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柑橘p5cs1克隆和鉴定以及脯氨酸代谢基因的表达分析

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柑橘P5CS1克隆和鉴定以及脯氨酸代谢基因的表达分析

作者：尚天歌华中农业大学

学位级别：硕士

柑橘因其种类多样,口感丰富,在我国水果市场所占比例逐年上升。随着种植面积的不断扩大,柑橘对各种非生物胁迫适应性也需要加强。脯氨酸通过快速、大量积累响应逆境胁迫,维持植物体正常的生理代谢反应,其作用的发挥依赖于p5cs在整个代... 详细信息

柑橘因其种类多样,口感丰富,在我国水果市场所占比例逐年上升。随着种植面积的不断扩大,柑橘对各种非生物胁迫适应性也需要加强。脯氨酸通过快速、大量积累响应逆境胁迫,维持植物体正常的生理代谢反应,其作用的发挥依赖于p5cs在整个代谢通路中的调节调控作用。为了进一步探究p5cs在不同胁迫下的表达,实验克隆了印度酸橘p5cs1,并进行生物信息学分析、基因表达模式探索,以及酵母单杂交、亚细胞定位、病毒诱导的基因沉默(VIGS)等功能研究。结果如下:1.利用生物信息学分析得到印度酸橘p5cs1序列包含713个氨基酸,其蛋白等电点为5.29,分子量为77430.25,属于亲水蛋白。根据氨基酸序列上发现的两个保守结构域构建分子进化树,结果显示印度酸橘p5cs1与甜橙的亲缘性最近。扩增得到p5cs1启动子,发现包含与干旱、光照、组织特异性表达相关的顺式作用元件,如ABRE,MYB,RY-element等。2.分析基因相对表达含量发现,p5cs在脱水、盐胁迫以及低温条件下,表达呈现先上升后下降的趋势。实验选择脯氨酸合成降解途径的三个关键酶基因p5cs,p5CR,pro DH,施加上述三种胁迫并分析了它们在枳壳、印度酸橘、红橘三个柑橘品种中的表达趋势。发现p5cs表达趋势在不同胁迫下、不同品种中一致;p5CR在红橘中随胁迫时间延长,表达呈现先降低后上升的趋势。3.非生物胁迫中,脯氨酸含量的变化对盐胁迫更为敏感。在不同的胁迫处理时间节点,分别测定三个柑橘品种的脯氨酸含量,发现同一胁迫下,脯氨酸含量在三个品种中变化趋势较为一致,且对盐胁迫响应更为敏感。红橘在脱水和低温处理时脯氨酸含量较高,枳壳在盐胁迫下脯氨酸含量响应速度较慢但含量最高。综上所述,在枳壳、印度酸橘、红橘三种柑橘品种中,p5cs1调控的脯氨酸合成对盐胁迫响应更为准确。印度酸橘p5cs1启动子和基因全长结构功能的预测分析,也为后续实验展开提供了方向。

关键词：脯氨酸 p5cs1 印度酸橘非生物胁迫

杨树脯氨酸合成关键基因p5cs1的表达特征及耐干旱功能验证

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杨树脯氨酸合成关键基因P5CS1的表达特征及耐干旱功能验证

作者：任若寒西北农林科技大学

学位级别：硕士

杨树（populus）作为重要的用材和造林树种,广泛应用于造纸、家具工业和生物能源。杨树的地上部分生长快,对水分的需求量大,而我国西北干旱和半干旱地区水分匮乏,杨树的生长发育受到了严重抑制,干旱已成为影响其可持续发展的一个重要因... 详细信息

杨树（populus）作为重要的用材和造林树种,广泛应用于造纸、家具工业和生物能源。杨树的地上部分生长快,对水分的需求量大,而我国西北干旱和半干旱地区水分匮乏,杨树的生长发育受到了严重抑制,干旱已成为影响其可持续发展的一个重要因素。脯氨酸的积累常常在植物应对干旱等渗透胁迫时出现,以缓解胁迫带给植物的损害。p5cs作为编码脯氨酸合成关键酶的基因,具有较大的研究价值。本研究在白杨派杨树优良品种84K杨（populus alba×***）中克隆脯氨酸合成代谢的关键限速酶基因-p5cs1基因,分析了其时空表达模式及干旱胁迫响应特征;以银中杨（populus alba×***）为遗传转化受体进行了p5cs1基因的超表达、抑制表达遗传转化,从表型、分子和生理水平上对p5cs1基因的抗旱功能进行了鉴定。主要结果如下:1.84K杨p5cs1基因克隆分析表明,pag p5cs1开放阅读框为2160 bp,由719个氨基酸编码组成。在现有的毛果杨数据库中,通过生物信息学分析,预测pt p5cs1和pt p5cs2均为不含信号肽的非跨膜的亲水性蛋白。系统发育结果表明,pt p5cs1和pt p5cs2蛋白在植物进化中高度保守。启动子元件分析显示pt p5cs1和pt p5cs2蛋白中含有大量的顺式作用元件,表明p5cs在杨树耐受干旱等非生物胁迫中有重要作用。2.通过荧光定量pCR试验测定银中杨脯氨酸合成代谢基因pa p5cs1、pa p5cs2和pa OAT表达水平,结果表明,随着干旱时间的增加,它们的表达量逐渐上升,故杨树脯氨酸合成代谢基因p5cs1、p5cs2和OAT在应对干旱胁迫时的调控中具有一定功能。p5cs1、p5cs2和OAT基因在杨树的根、茎、叶中均有表达,其中p5cs1和p5cs2基因在杨树叶片中表达水平最高,在茎干中表达水平最低;OAT基因在杨树叶片中表达水平最高,在根中表达水平最低。3.构建了pag p5cs1超表达载体,并根据农杆菌介导法转化银中杨叶片,成功获得12个pag p5cs1超表达转基因杨树株系,其中p5cs1基因表达量最高的杨树株系为野生型表达量的8.3倍。4.经过干旱胁迫处理,相对于野生型,超表达株系叶片萎蔫程度更低;在干旱胁迫下,超表达株系中p5cs1基因表达量和脯氨酸含量均高于野生型,说明p5cs1超表达增强了杨树的耐旱性,p5cs1基因在干旱胁迫下发挥了正向调控作用。综上所述,杨树p5cs1基因对干旱胁迫高度响应,pag p5cs1对干旱胁迫下杨树游离脯氨酸的合成、积累具有关键作用,超表达杨树会通过增加脯氨酸积累来增强杨树的耐干旱能力。

关键词：杨树脯氨酸 p5cs1 干旱

杨树脯氨酸合成关键基因pagp5cs1全长克隆及功能验证

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西北林学院学报 2023年第4期38卷 90-96页

作者：任若寒王海泽吴承生衡启蒙陈文义孙甜甜张丽娟贺浩冉李想张银燕樊军锋张一西北农林科技大学林学院国家林业和草原局黄土高原林木培育重点实验室陕西杨陵712100 陕西省安康市林业技术推广中心陕西安康725000 江西省赣州市崇义县农业农村局江西赣州341399

杨树是重要的工业用材树种。我国北方干旱和半干旱地区水分匮乏,干旱已成为影响杨树人工林可持续发展的一个重要因素。游离脯氨酸的积累常常在植物应对干旱等渗透胁迫时出现,以缓解干旱胁迫带给植物的损害。p5cs作为编码脯氨酸合成关键... 详细信息

杨树是重要的工业用材树种。我国北方干旱和半干旱地区水分匮乏,干旱已成为影响杨树人工林可持续发展的一个重要因素。游离脯氨酸的积累常常在植物应对干旱等渗透胁迫时出现,以缓解干旱胁迫带给植物的损害。p5cs作为编码脯氨酸合成关键酶的基因,对于植物调控游离脯氨酸合成、增强耐干旱能力非常关键。该研究克隆84K杨脯氨酸合成代谢的关键基因pagp5cs1并在银中杨内进行遗传转化,从表型、分子和生理水平上对pagp5cs1转基因杨树株系进行了功能鉴定。本研究构建的pagp5cs1超表达载体通过叶盘法转化至银中杨叶片,成功获得12个pagp5cs1超表达杨树株系,其中p5cs1基因表达量最高的转基因株系为野生型表达量的8.3倍。经过干旱胁迫处理,相对于野生型,超表达株系叶片萎蔫程度更低;在干旱胁迫下,超表达株系中p5cs1基因表达量和脯氨酸含量均高于野生型,说明p5cs1超表达增强了杨树的耐旱性,p5cs1基因在干旱胁迫下发挥了正向调控作用。综上所述,杨树p5cs1基因对干旱胁迫高度响应,pagp5cs1超表达杨树会通过增加脯氨酸积累来增强杨树的耐旱性。

关键词：杨树脯氨酸 p5cs1 干旱

木薯Mep5cs1基因的克隆、表达分析及载体构建

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江苏农业科学 2017年第18期45卷 40-43页

作者：丁泽红付莉莉黄猛颜彦铁韦韦张家明胡伟中国热带农业科学院热带生物技术研究所海南海口571101

对从木薯Ku50叶片中克隆的1个p5cs基因Me p5cs1进行聚乙二醇(pEG)、脱落酸(ABA)、盐胁迫下的表达分析,结果表明,基因Me p5cs1具有1个2 220 bp的开放阅读框,编码739个氨基酸,且含有p5cs保守结构域;Me p5cs1与杨树、杞柳的p5cs基因亲缘关... 详细信息

对从木薯Ku50叶片中克隆的1个p5cs基因Me p5cs1进行聚乙二醇(pEG)、脱落酸(ABA)、盐胁迫下的表达分析,结果表明,基因Me p5cs1具有1个2 220 bp的开放阅读框,编码739个氨基酸,且含有p5cs保守结构域;Me p5cs1与杨树、杞柳的p5cs基因亲缘关系相对较近,序列相似性分别达到88.61%、88.95%;Me p5cs1基因在第1张完全展开叶、老叶中的表达量受到pEG处理诱导,且与叶片中脯氨酸的含量变化趋势一致;Me p5cs1基因的表达还受到脱落酸(ABA)、盐胁迫处理的诱导。在此基础上,成功构建Me p5cs1基因的植物表达载体p CAMBIA 2300-Me p5cs1,为进一步解析Me p5cs1在木薯抗旱中的作用机制提供参考。

关键词：木薯 Me p5cs1 非生物胁迫克隆基因表达载体构建

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藜麦内参基因筛选及盐胁迫相关基因表达分析

烟台大学学报（自然科学与工程版） 2020年第3期33卷 283-288页

作者：贾冰晨王宇张东亮吴筱林尹海波陈世华郭善利烟台大学生命科学学院山东烟台264005

为了利用实时荧光定量pCR(quantitative Real-Time pCR,qRT-pCR)分析藜麦(Chenopodium quinoa Willd)相关基因表达,提高结果的准确性,筛选出稳定表达的内参基因至关重要.我们分别利用geNorm、NormFinder和Bestkeeper程序分析了6个藜麦候选内参基因在NaCl胁迫下表达的稳定性,并用实时荧光定量pCR技术对藜麦盐胁迫相关基因p5cs1和CMO基因相对表达量进行分析.结果表明,藜麦在NaCl胁迫下ACT-1和TUB-6做为内参基因表达最稳定,为最佳内参基因;藜麦p5cs1基因表达水平上调6倍左右,CMO基因上调30~40倍.本研究为NaCl胁迫下藜麦基因表达分析提供了可靠的内参基因,并且对NaCl胁迫下p5cs1和CMO基因表达情况做出初步分析.

关键词：藜麦实时荧光定量pCR 内参基因 p5cs1 CMO