检索结果-南通市图书馆

作者：卜志磊上海交通大学

学位级别：硕士

髓系白血病包括急性髓系白血病（AML）和慢性髓系白血病（CML）,两者都可携带有异常突变的癌基因,产生相应的癌蛋白,如能获得特异性降解癌蛋白的药物,将为治疗带来突破性进展。在急性髓系白血病患者中,携带FLT3-ITD突变的病例所占比例约... 详细信息

髓系白血病包括急性髓系白血病（AML）和慢性髓系白血病（CML）,两者都可携带有异常突变的癌基因,产生相应的癌蛋白,如能获得特异性降解癌蛋白的药物,将为治疗带来突破性进展。在急性髓系白血病患者中,携带FLT3-ITD突变的病例所占比例约为30%,针对该靶点已经研发出许多抑制剂。抑制剂作为单药治疗复发难治性白血病时,可以取得快速短暂的疗效和缓解,联合传统化疗时,可以提高病人的生存率。但FLT3抑制剂仅短期有效,很快就因为耐药的出现而失效,耐药机制之一包括FLT3蛋白本身TKD区域的点突变引起。在我们的研究中,我们筛选到一种滕黄科植物提取物新藤黄酸（Neogambogicacid,NGA）具有良好的抗肿瘤作用,包括对于携带FLT-ITD+的细胞系,我们还证实了NGA对FLT3-ITD+病人的原代细胞亦具有良好的杀伤肿瘤的作用,而对正常人的单个核细胞影响较小。我们采用CCK8和Westernblot、流式细胞术证明了该药的增值抑制及促凋亡作用,接下来的聚集体成分分离和使用聚集体检测试剂盒进行的免疫荧光实验证实了该药可促使FLT3向聚集体转移而降解。此外我们运用ROS探针DHE和DCFH-DA检测NGA处理过的FLT3-ITD+细胞系发现ROS水平升高,WB实验检测γ-H2AX说明NGA引起DNA损伤,应用ROS清除剂NAC进行预处理很大程度逆转ROS所引起的细胞凋亡。NGA对于稳转TKD区域耐药点突变D835V、Y842C的细胞系Baf3同样具有诱导凋亡及降解FLT3作用,NGA和临床用药硼替佐米表现出较强的协同作用,可加速FLT3降解及增加凋亡,从而有望在一定程度上克服目前FLT3抑制剂存在的耐药性问题,为治疗FLT3-ITD+患者提供了新的选择。对于慢性髓系白血病患者来说,酪氨酸激酶抑制剂的耐药性（TKIs）是目前临床面临的一个重要挑战。临床上有一些处于慢性期或者加速期的CML患者对TKIS及其他治疗效果不佳,高三尖杉酯碱（HHT）已获得批准用于治疗这些病人,但是,其潜在的作用机制仍然不清楚。在本研究中,我们用MTS及Western blot实验技术证实了HHT可以诱导伊马替尼耐药细胞K562R发生凋亡及下调BCR-ABL蛋白。CHX半衰期实验显示HHT可以诱导BCR-ABL蛋白降解,并且这一作用可被自噬溶酶体抑制剂CQ和Baf-A1逆转。随后,我们在K562R细胞中证明了HHT可以诱导自噬产生,沉默关键的自噬蛋白ATG5和Beclin-1则抑制HHT对BCR-ABL蛋白的降解和细胞毒性作用。我们进一步通过免疫共沉淀证实了自噬受体p62/sqstm1（p62）参与了HHT诱导的BCR-ABL的自噬降解。我们的结论是HHT诱导伊马替尼耐药的CML细胞系K562R中p62介导的自噬,并引起BCR-ABL蛋白质的降解。通过自噬诱导BCR-ABL蛋白降解是TKI耐药的CML治疗的新策略。因此,我们以上的研究在两种常见的髓系白血病中,创新性地找出了能够降解靶蛋白的两种药物,为治疗提供了新思路,并一定程度上克服现存的耐药性问题。

关键词： AML FLT3-ITD+ 耐药性新藤黄酸活性氧高三尖杉酯碱(HHT) 慢性髓系白血病(CML) BCR-ABL 自噬途径降解 p62/sqstm1

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microRNA-424-5p对人胃癌细胞SGC-7901自噬的影响及机制

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解剖科学进展 2017年第1期23卷 1-5页

作者：刘明辉郑永绵张键刘丽波鞍山市中心医院普外科中国医科大学第六临床学院普外科辽宁鞍山114001 中国医科大学基础医学院神经生物学教研室辽宁沈阳110122

目的研究microRNA-424-5p(miR-424-5p)对人胃癌细胞SGC-7901自噬的影响及可能机制。方法培养人正常胃黏膜上皮细胞GES和人胃癌细胞SGC-7901,应用实时定量pCR方法检测miR-424-5p的表达水平;应用Lipofectamine LTX试剂将化学合成的miR-424-5p agomir和miR-424-5p antagomir转染人胃癌细胞SGC-7901,验证转染效率后应用MTT方法检测细胞活力;应用免疫荧光法检测自噬标记物微管相关蛋白轻链-3(LC3)和自噬降解底物p62/sqstm1在SGC-7901细胞的分布;应用Western blot方法检测LC3-Ⅱ、p62/sqstm1和自噬相关蛋白Beclin1的蛋白表达水平。结果 miR-424-5p在人胃癌细胞SGC-7901中呈低表达,miR-424-5p过表达显著抑制人胃癌细胞SGC-7901的细胞活力,miR-424-5p表达沉默的作用效果与之相反。miR-424-5p过表达后自噬标记物LC3在SGC-7901细胞的胞浆内呈点状分布,荧光表达显著增强,并且LC3-II的蛋白表达水平显著上调,同时伴有自噬降解底物p62/sqstm1在细胞浆内荧光表达显著减弱,蛋白表达下调,此外,自噬相关蛋白Beclin1的蛋白表达水平显著上调;miR-424-5p表达沉默的作用效果与之相反。结论 miR-424-5p过表达明显抑制人胃癌细胞SGC-7901的细胞活力,诱导细胞发生自噬,其机制之一可能与自噬相关蛋白Beclin1上调有关。

关键词： miR-424-5p 人胃癌SGC-7901细胞自噬 LC3 p62/sqstm1 Beclin1

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pCMV6-Entryp-Entry p62真核表达质粒构建及高表达稳定细胞系的建立

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武警后勤学院学报（医学版） 2014年第4期23卷 277-280页

作者：秦晓静吕琪王成艳闫玉仙宋月英孙志广武警后勤学院附属医院病理科天津300162 武警后勤学院科研部中心实验室天津300309 武警后勤学院救援医学系药化教研室天津300309

【目的】构建pCMV6-Entry p62真核表达质粒,并将其转染至人乳腺癌细胞株MCF-7中,通过抗生素筛选构建高表达p62的稳定细胞系。【方法】以293ET细胞cDNA为模板,设计引物扩增p62基因片段,双酶切扩增出的目的基因片段及pCMV6-Entry Vector... 详细信息

【目的】构建pCMV6-Entry p62真核表达质粒,并将其转染至人乳腺癌细胞株MCF-7中,通过抗生素筛选构建高表达p62的稳定细胞系。【方法】以293ET细胞cDNA为模板,设计引物扩增p62基因片段,双酶切扩增出的目的基因片段及pCMV6-Entry Vector空载体,将酶切后的片段进行连接,转化构建质粒,酶切及测序验证;将构建好的质粒转染入MCF-7细胞株中,G418筛选稳定表达细胞株,并用实时定量pCR和Western blotting进行验证。【结果】酶切及测序结果证实成功构建pCMV6-Entry p62真核表达质粒;实时定量pCR结果显示,与对照组相比,转染p62的MCF-7稳定细胞中p62 mRNA的表达显著升高;Western blotting检测Flag及p62蛋白表达显示,在转染p62的MCF-7稳定细胞检在62 kd位置测到Flag阳性条带,对照组则没有阳性条带。在转染p62的MCF-7稳定细胞中p62蛋白的表达较对照组显著升高。【结论】成功构建了pCMV6-Entry p62真核表达质粒,并成功建立高表达p62的MCF-7稳定细胞系。

关键词： p62/sqstm1 自噬受体真核表达质粒 MCF-7

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