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梭链孢烷抗生素的生物合成机制研究

梭链孢烷抗生素的生物合成机制研究

作者：曹志秦暨南大学

学位级别：硕士

梭链孢烷抗生素是一类真菌来源的非羊毛甾烷型四环三萜化合物,它是以原萜烯醇(protostadienol)为前体,通过脱去C-4β甲基,氧化C-20甲基成羧基以及C-16β位形成乙酰氧基等一系列反应形成的,其中具有代表性的梭链孢烷抗生素有三个:夫西地... 详细信息

梭链孢烷抗生素是一类真菌来源的非羊毛甾烷型四环三萜化合物,它是以原萜烯醇(protostadienol)为前体,通过脱去C-4β甲基,氧化C-20甲基成羧基以及C-16β位形成乙酰氧基等一系列反应形成的,其中具有代表性的梭链孢烷抗生素有三个:夫西地酸(Fusidic acid),烟曲霉酸(Helvolic acid),头孢菌素p(Cephalosporin p)。梭链孢烷抗生素具有高效的抗革兰氏阳性菌活性,其中夫西地酸已被临床上用于治疗葡萄球菌引起的各种感染,其主要通过抑制移位因子EF-G(Elongation factor G),阻碍细菌蛋白质的合成而发挥抗菌作用。由于其作用机制特殊,与目前临床常用的抗生素无明显交叉耐药性,在全球抗生素耐药问题日趋严重的当下,发现新型梭链孢烷衍生物具有重要意义。迄今为止,研究人员利用化学衍生化以及生物转化等方法对夫西地酸的结构进行了大量改造,但至今仍未获得比夫西地酸活性更强的衍生物。组合生物合成已成为丰富天然产物结构多样性的有力手段,但其成功运用的前提是需要揭示目标化合物的生物合成途径。2009年,日本东京大学Mitsuguchi等人在烟曲霉酸高产菌株Aspergillus fumigatus Af293的基因组中发现了烟曲霉酸潜在的生物合成基因簇,该基因簇共包含有九个基因。Mitsuguchi等人利用酵母表达系统,确定了其中三个基因(helA,helB1,helC)的功能:环化酶HelA是负责催化2,3(S)-环氧鲨烯环化成原萜烯醇骨架(protostadienol),短链脱氢还原酶HelC是负责氧化C-3β羟基形成羰基,而p450氧化酶HelB1负责将C-4β甲基氧化成羧基。为了系统揭示烟曲霉酸的生物合成途径,本课题组吕建明博士利用米曲霉表达系统,采用一次性导入和逐步导入的方法,将之前预测的九个基因导入到米曲霉中,确定了基因簇的完整性,并首次构建了烟曲霉酸完整的生物合成途径(Nature communications,8,1644,2017)。然而,夫西地酸与头孢菌素p的生物合成机制至今未见报道,因此本课题将在前期研究的基础上,阐明夫西地酸与头孢菌素p的生物合成途径,从而系统揭示梭链孢烷抗生素完整的生物代谢网络。本课题首先通过从夫西地酸生产菌Acremonium fusidioides ATCC 14700以及头孢菌素p生产菌Acremonium chrysogenum ATCC 15500的基因组中寻找环化酶helA的同源基因,分别寻找到了夫西地酸和头孢菌素p潜在的生物合成基因簇。我们将获得的两个基因簇,与烟曲霉酸基因簇进行比较,发现这三个基因簇中均含有保守的6个基因(helA,helB1,helB2,helD2,helB4和helC),而这保守的6个基因恰好是作用于烟曲霉酸生物合成的早期阶段。基于上述结果,我们推断梭链孢烷抗生素的生物合成早期均由保守的6基因催化完成,然后发生分支,在各自后修饰酶的作用下生成三种不同的抗生素。为了验证以上推测,我们将夫西地酸基因簇中剩下的2个后修饰基因(fusC1和fusB1)和头孢菌素p基因簇中剩下的3个后修饰基因(cepC2,cepB4和cepD2)分别导入到前期构建好的6基因表达菌株中,结果产生了夫西地酸与头孢菌素p,从而确认了夫西地酸与头孢菌素p的生物合成基因簇。随后我们采用基因逐步导入,体外酶催化以及底物喂养等实验,确认了各个后修饰基因的功能并且系统地阐明了夫西地酸与头孢菌素p的生物合成途径。在夫西地酸生物合成途径中,我们确认了短链脱氢还原酶FusC1的功能是将C-3位羰基还原成C-3α羟基,而p450氧化酶FusB1是负责氧化C-11形成C-11α羟基。有趣的是,我们在夫西地酸的生物合成基因簇中,发现两个短链脱氢还原酶FusC1和FusC2,它们能立体选择性的还原同一底物的C-3位羰基,分别形成C-3α和C-3β羟基。为了更进一步表征FusC1和FusC2体外反应的特性,我们对它们的辅因子、温度、pH进行了考察,结果发现FusC1的最适反应辅因子为NADpH,pH为7,温度为5 C,而FusC2的最适反应辅因子为NADH,pH为7,温度为37 C。在头孢菌素p的生物合成途径中,我们确认了短链脱氢还原酶CepC2的功能是将C-3位羰基还原成C-3α羟基,而p450氧化酶CepB4是负责C-6和C-7的双氧化,形成C-6α羟基和C-7β羟基,另外乙酰转移酶CepD2是负责将C-6α羟基乙酰化。在研究头孢菌素p生物合成途径中,我们发现CepB4是一个多功能的p450氧化酶,采用微粒体体外反应实验,我们证明了CepB4不仅能同时氧化C-6和C-7,还能单独氧化C-6形成C-6α羟基,并进一步氧化成羰基,也可以单独氧化C-7形成C-7β羟基。在本研究

关键词：米曲霉梭链孢烷抗生素夫西地酸头孢菌素p1 短链脱氢还原酶 p450氧化酶

浅蓝霉素A生物合成途径中甲基转移酶CrmM的功能鉴定

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浅蓝霉素A生物合成途径中甲基转移酶CrmM的功能鉴定

作者：余君彤暨南大学

学位级别：硕士

放线菌是海洋沉积物中最重要的细菌类型，分布广泛，种类繁多。海洋放线菌生活于苛刻特殊的海洋环境使其具备复杂独特的代谢途径，其次级代谢产物在结构类型以及生物活性等方面都很特殊而使放线菌成为最重要的药用微生物种群。浅蓝霉素A... 详细信息

放线菌是海洋沉积物中最重要的细菌类型，分布广泛，种类繁多。海洋放线菌生活于苛刻特殊的海洋环境使其具备复杂独特的代谢途径，其次级代谢产物在结构类型以及生物活性等方面都很特殊而使放线菌成为最重要的药用微生物种群。浅蓝霉素A（CaerulomycinsA）是从海洋蓝灰异壁放线菌（Actinoalloteichus cyanogriseus）中分离得到的次级代谢产物，具有较强的抗肿瘤抗真菌活性以及中度的抗细菌活性。台勾霉素B（Tiacumicin B）是由陆生放线菌指孢囊菌（Dactylosporangium aurantiacum subsp. hamdenensis）NRRL18085产生的18元环大环内酯类抗生素，可抑制由艰难梭菌（Clostridium difficile）引起的传染病。天然产物的生物合成大致可分为前体形成、骨架构建以及后修饰三部分。天然抗生素的合成过程，在基本骨架形成后，通常都会进行多步的后修饰改造。研究表明，代表性的后修饰酶包括甲基转移酶、p450氧化酶、酰基转移酶、糖基转移酶、卤化酶、氨基转移酶和磷酸化酶等等。这些后修饰反应大幅度地增加了天然产物的种类及其结构的多样性，是组合生物学重要研究手段。本文结合浅蓝霉素和台勾霉素生物合成的初步研究结果，探讨其后修饰作用及其发挥功能的相关酶类，为通过生物组合的方法设计和制造出新的具有更高应用价值的天然产物奠定了基础。为验证浅蓝霉素A合成中后修饰酶CrmM和台勾霉素B合成中后修饰酶Tiap1和Tiap2的功能，本研究分别对这三个基因进行了克隆。成功地克隆并构建了浅蓝霉素A生物合成基因簇中crmM基因，台勾霉素B生物合成基因簇中tiap1和tiap2基因组氨酸标签以及GST（谷胱甘肽S转移酶，glutathione S-transferase）标签的原核表达载体;实现了CrmM GST标签融合蛋白在*** BL21中的表达和纯化，以及Tiap1，Tiap2组氨酸标签融合蛋白在*** BL21中的表达和纯化;对CrmM的体外活性研究结果显示，CrmM具有第二个吡啶环4位O-甲基转移的功能，验证了CrmM为甲基转移酶，并对产物进行了质谱鉴定;通过生物转化验证了Tiap2可能发挥羟基化作用。

关键词：海洋放线菌浅蓝霉素A 台勾霉素B 甲基转移酶 p450氧化酶

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提高泰乐菌素及其衍生物泰万菌素的产量研究

提高泰乐菌素及其衍生物泰万菌素的产量研究

作者：薛利敏天津大学

学位级别：硕士

泰乐菌素是弗氏链霉菌(Streptomyces fradiae)通过发酵获得的一种16元大环内酯类抗生素,被国内外广泛用作畜禽专用抗生素和饲料添加剂。其衍生物泰万菌素,可通过耐热链霉菌(Streptomyces thermotolerans)生物转化泰乐菌素获得,泰万菌素... 详细信息

泰乐菌素是弗氏链霉菌(Streptomyces fradiae)通过发酵获得的一种16元大环内酯类抗生素,被国内外广泛用作畜禽专用抗生素和饲料添加剂。其衍生物泰万菌素,可通过耐热链霉菌(Streptomyces thermotolerans)生物转化泰乐菌素获得,泰万菌素对支原体的抗菌活性是泰乐菌素的4倍,并且对多种抗生素耐药菌均具有抑制作用,也是国内外广泛使用的兽药。本研究拟通过丁烯酰辅酶A还原酶(CCR)和p450氧化酶在弗氏链霉菌QL100中的表达,来提高泰乐菌素的产量,结果发现,来源于泰乐菌素生产菌的CCR基因orf4*,ccr2,以及来源于米尔贝霉素生产菌的CCR基因SBI-01394和SBI-02836在弗氏链霉菌过表达后,可分别使泰乐菌素的产量提高22.48%,21.31%,26.08%和23.03%。同源的p450氧化酶基因tyl I的过表达可使产量提高11.37%,而外源的p450氧化酶基因ros C的过表达使产量降低了30%。实验通过多拷贝质粒p KC1140构建了乙酰化基因acy A,异戊酰化基因acy B1,正调控基因acy B2和acy B1B2重组质粒,来提高泰万菌素的产量,结果发现,四个基因分别使泰万菌素的产量提高了3.30%,4.27%,5.23%和14.69%。随后考察acy B1B2在不同的载体对泰万菌素产量的影响,构建了p SET153-acy B1B2重组质粒,结果表明,p SET153-acy B1B2使产量提高了12.38%,与p KC1140-acy B1B2相比差距较小,而p SET153载体的稳定性远高于p KC1140,两个表达菌株对泰乐菌素的耐受性为150μg/m L,均提高了50%。综上所述,选择p SET153质粒作为acy B1B2的表达载体,其表达菌株将被用于工业生产。为了进一步提高泰万菌素的产量,通过响应面法对泰万菌素工业转化菌的摇瓶发酵条件进行优化,获得最优发酵条件:初始p H为8.0,发酵转速为260r/min,发酵温度为30℃,发酵时间为96h,转种量为7%,装液量为60m L和种龄为48h,泰万菌素的产量为7700.61μg/m L,与预测值的误差为3.21%,较原始发酵条件下的产量提高了15.46%,结果表明,运用响应面实验优化泰万菌素转化发酵条件可有效提高其产量。

关键词：泰乐菌素泰万菌素丁烯酰辅酶A还原酶 p450氧化酶 acyB1B2 响应面优化

烟碱去甲基化酶及降烟碱相关遗传改良研究进展

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湖南农业科学 2013年第9期 5-8页

作者：邹颉余婧付强林叶春赵杰宏贵州省烟草科学研究院烟草行业烟草分子遗传重点实验室贵州贵阳550081

综述了近年国内外烟碱去甲基化分子机制方面的研究进展:烟碱去甲基化过程所需要的关键酶属于烟草内源p450氧化酶的亚型之一,该酶在普通栽培烟草中存在多个等位基因版本,其中多数在现代烟草中失活,主要的催化活性来自CYp82E4和CYp82E5,... 详细信息

综述了近年国内外烟碱去甲基化分子机制方面的研究进展:烟碱去甲基化过程所需要的关键酶属于烟草内源p450氧化酶的亚型之一,该酶在普通栽培烟草中存在多个等位基因版本,其中多数在现代烟草中失活,主要的催化活性来自CYp82E4和CYp82E5,这两个基因的主要诱导因素为衰老及烟草中的转化现象;介绍了烟草遗传育种领域各种阻断烟碱去甲基化以及降低降烟碱积累的遗传改良方法;并结合近年来发展起来的育种新技术对如何降低烟叶中的烟草特有亚硝胺的分子育种进行了展望。

关键词：烟草亚硝胺(TSNA) 降烟碱 p450氧化酶分子育种综述