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甾体p450双羟化酶CYp-cl3催化效率强化的分子改造及机制解析

甾体P450双羟化酶CYP-cl3催化效率强化的分子改造及机制解析

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作者：何鹏江南大学

学位级别：硕士

三羟基雄甾烯酮(7α,15α-di OH-DHEA)是去氢表雄酮(DHEA)的双羟化衍生物,可作为新一代口服避孕药屈螺酮合成的中间体。以DHEA为底物经微生物转化获得7α,15α-di OH-DHEA的过程因高效、绿色的特点,具有巨大的研究和应用价值。研究室前... 详细信息

三羟基雄甾烯酮(7α,15α-di OH-DHEA)是去氢表雄酮(DHEA)的双羟化衍生物,可作为新一代口服避孕药屈螺酮合成的中间体。以DHEA为底物经微生物转化获得7α,15α-di OH-DHEA的过程因高效、绿色的特点,具有巨大的研究和应用价值。研究室前期从丝状真菌亚麻刺盘孢Colletotrichum lini ST-1中获得对DHEA具有C7α和C15α双羟化活性的p450酶CYp-cl3,并实现了其在毕赤酵母GS115中的异源表达。催化过程显示CYp-cl3对DHEA的双羟化是一个先C7α后C15α位的两步连续反应。但由于CYp-cl3在异源宿主毕赤酵母GS115中酶活性较低,导致底物转化率不高。而且该双羟化反应的第二步羟化效率较低,造成中间体7α-OH-DHEA的大量积累,进而制约着7α,15α-di OH-DHEA的进一步合成。针对上述问题,本文首先采用定向进化策略提高CYp-cl3酶的活性,继而通过半理性设计改善第二步C15α羟化反应的效率。在此基础上,在5 L发酵罐中开展了优势组合突变体的高效表达和底物转化研究,有效提升了重组菌株合成7α,15α-di OH-DHEA的能力。进一步结合突变数据探究关键残基对酶活性的贡献,初步解析CYp-cl3对DHEA催化活性的分子机制。主要研究结果如下:(1)甾体p450双羟化酶CYp-cl3催化活性强化的定向进化。建立了快速鉴定生物转化样品中7α,15α-di OH-DHEA和7α-OH-DHEA的硫酸显色方法,并应用于CYp-cl3定向进化文库中高酶活突变体的筛选,相比传统液相方法速度提高了600倍。采用随机突变方法构建了CYp-cl3基因的定向进化文库,并在毕赤酵母GS115进行表达以用于对DHEA的生物转化。通过显色反应进行转化样品的快速初步筛选,并用高效液相色谱复筛以确定阳性突变。经过三轮定向进化,筛选获得突变体(A83p/E264I/V281A)的总产物摩尔得率提高至77.9%,较天然CYp-cl3提高了38%。(2)甾体p450双羟化酶CYp-cl3第二步催化效率强化的半理性设计改造。基于CYp-cl3/7α-OH-DHEA对接模型,采用计算机模拟饱和突变方法设计出16个对中间体7α-OH-DHEA亲和力提高的CYp-cl3单突变体,并通过全细胞转化验证了其中影响第二步反应效率的潜在位点(308位和315位)。生物转化样品的产物分布表明,突变体L308M和T315p显示出第二步羟化反应效率的提高,7α,15α-di OH-DHEA在总产物中的比例分别提高了13.2%和17.8%。进一步将有益突变引入定向进化获得的最佳突变体中,获得的组合突变体CYp-cl3-A83p/E264I/V281A/T315p使7α,15α-di OH-DHEA在总产物中的比例提高至43.5%。进一步在5 L发酵罐中进行了以上组合突变体的表达优化和底物转化。通过优化甲醇流加速度,当底物投料量为4 g·L时,7α,15α-di OH-DHEA在总产物占比最高达到99.9%,同时7α,15α-di OH-DHEA浓度最高达0.782 g·L,较摇瓶水平提高了218.7%。(3)甾体p450双羟化酶CYp-cl3结构与催化能力关系的初步解析。基于本研究中定向进化和半理性设计获得的突变数据,采用CYp-cl3同源模型分析,分别研究了底物锚定位点、活性口袋位点、远端位点等对CYp-cl3催化DHEA双羟化反应的影响。结果表明,对于CYp-cl3的催化活性,第122和494位残基与底物DHEA之间的氢键缺失会导致催化活性部分或完全丧失。定向进化获得的A83p、E264I和V281A残基均位于活性口袋远端,可能改善了CYp-cl3与细胞色素p450还原酶的结合从而显示出酶活性的提高。第126、311及371位点并非完全保守,相似残基的取代能够在一定程度上维持酶的催化活性,这对CYp-cl3功能的稳定性具有重要意义。对于第二步羟化反应效率,第227和312位突变导致的极性改变以及较大的位阻可能是酶与中间体的亲和力减弱的原因,从而导致了该步反应效率的降低。脯氨酸侧链的刚性环状结构使T315p突变体的I螺旋局部向活性中心偏移,收缩了底物结合口袋并使中间体7α-OH-DHEA与活性中心的结合更为紧密,从而提高了CYp-cl3的第二步羟化反应效率。此外,活性口袋中的其他位点突变大多对改善第二步羟化效率无正向作用,推测可能是由于底物结合口袋的保守性限制了CYp-cl3对DHEA连续反应的进行。

关键词： 7α,15α-diOH-DHEA p450双羟化酶定向进化半理性设计机制解析

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