOR表达水平明显升高(pp>0.05);假电针组与模型组无明显差异(p>0.05)。与假电针组相比,电针组m TOR表达水平无明显差异(p>0.05)。干预4周后,与对照组相比,模型组p70s6k表达水平明显升高(pp70s6k表达水平明显下降(pp>0.05)。电针组与假电针组p70s6k表达水平无明显差异(p>0.05)。干预4周后,与对照组相比,模型组p-m TOR表达水平明显升高(pp-m TOR表达水平明显下降(pp>0.05)。与假电针组相比,电针组p-m TOR表达水平下降(pp-p70s6k表达水平明显增加(pp-p70s6k表达水平明显下降(p<0.01);假电针

关键词：电针肥胖下丘脑 mTOR p70s6k miR-103

雷帕霉素对p70s6k-siRNA转染的EC9706细胞增殖的影响

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郑州大学学报（医学版） 2013年第6期48卷 717-720页

作者：鲁照明杨帅周媛媛贝维娟侯桂琴郑州大学药学院郑州450001

目的:观察雷帕霉素对p70s6k-siRNA转染的人食管鳞状细胞癌EC9706细胞增殖的影响。方法:用p70s6k-siRNA转染EC9706细胞,分别作用24、48 h后,采用RT-pCR和Western blot检测p70s6k mRNA及蛋白的表达情况;收集转染p70s6k-siRNA 24 h和未转染的EC9706细胞,加入0、25、50、100、150、250、500和1 500 nmol/L的雷帕霉素处理48 h,采用MTT法检测细胞存活率。结果:p70s6k-siRNA转染后,EC9706细胞中p70s6k mRNA及蛋白的表达均明显降低(mRNA:F=57.825;蛋白:F p70s6k=268.897,F p-p70s6k=35.584,p均706细胞存活率均降低;与未转染组相比,转染组细胞存活率更低(F剂量=664.919,F组间=1 958.000,p均p70s6k-siRNA能增强雷帕霉素对EC9706细胞增殖的抑制作用。

关键词： p70s6k siRNA 食管鳞状细胞癌 EC9706 雷帕霉素

4EBp1和p70s6k在不同宫颈病变组织中的表达及意义

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4EBP1和P70S6K在不同宫颈病变组织中的表达及意义

作者：朱旭明郑州大学

学位级别：硕士

宫颈癌是导致女性死亡的三大原因之一,随着巴氏涂片筛查项目的应用及在全世界范围内的普及,宫颈癌的死亡率及发病率已经呈下降趋势,然而,全世界每年仍大约有27.4万妇女死于宫颈癌。在欧盟,每年女性宫颈癌的粗发病率为13.2/100000,宫颈... 详细信息

宫颈癌是导致女性死亡的三大原因之一,随着巴氏涂片筛查项目的应用及在全世界范围内的普及,宫颈癌的死亡率及发病率已经呈下降趋势,然而,全世界每年仍大约有27.4万妇女死于宫颈癌。在欧盟,每年女性宫颈癌的粗发病率为13.2/100000,宫颈癌的粗死亡率为5.9/100000。显然,我们需要研究新的分子靶向治疗药物及其作用机制,分子靶向药物的应用可能为宫颈癌患者提供一个有前景的治疗方法。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是一种能够调节细胞生长和细胞周期进程的丝／苏氨酸蛋白激酶,广泛存在于酵母及所有的真核生物中,其调节作用是通过与营养素、生长因子等信号结合实现的。许多研究者发现该通路在细胞生长、分化、迁徙和生存过程中起着至关重要的作用,参与了人类癌症的发生发展过程。活化的mTOR与其它蛋白结合形成复合物,导致下游真核细胞翻译起始因子4E结合蛋白(4EBp1)和核糖体40s小亚基s6蛋白激酶(p70s6k)的磷酸化。在肿瘤细胞中,4EBp1和p70s6k的磷酸化促进蛋白质翻译起始,它们已成为目前肿瘤生物治疗的新靶点和新途径的热点。因此本实验试图通过研究正常宫颈、宫颈上皮内瘤变及宫颈癌组织中4EBp1和p70s6k在蛋白水平及基因水平的表达情况,探讨两者在宫颈癌形成过程中的作用,也为这两种蛋白或两种蛋白所在的信号传导通路的特异性靶向治疗提供一定的理论依据。目的通过研究不同病变宫颈组织中4EBp1和p70s6k在蛋白水平及基因水平的表达,从而探讨两者在宫颈癌形成过程中的意义,也为这两种蛋白或两种蛋白所在的信号传导通路的特异性靶向治疗提供一定的理论依据。材料和方法1.实验材料：收集我院2011年9月～2012年3月手术切除或活检宫颈组织标本80例,其中正常宫颈(正常宫颈组)20例,年龄32-58岁,中位年龄46岁,宫颈上皮内瘤变(CIN组)20例(CIN Ⅰ～Ⅱ级13例,CIN Ⅲ级7例),年龄28-60岁,中位年龄45.6岁,浸润性宫颈癌(宫颈癌组)40例(宫颈鳞癌35例,宫颈腺癌5例),年龄35-70岁,平均(47.2±9.18)岁。所有标本常规取材,离体后立即分为两份,一份在离体的30分钟内储存在-80℃冰箱里,另一部分离体后立即置于10%福尔马林溶液中固定,常规石蜡包埋。所有标本取样前患者未经放化疗及免疫治疗,术后经病理专家证实,诊断明确。2.研究方法：分别采用免疫组化sp法及pT-pCR(逆转录聚合酶链反应)法,严格按照试剂盒用法说明,检测3组宫颈组织中4EBp1和p70s6k在蛋白水平及基因水平的表达。3.统计学方法：采用spss17.0统计学软件进行数据分析。定性资料多组间比较采用独立多组二分类χ2检验;定量资料多组间的比较采用单因素方差分析;变量间的相关性采用分类变量的关联分析;以双侧α=0.05为检验水准,组间比较以α'=0.0167为检验水准。结果1.4EBp1蛋白少量表达于细胞核,主要定位于细胞质。4EBp1在正常宫颈、CIN及宫颈癌组织中均有表达,随着宫颈病变程度的加重,细胞染色程度逐渐加深,阳性染色细胞比例逐渐增加,三组样本阳性表达率分别为10%、50%、87.5%,存在显著差异(pp70s6k蛋白主要定位于细胞质。p70s6k在正常宫颈、CIN及宫颈癌组织中均有表达,随着宫颈病变程度的加重,细胞染色程度逐渐加深,阳性染色细胞比例逐渐增加,三组样本阳性表达率分别为10%、45%、80%,存在显著差异(pp1与p70s6k蛋白的表达呈正相关(r=0.354,pp1和p70s6k蛋白表达与FIGO分期、淋巴结转移有关,与年龄及组织类型无关。5.琼脂糖凝胶电泳显示：184bp处为4EBp1目的条带,314bp处为p70s6k目的条带,564bp处为β-actin条带。半定量测定结果显示：4EBp1mRNA和p70s6k mRNA在三组中均为阳性表达,4EBp1mRNA在宫颈癌组织中的表达量为0.885±0.091,p70s6k mRNA在宫颈癌组织中的表达量为0.618±0.057,二者在宫颈癌中的的表达均高于正常宫颈组和CIN组(p67,α'=0.0167),正常宫颈组和CIN组之间4EBp1mRNA的表达量(0.103±0.009、0.625±0.052)存在差异,差异有统计学意义(p67), p70s6k mRNA在正常宫颈组和CIN组的表达量分别为0.176±0.011、0.543±0.046,存在差异(p67)。结论1.在正常宫颈

关键词：宫颈癌 4EBp1 p70s6k RT-pCR 免疫组织化学

瘦素、胰岛素及IGF-2对滋养细胞中pkB和p70s6k蛋白表达的影响及信号传导途径

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瘦素、胰岛素及IGF-2对滋养细胞中PKB和P70S6K蛋白表达的影响及信...

作者：王阳中国医科大学

学位级别：硕士

目的出生体重与成年疾病密切相关,大量研究表明影响出生体重的因素主要包括:营养因素、胎盘的结构和功能、生长因子以及激素。其中影响出生体重的多种生长因子和激素中最有代表性的是瘦素、胰岛素及胰岛素样生长因子-2(IGF-2)。但它们... 详细信息

目的出生体重与成年疾病密切相关,大量研究表明影响出生体重的因素主要包括:营养因素、胎盘的结构和功能、生长因子以及激素。其中影响出生体重的多种生长因子和激素中最有代表性的是瘦素、胰岛素及胰岛素样生长因子-2(IGF-2)。但它们影响出生体重的信号通路仍不十分明确。越来越多的研究发现pI3k/pkB/mTOR信号传导通路可通过调节其下游ps6k蛋白的表达和活性,调节滋养细胞的生长和分化。本研究通过瘦素、胰岛素及IGF-2对滋养细胞中pkB和ps6k蛋白表达的影响,以及这一信号通路中pI3k的特异性抑制剂LY294002和mTOR的特异性抑制剂雷帕霉素(rapamycin)对pkB和ps6k蛋白表达的调节作用,探讨瘦素、胰岛素及IGF-2对出生体重的影响是否同pI3k/pkB/mTOR信号途径存在联系。材料与方法正常妊娠妇女进行人工流产手术时获取的绒毛组织,用0.25%胰酶4℃消化约40min。离心后加入25IU/ml DNaseⅠ作用10～15min。100目滤网过滤,用2.5%和1.25%的BsA密度梯度沉降45min,收集下层滋养细胞离心后接种于预先涂有Ⅰ型胶原的培养皿中。37℃含5%CO湿度为99%的孵箱中培养。根据细胞生长情况2～3d换液一次。取生长状态较好的滋养细胞血清饥饿24小时后换成含10%胎牛血清的DMEM培养液,分别给与瘦素10nmo/L;胰岛素6nmol/L;IGF-2 25nmol/L作用24小时。另一组同时分别加入LY294002 20umol/L;rapamycin 100nmol/L作用24小时后收集细胞(5-6×10)备用。将收集的细胞按凯基全蛋白提取试剂盒步骤加提取液。考马斯亮蓝法蛋白定量,应用Western blot技术检测瘦素、胰岛素及IGF-2作用后滋养细胞中pkB和ps6k的蛋白表达情况,以及LY294002和rapamycin对蛋白表达的影响。结果用gene tools from syngene凝胶图象分析系统分析。资料以均数±标准差((?)±s)表示,结果采用spss13.0统计软件进行ANOVA检验,p＜0.05为差异有统计学意义。结果 1、瘦素、胰岛素及IGF-2刺激组滋养细胞中pkB和ps6k蛋白的表达同对照组相比明显增加(均p＜0.05)。 2、瘦素、胰岛素及IGF-2刺激组分别加入LY294002和rapamycin,pkB和ps6k蛋白的表达均明显降低(均p＜0.05)。结论 1、瘦素、胰岛素及IGF-2可促进滋养细胞中pkB和ps6k蛋白的表达,并且这种作用可被pI3k/pkB/mTOR信号传导通路的特异性抑制剂LY294002和rapamycin所抑制。 2、瘦素、胰岛素及IGF-2对出生体重的影响可能部分是通过pI3k/pkB/mTOR信号通路实现的。

关键词：瘦素胰岛素 IGF-2 滋养细胞 pkB p70s6k

雷帕霉素对脓毒症肺损伤mTOR和p70s6k表达的影响

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雷帕霉素对脓毒症肺损伤mTOR和p70S6K表达的影响

作者：佟雪超中国医科大学

学位级别：硕士

目的:探讨雷帕霉素对脓毒症急性肺损伤mTOR、p70s6k表达的影响。方法:本研究通过尾静脉注入Lps(细菌脂多糖)剂量为5mg/kg,建立脓毒症肺损伤模型,并给予雷帕霉素(2mg/kg)作为干预措施。分组:盐水对照组,Lps组,雷帕霉素组,观察其一般状态... 详细信息

目的:探讨雷帕霉素对脓毒症急性肺损伤mTOR、p70s6k表达的影响。方法:本研究通过尾静脉注入Lps(细菌脂多糖)剂量为5mg/kg,建立脓毒症肺损伤模型,并给予雷帕霉素(2mg/kg)作为干预措施。分组:盐水对照组,Lps组,雷帕霉素组,观察其一般状态及不同时间1、3、5、7、9天肺组织病理改变。酶联免疫吸附法(ELIsA)检测血清中白细胞介素-l(IL-1))肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-l0(IL-10)含量及肺泡灌洗液炎症细胞的数量变化;采用试剂盒检测血清谷胱甘肽过氧化物酶(GsH-px)、超氧化物歧化酶(sOD)、丙二醛(MDA)的含量;采用Real time pCR检测肺组织mTOR、p70s6k的表达的变化。结果:1、Lps组与雷帕霉素组大鼠肺泡灌洗液中蛋白含量1～9天均明显高于对照组,5天达高峰,之后逐渐下降,有统计学差异(pps组,有统计学差异(pps组与雷帕霉素组1～9天血清MDA、IL-6、IL-10及TNF-α含量高于对照组,3天达高峰,后逐渐降低(p6及TNF-α的含量较Lps组降低,IL-10的含量较Lps组升高(pps组与雷帕霉素组1～9天GsH-px含量较盐水对照组降低,5天达最低值,后逐渐升高(psH-px含量较Lps组升高(pps组与雷帕霉素组1～9天sOD含量较盐水对照组降低,3天达最低值(psOD含量较Lps组升高(pps组与雷帕霉素组1～9天大鼠肺组织W/D(湿干比)数值较对照组升高,3天达高峰,之后逐渐下降,差异有统计学意义(pps组降低(p6、Lps组与雷帕霉素组1～9天肺组织中mTOR、p70s6k表达较对照组增强,5天达峰值(pp70s6k表达Lps组减弱(pp70s6k的表达,减轻氧化应激损伤,平衡炎症细胞因子,达到对脓毒血症急性肺损伤的保护作用。

关键词：雷帕霉素脓毒症急性肺损伤 mTOR p70s6k

耐力运动、抗阻运动和混合运动对C57小鼠骨骼肌中ERk1/2、mTOR、p70s6k mRNA表达影响的比较研究

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耐力运动、抗阻运动和混合运动对C57小鼠骨骼肌中ERK1/2、mTOR、p...

作者：张京红华东师范大学

学位级别：硕士

随着我国逐渐步入老年化社会,老年人在身体诸多组织和器官的结构与机能上会出现衰退,其中骨骼肌衰老就是一个明显的标志。骨骼肌是人体最重要的运动器官,在衰老过程中骨骼肌机能的下降是衰老的重要标志。衰老与肌肉质量、力量和品质的... 详细信息

随着我国逐渐步入老年化社会,老年人在身体诸多组织和器官的结构与机能上会出现衰退,其中骨骼肌衰老就是一个明显的标志。骨骼肌是人体最重要的运动器官,在衰老过程中骨骼肌机能的下降是衰老的重要标志。衰老与肌肉质量、力量和品质的进一步下降有关,通常将由于衰老而引起肌肉的这种变化称之为肌肉衰减综合征(sarcopenia)。由于肌肉丢失而致的活动能力丧失预示着会有较多的身体残疾和死亡率的发生,而这些又与个人生活质量、社会需要和健康护理需要的贫乏有关。基于sarcopenia的严重威胁,对其发生的分子生物学机制和预防手段的深入探讨是当前研究的重点和热点。体育运动是人类健康生活方式的有机组成部分,在预防和减缓肌肉衰老过程中起到重要的作用,运动尤其是规律性抗阻运动在一定程度上延缓甚至逆转了肌肉的衰老,延缓了sarcopenia的进一步发展,并增加肌肉的体积、力量和非脂肪组织的重量,促进了老年人的肌肉健康。虽然各种运动训练对骨骼肌发生的效应具有差异,但就不同运动方式对动物或人类的肌源性反应及肌肉肥大能力的分子学机制研究还不多见,并且与肌肉肥大相关的细胞信号传导通路的变化及受运动模式影响的程度变化都所知有限。本文通过观察抗阻运动、耐力运动、耐力运动结合抗组运动对2月龄C57雄性小鼠28周的干预后骨骼肌内ERk1/2、mTOR、p70s6k mRNA水平表达的变化,旨在探讨不同性质的运动对骨骼肌蛋白合成增加的效应及不同肌肉发生此效应的变化程度,同时为选择有效引起肌肉肥大延缓骨骼肌衰老的运动方式和为制定能明显增强肌力的运动处方提供可行性的方法和理论根据。实验方法：本研究选取了32只2月龄C57雄性小鼠为研究对象,随机分为安静对照组(C)、耐力运动组(E)、负重爬梯组(R)、混合运动组(E+R),每组各8只。对所选对象采用跑台和负重爬梯分别作为耐力与抗阻运动的模式,为期28周。应用RT-pCR检测方法来测定ERk1／2、mTOR、p70s6k mRNA表达量。实验结果：1、运动显著降低了小鼠的体重。2、与安静组相比,耐力组、抗阻组及混合组小鼠腓肠肌湿重与体重的比值(G／W)均有极显著性升高;股四头肌湿重与体重的比值(V／W)与其情况相似。3、抗阻组小鼠腓肠肌内ERk1/2 mRNA表达量较其它三组而言,均呈极显著性增加;股四头肌内抗阻组情况相似,但混合组表达量较安静组和耐力组出现极显著下降。4、抗阻组小鼠腓肠肌内mTOR mRNA表达量较其它三组而言,均呈极显著性增加;股四头肌内抗阻组mTOR mRNA表达量较安静组和混合组而言,呈极显著性增加。耐力组相对混合组呈显著性增加。5、抗阻组小鼠腓肠肌内p70s6k mRNA表达量较其它三组而言,均呈极显著性增加。耐力组相对混合组呈显著性增加。混合组表达量较安静组呈极显著性下降;股四头肌内抗阻组p70s6k mRNA表达量较安静组呈显著性增加,而其较耐力组和混合组增加极显著。6、各组小鼠腓肠肌内ERk1/2 mRNA表达量与其相对应组股四头肌内ERk1/2 mRNA表达量相比,抗阻组腓肠肌内表达量明显高于股四头肌内表达量;就mTOR mRNA表达量而言,抗阻组腓肠肌内表达量极显著高于股四头肌内表达量;抗阻组内p70s6kmRNA表达与mTOR mRNA表达情况相似,但其他各组内其在腓肠肌内表达量均显著高于其在股四头肌内表达量。结论：1、运动影响了小鼠的体重变化,安静对照组体重增加最多,一般是由于脂肪增多所致;而耐力运动组体重变化最小,一般是由于脂肪消耗较多引起。2、三种不同形式的运动都使小鼠腓肠肌和股四头肌的比率增加,其中耐力运动组的增加可能是由于脂肪的相对减少所致;抗阻运动组的增加一般是由于肌肉本身质量的增加所致;混合运动组的增加可能是由于脂肪的相对减少或肌肉本身质量有所增加所致。3、三种运动模式中,抗阻运动使小鼠腓肠肌和股四头肌内ERk1/2、mTOR、p70s6kmRNA表达量均极显著增加,提示抗阻运动模式迄今是有效激活蛋白合成信号转导通路,促进肌肉肥大以及延缓sarcopenia发生的首选或最佳运动方式。4、耐力运动模式对小鼠腓肠肌或股四头肌内ERk1/2、mTOR、p70s6k mRNA表达无显著性影响,提示在抵抗骨骼肌衰老,增加肌肉质量上,耐力运动形式意义不大,没有实质的可取性。5、混合运动模式使小鼠腓肠肌和股四头肌内ERk1/2、mTOR、p70s6k mRNA表达量均发生下降,说明耐力运动会抑制抗阻运动产生的效果,提示在增加肌肉质量,延缓肌肉衰老的训练上要处理好这两种运动模式的关系,注意它们之间

关键词： sarcopenia 抗阻运动耐力运动混合运动基因表达 ERk1/2 mTOR p70s6k