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载p311微球的温敏壳聚糖水凝胶对大鼠全层皮肤缺损创面愈合的影响

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中华烧伤与创面修复杂志 2022年第10期38卷 914-922页

作者：张清荣陈长友徐娜吕大伦贾杰只李文红罗高兴于云龙张逸南通大学附属医院烧伤整形外科南通226001 陆军军医大学(第三军医大学)第一附属医院全军烧伤研究所创伤、烧伤与复合伤国家重点实验室重庆市疾病蛋白质组学重点实验室重庆400038 皖南医学院第一附属医院烧伤整形外科芜湖241001 北京桀亚莱福生物技术有限责任公司北京100094

目的探讨载p311微球的温敏壳聚糖水凝胶对大鼠全层皮肤缺损创面愈合的影响。方法采用实验研究方法。通过油包水乳化法制备聚乙烯醇/海藻酸钠微球(单纯微球)、p311微球及异硫氰酸荧光素标记的牛血清白蛋白(FITC-BSA)微球,于光学显微镜/... 详细信息

目的探讨载p311微球的温敏壳聚糖水凝胶对大鼠全层皮肤缺损创面愈合的影响。方法采用实验研究方法。通过油包水乳化法制备聚乙烯醇/海藻酸钠微球(单纯微球)、p311微球及异硫氰酸荧光素标记的牛血清白蛋白(FITC-BSA)微球,于光学显微镜/倒置荧光显微镜下观察形貌。制备壳聚糖溶液,将壳聚糖溶液和β-磷酸甘油二钠水合物混合制备单纯温敏水凝胶,在单纯温敏水凝胶中加入相应物质制备载单纯微球和载p311微球的温敏水凝胶,观察4种液体在37℃时倾斜状态下的形态变化,冷冻干燥后于扫描电子显微镜下观察微观形貌。取18只3~4周龄雄性SD大鼠,分为不进行任何处理的正常组及于背部脊柱两侧分别制作1个全层皮肤缺损创面并进行相应处理的敷贴组、壳聚糖组、单纯水凝胶组、载单纯微球水凝胶组、载p311微球水凝胶组,每组3只。取5组全层皮肤缺损大鼠,于伤后0(即刻)、5、10、15 d观察创面愈合情况,计算伤后5、10、15 d创面愈合率;取5组全层皮肤缺损大鼠伤后15 d创面和创缘组织及正常组大鼠相同部位正常皮肤组织,行苏木精-伊红染色观察组织学变化,行免疫组织化学染色观测CD31及血管内皮生长因子(VEGF)的表达,采用蛋白质印迹法检测CD31及VEGF的蛋白表达。样本数均为3。对数据行单因素方差分析、重复测量方差分析及Bonferroni校正。结果单纯微球呈球形,表面疏松多孔;p311微球及FITC-BSA微球表面光滑无孔隙,且FITC-BSA微球散发出均匀的绿色荧光;3种微球直径基本一致,为33.1~37.7μm。在37℃时倾斜状态下,与壳聚糖溶液及单纯温敏水凝胶相比,载微球的2种水凝胶结构更稳定。载微球的2种水凝胶网状结构较壳聚糖溶液、单纯温敏水凝胶更致密,且其横断面可见直径约30μm的微球。伤后15 d内,5组大鼠创面均不同程度愈合,其中载p311微球水凝胶组大鼠创面愈合情况最好。敷贴组、壳聚糖组大鼠伤后5、10、15 d创面愈合率分别为(26.6±2.4)%、(38.5±3.1)%、(50.9±1.5)%,(47.6±2.0)%、(58.5±3.6)%、(66.7±4.1)%,均明显低于载p311微球水凝胶组的(59.3±4.8)%、(87.6±3.2)%、(97.2±1.0)%,ppp311微球水凝胶组(pp311微球水凝胶组大鼠伤后15 d创面已几乎完全上皮化,创面血管、毛囊、皮脂腺生成及CD31和VEGF阳性表达较其他4组全层皮肤缺损大鼠明显增加,CD31和VEGF蛋白表达均较其余5组大鼠明显增加(pp311微球的温敏壳聚糖水凝胶,可以缓释包载的药物,延长药物作用时间,并通过促进创面血管生成及再上皮化,促进全层皮肤缺损大鼠创面愈合。

关键词：生物相容性材料水凝胶微球体 p311 血管生成创面修复

p311 promotes typeⅡtransforming growth factor-βreceptor mediated fibroblast activation and granulation tissue formation in wound healing

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Burns & Trauma 2022年第1期10卷 175-190页

作者： Jue Wang Ruoyu Shang Jiacai Yang Zhihui Liu Yunxia Chen Cheng Chen Wenxia Zheng Yuanyang Tang Xiaorong Zhang Xiaohong Hu Yong Huang Han-Ming Shen Gaoxing Luo Weifeng He State Key Laboratory of Trauma Burn and Combined InjuryInstitute of Burn ResearchSouthwest HospitalThird Military Medical University(Army Medical University)Chongqing 400038China Chongqing Key Laboratory for Disease proteomics Chongqing 400038China Department of Technical Support Chengdu Zhijing Technology Co.LtdChengdu 610041China Academy of Biological Engineering Chongqing UniversityChongqing 400038China Faculty of Health Sciences University of MacaoMacaoChina

Background:p311,a highly conserved 8 kDa intracellular protein,has recently been reported to play an important role in aggravating hypertrophic scaring by promoting the differentiation and secretion of fibroblasts.Nevertheless,how p311 regulates the differentiation and function of fibroblasts to affect granulation tissue formation remains unclear.In this work,we studied the underlying mechanisms via which p311 affects fibroblasts and promotes acute skin wound repair.Methods:To explore the role of p311,both in vitro and in vivo wound-healing models were used.Full-thickness skin excisional wounds were made in wild-type and p311−/−C57 adult mice.Wound healing rate,re-epithelialization,granulation tissue formation and collagen deposition were measured at days 3,6 and 9 after skin injury.The biological phenotypes of fibroblasts,the expression of target proteins and relevant signaling pathways were examined both in vitro and in vivo.Results:p311 could promote the proliferation and differentiation of fibroblasts,enhance the ability of myofibroblasts to secrete extracellular matrix and promote cell contraction,and then facilitate the formation of granulation tissue and eventually accelerate skin wound closure.Importantly,we discovered that p311 acts via up-regulating the expression of type II transforming growth factor-βreceptor(TGF-βRII)in fibroblasts and promoting the activation of the TGF-βRII-Smad signaling pathway.Mechanistically,the mammalian target of rapamycin signaling pathway is closely implicated in the regulation of the TGF-βRII-Smad pathway in fibroblasts mediated by p311.Conclusions:p311 plays a critical role in activation of the TGF-βRII-Smad pathway to promote fibroblast proliferation and differentiation as well as granulation tissue formation in the process of skin wound repair.

关键词： p311 Wound healing Fibroblasts TGF-βRII-Smad pathway Re-epithelialization Granulation tissue formation Collagen deposition

p311和转化生长因子β1相互作用及其对小鼠成纤维细胞功能的影响

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中华烧伤杂志 2016年第4期32卷 208-215页

作者：张路李海胜姚智慧杨思思贺伟峰吴军罗高兴第三军医大学西南医院全军烧伤研究所创伤、烧伤与复合伤国家重点实验室重庆400038

目的探讨p311和TGF—β1在小鼠皮肤Fb中的相互作用及其对Fb功能的影响。方法取p311野生型和p311基因敲除型C57BL／6新生小鼠各5只，分离培养2种小鼠皮肤Fh。采用第2代Fb完成以下实验，每个实验重复3次。（1）取p311野生型小鼠Fb，按随... 详细信息

目的探讨p311和TGF—β1在小鼠皮肤Fb中的相互作用及其对Fb功能的影响。方法取p311野生型和p311基因敲除型C57BL／6新生小鼠各5只，分离培养2种小鼠皮肤Fh。采用第2代Fb完成以下实验，每个实验重复3次。（1）取p311野生型小鼠Fb，按随机数字表法（分组方法下同）分为空白对照组和p311过表达组，每组36孔。空白对照组每孔加入10μL空载体腺病毒，p311过表达组每孔加入等效价p311腺病毒表达载体。培养48h后，采用实时荧光定量RT—pCR法和蛋白质印迹法分别检测2组Fb的p311mRNA及TGF—β1、α平滑肌肌动蛋白（a-SMA）、I型胶原的mRNA和蛋白表达量（检测方法下同）。（2）取p311野生型和p311基因敲除型小鼠Fb各4瓶，待细胞生长至80％～90％融合时，检测2种Fh的TGF—β1、a-SMA、I型胶原的mRNA和蛋白表达量。（3）取p311野生型小鼠Fb用体积分数为1％FBS的DMEM培养液饥饿处理3h后，分为空白对照组及5、10、15、20、25ng／mLTGF—β1组，每组2瓶。空白对照组常规培养，后5组F11分别加入5、10、15、20、25ng／mLTGF—β1溶液，培养48h后检测6组F11的p311mRNA表达量。另取p311野生型小鼠Fh，分为空白对照组和10ng／mLTGF—β1组，每组6孔，免疫荧光法检测2组Fb的p311蛋白表达情况。（4）将p311野生型小鼠F11同前饥饿处理后，分为空白对照组和10ng／mLTGF—β1组，每组2瓶，空白对照组常规培养，后组加入10ng／mL的TGF-β溶液，培养48h后，检测2组Fh的d—SMA、I型胶原的mRNA和蛋白表达量。取p311基因敲除型小鼠Fb，同前分组及处理后，检测2组Fh的d—SMA、I型胶原的mRNA和蛋白表达量。对数据行单因素方差分析、t检验。结果（1）p311过表达组Fh的p311mRNA表达水平较空白对照组增高近30万倍（t=9．942，p〈0．001）。p311过表达组Fh的TGF—β1、d—SMA、I型胶原的mRNA，以及TGF-β1前体、TGF—β1活化态、a-SMA、I型胶原的蛋白表达量均较空白对照组明显升高（t值为8．192～49．090，p值均小于0．01）。（2）p311基因敲除型小鼠F1]的TGF—p．、d—SMA、I型胶原的mRNA表达量较p311野生型小鼠Fb明显降低（t值为8．157～22．270，p值均小于0．01）。p311基因敲除型小鼠Fb的TGF-β1前体、a-SMA、I型胶原的蛋白表达量较p311野生型小鼠Fb明显降低（t值为2．995～12．600，p〈0．05或p〈0．01），2种Fb的TGF—β1活化态蛋白表达量相近（t=1．070，p〉0．05）。（3）空白对照组及5、10、15、20、25ng／mLTGF—β1组Fb的p311mRNA表达量分别为1．28±0．44、3．61±0．91、6．64±0．92、6．58±1．04、1．79±0．31、0．16±0．06。与空白对照组Fh的p311mRNA表达量比较，5、20ng／mLTGF-β1组无明显变化（t值分别为2．302、0．955，p值均大于0．05），10、15ng／mLTGF—β1组明显增高（t值分别为5．630、4．710，p值均小于0．001），25ng／mLTGF-β1组明显降低（t=2．509，p〈0．01）。10ng／mLTGF—β1组Fh的p311蛋白表达明显强于空白对照组。（4）p311野生型小鼠10ng／mLTGF—p，组Fh的d—SMA、I型胶原的mRNA和蛋白表达量均较空白对照组有不同程度的升高（t值为3．523～14．290，p〈0．05或p〈0．01）。p311基因敲除型小鼠10ng／mLTGF—β1组Fb的a—SMA、I型胶原的mRNA和蛋白表达量均较空白对照组有不同程度的升高（t值为4．895～14．870，p〈0．05或p〈0．01）。结论p311和TGF—β1在小鼠皮肤Fb中存在相互作用，可共同促进Fb的分化。

关键词：瘢痕成纤维细胞转化生长因子β1 p311

p311和整合素β4结合蛋白在非小细胞肺癌中的表达及意义

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中华肿瘤杂志 2010年第7期32卷 526-528页

作者：唐春兰袁顺宗杨和平王清良章容第三军医大学西南医院呼吸内科重庆400038 第三军医大学西南医院病理研究所重庆400038 解放军军事医学科学院第三0七医院淋巴瘤和头颈肿瘤科

目的探讨p311和整合素β4结合蛋白（ITGB4Bp）在非小细胞肺癌（NSCLC）中的表达及意义.方法 80例NSCLC石蜡标本制成组织芯片,采用链菌素亲生物素-过氧化物酶法（Sp）检测F311和ITGB4Bp的表达情况,应用SpSS 13.0软件进行统计分析.结果 p... 详细信息

目的探讨p311和整合素β4结合蛋白（ITGB4Bp）在非小细胞肺癌（NSCLC）中的表达及意义.方法 80例NSCLC石蜡标本制成组织芯片,采用链菌素亲生物素-过氧化物酶法（Sp）检测F311和ITGB4Bp的表达情况,应用SpSS 13.0软件进行统计分析.结果 p311和ITGB4Bp在NSCLC中的阳性表达率分别为77.5%（62/80）和82.5%（66/80）,p311和ITGIMBp表达均阳性者占73.8%（59/80）,一致率为87.5%,具有显著一致性（Kappa=0.611,p〈0.001）.结论 NSCLC中可能存在一条新信号途径p311-ITGB4Bp,且可能具有调节肺癌细胞迁移的作用.

关键词：癌,非小细胞肺免疫组织化学 p311 ITGB4Bp 细胞信号传导

p311在小鼠浅Ⅱ度烧伤及体外细胞创伤模型中对表皮干细胞迁移的影响

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中华烧伤杂志 2012年第3期28卷 213-218页

作者：孙薇姚志慧詹日兴张小容崔艳艳谭江琳杨思思胡晓红周俊峄吴军罗高兴第三军医大学西南医院全军烧伤研究所创伤、烧伤与复合伤国家重点实验室重庆市疾病蛋白质组学重点实验室重庆400038

目的观察p311在小鼠浅Ⅱ发烧伤技体外细胞创伤模型中对表皮干细胞（ESC）辽移的作用并探讨其机制。方法（1）取18只C57BL／6小鼠，其中15只行背部浅Ⅱ度烧伤，于伤后6、12、24、48、72h取创面及创周皮肤组织，各时相点3只；余下3只小鼠... 详细信息

目的观察p311在小鼠浅Ⅱ发烧伤技体外细胞创伤模型中对表皮干细胞（ESC）辽移的作用并探讨其机制。方法（1）取18只C57BL／6小鼠，其中15只行背部浅Ⅱ度烧伤，于伤后6、12、24、48、72h取创面及创周皮肤组织，各时相点3只；余下3只小鼠作为正常对照，同法取止常皮肤标本。采用生物素-链霉亲和素-过氧化物酶（Sp）染色法观察p311在上述皮肤组织中的表达。（2）取6只新生的C57BL／6小鼠，连续3d腹腔注射50μg／g溴脱氧尿苷（BrdU，2次／（1）建立ESC示踪模型。7周后于其背部制作浅Ⅱ度烧伤创面。伤后72h取创面皮肤组织制作连续切片，Sp法免疫组织化学染色，观察p311阳性和BrdU阳性细胞空间共定位情况。（3）构建腺病毒空载体pAdEasy-增强型绿色荧光蛋h（EGFp）及p311腺病毒表达载体pAdEasy-EGFp-p311，并进行包装。应用Ⅳ型胶原快速黏附法分离培养人ESC,按照随机数字表法将其分为p311高表达组和EGFp对照组，每组3孔，分别以pAdEasy-EGFp-p311及pAdEasy-EGFp腺病毒感染ESC。2组ESC经丝裂毒素C处理2h后行划痕实验。划痕后0（即刻）、24、48、72h测量地固定范围内划痕剩余面积，计算划痕愈合面积百分比。对数据进行独立样本t检验。结果（1）浅Ⅱ度烧伤后不同时相点，p311在创面不同部位的表达量各不相同。伤后创面毛囊、新生表皮巾p311表达量随时间延长逐渐上升；创用表皮及毛囊的p311表达量于伤后12h达高峰，72h回落至正常。（2）应用BrdU标记的小鼠浅Ⅱ度烧伤创Ⅲ新生表皮层可见p311阳性细胞和BrdU阳性细胞共定位。（3）划痕后48、72h，p311高表达组ESC划痕愈合面积百分比分别为（69±31）％、（89±26）％，明显高于EGFp刘照组[（35±12）％、（46±31）％，t值分别为-2．336、-2，611，p值均小于0．05]。结论p311可明显促进小鼠浅Ⅱ度烧伤创面及体外细胞创伤模型中的ESC迁移，可能在创面修复中起重要作用。

关键词：烧伤创伤和损伤细胞运动 p311 表皮干细胞创面愈合

缺氧诱导因子1α对p311的作用及其对小鼠表皮干细胞迁移的影响

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中华烧伤杂志 2017年第5期33卷 287-294页

作者：徐正东李海胜王淞贺伟峰吴军罗高兴第三军医大学西南医院全军烧伤研究所创伤、烧伤与复合伤国家重点实验室重庆400038

目的体外条件下模拟缺氧环境，探讨p311和缺氧诱导因子1α（HIF-1α）相互作用及对小鼠表皮干细胞（ESC）迁移影响。方法取15只C57BL/6J野生型新生小鼠，5只同属来源p311基因敲除新生小鼠，分离培养2种小鼠ESC，取第1代细胞行形态学观... 详细信息

目的体外条件下模拟缺氧环境，探讨p311和缺氧诱导因子1α（HIF-1α）相互作用及对小鼠表皮干细胞（ESC）迁移影响。方法取15只C57BL/6J野生型新生小鼠，5只同属来源p311基因敲除新生小鼠，分离培养2种小鼠ESC，取第1代细胞行形态学观察，采用流式细胞仪检测细胞表面标志物CD71、CD49f表达后行以下实验。（1）取2种小鼠ESC划痕处理后，立即按随机数字表法（下同）将p311基因敲除小鼠ESC分为常氧组（将细胞加入完全培养基置于常氧二氧化碳培养箱培养，常氧处理下同）和缺氧组（将细胞置于含体积分数1%氧气的缺氧二氧化碳培养箱培养，缺氧处理下同），每组12个插件；将野生型小鼠ESC分为常氧组、单纯缺氧组、二甲基亚砜（DMSO）对照组（用2 μL DMSO溶剂常氧处理1 h后行缺氧培养）、HIF-1α抑制剂组（加入11 μmol/L HIF-1抑制剂2 μL常氧培养1 h后行缺氧培养）、HIF-1α稳定剂组（加入2 μmol/L FG-4592 2 μL常氧处理1 h后行缺氧培养），每组12个插件。每组各时相点取3个插件分别于划痕后0（即刻）、12 、24、48 h在100倍倒置相差显微镜下测量划痕剩余宽度。（2）取野生型小鼠ESC行缺氧培养，蛋白质印迹法检测缺氧0（即刻）、12、24、48 h HIF-1α蛋白表达。（3）取野生型小鼠ESC同实验（1）分为单纯缺氧组、DMSO对照组、HIF-1α抑制剂组、HIF-1α稳定剂组并行相应处理，分别在缺氧0、12、24、48 h采用实时荧光定量RT-pCR法检测p311 mRNA表达，免疫细胞化学染色法观测p311表达（样本数均为12）。（4）取第2代人胚胎肾293（HEK-293）细胞分为空载缺氧组（转染空载质粒后进行缺氧培养）、p311常氧组（转染p311报告基因质粒后进行常氧培养）、p311缺氧组（转染p311报告基因质粒后进行缺氧培养）、p311缺氧＋HIF-1α抑制剂组（HIF-1抑制剂处理后转染p311报告基因质粒然后进行缺氧培养），分别于培养0、12 h检测荧光素酶活性，采用生物信息学方法预测HIF-1α对p311转录调节的结合位点并查找p311启动子序列。对数据行析因设计方差分析、单因素方差分析、LSD检验以及Bonferroni校正。结果（1）ESC结果。细胞呈现铺路石样改变，细胞由于增殖潜能不同而呈现不同克隆状态。CD71－CD49f＋细胞占85%左右，说明ESC的干性较强、纯度较高。与p311基因敲除小鼠常氧组比较，单纯缺氧组细胞划痕后12、24 h划痕剩余宽度较小（p值均小于0.05），缺氧组、野生型小鼠常氧组、DMSO对照组、HIF-1α抑制组、HIF-1α稳定剂组细胞划痕后12 h划痕剩余宽度较小（p值均小于0.05）。与野生型小鼠常氧组比较，缺氧组、单纯缺氧组、DMSO对照组细胞划痕后12、24 h划痕剩余宽度较小（p值均小于0.05），HIF-1α稳定剂组细胞划痕后12 h划痕剩余宽度较小（p〈0.05）。与单纯缺氧组比较，缺氧组细胞划痕后12、24 h划痕剩余宽度较大（p值均小于0.05），HIF-1α抑制剂组细胞划痕后12 h划痕剩余宽度较大（p〈0.05），HIF-1α稳定剂组细胞划痕后12、24 h划痕剩余宽度较小（p值均小于0.05）。7组小鼠细胞间划痕后48 h划痕剩余宽度总体比较差异不明显（F＝19.02，p〉0.05）。野生型小鼠ESC缺氧0、12、24、48 h的HIF-1α蛋白表达量分别为1.02±0.05、2.56±0.09、1.60±0.17、1.17±0.03。与缺氧0 h比较，HIF-1α蛋白表达量缺氧12 h明显增加（p〈0.01），缺氧24 h开始下降但仍高于缺氧0 h（p〈0.05），缺氧48 h后降至常氧水平（p〉0.05）。与单纯缺氧组比较，HIF-1α抑制剂组细胞缺氧各时相点p311 mRNA表达量均明显下降（p值均小于0.05），HIF-1α稳定剂组细胞p311 mRNA表达量则在缺氧12、24 h明显升高（p值均小于0.05）。与HIF-1α抑制剂组比较，DMSO对照组和HIF-1α稳定剂组细胞在缺氧0、12、24 h p311 mRNA表达量均明显升高（p值均小于0.05）。与单纯缺氧组比较，HIF-1α抑制剂组细胞缺氧各时相点p311表达量均明显下降（p值均小于0.05），而HIF-1α稳定剂组细胞p311表达量则在缺氧12、24 h明显升高（p值均小于0.05）。与HIF-1α抑制剂组比较，DMSO对照组和HIF-1α稳定剂组细胞p311表达量在缺氧12、24 h明显升高（p值均小于0.05）。（2）HEK-293细胞结果。培养0 h，空载缺氧组、p311常氧组、p311缺氧组、p311缺氧＋HIF-1α抑制剂组细胞荧光素酶活性差异无统计学意义（F＝13.33，p〉0.05）。培养12

关键词：缺氧诱导因子1 细胞迁移分析伤口愈合表皮干细胞 p311

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神经元蛋白3.1结合蛋白的筛选与鉴定

生物化学与生物物理进展 2010年第12期37卷 1303-1312页

作者：周小海刘宇胡乃月王春燕赵立青南开大学生命科学学院天津300071

哺乳动物肺组织发育的基本模式总体分为上皮分支的形态发生和分隔膜的形成两个部分.基因p311是克隆到的一个在分隔膜形成阶段特异表达的基因,可能在肺泡发育中起重要作用.为进一步探讨神经元蛋白3.1(p311)对肺发育过程的影响,构建了小... 详细信息

哺乳动物肺组织发育的基本模式总体分为上皮分支的形态发生和分隔膜的形成两个部分.基因p311是克隆到的一个在分隔膜形成阶段特异表达的基因,可能在肺泡发育中起重要作用.为进一步探讨神经元蛋白3.1(p311)对肺发育过程的影响,构建了小鼠肺组织cDNA文库,以融合Gal4 DNA结合结构域的重组p311蛋白为诱饵,利用酵母双杂交技术从文库中筛选p311结合蛋白.通过免疫共沉淀和双分子荧光互补等技术进一步验证,SpARC(secreted protein,acidic and rich incysteine)被确定为p311相互作用蛋白.进一步的研究发现,SpARC在肺组织中具有与p311相似的表达时序特征,双重免疫组织化学染色显示SpARC和p311在小鼠肺组织中共定位于肺泡上皮细胞和肌成纤维细胞中.提示p311可能通过与SpARC的相互作用影响肺泡发育.

关键词：肺发育 p311 SpARC 酵母双杂交

增生性瘢痕成纤维细胞中羟基丙酮酸异构酶同系物结合结构域分析

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中华烧伤杂志 2012年第1期28卷 60-64页

作者：汪静刘洋张克马兵赵云四川大学生命科学学院生物资源与生态环境教育部重点实验室成都610064 成都医学院附属医院烧伤整形科

目的了解增生性瘢痕Fb中羟基丙酮酸异构酶同系物（HYI）与p311蛋白相互作用的结合区域. 方法（1）以克隆有p311的pMD18-T质粒为模板,对p311进行pCR扩增；Trizol法提取人增生性瘢痕Fb的总RNA,对HYI进行RT-pCR扩增,采用双酶切法分别构建p... 详细信息

目的了解增生性瘢痕Fb中羟基丙酮酸异构酶同系物（HYI）与p311蛋白相互作用的结合区域. 方法（1）以克隆有p311的pMD18-T质粒为模板,对p311进行pCR扩增；Trizol法提取人增生性瘢痕Fb的总RNA,对HYI进行RT-pCR扩增,采用双酶切法分别构建pGA DT7-p311和pGBKT7-HYI重组载体,pCR及测序验证.采用prot Seale软件和HNN软件对HYI蛋白进行二级结构分析,据此结果扩增HYI-1（1 ～447 bp）、HYI-2（247 ～447 bp）、HYI-3（1 ～279 bp）、HYI-4（247 ～654 bp）片段,双酶切法构建pGBKT7-HYI-1、2、3、4重组载体,经pCR及测序验证.（2）采用醋酸锂法将酵母细胞AH109制备成感受态细胞,粗略等量分为HYI全长与HYI-1、2、3、4杂交组,以及阳性对照组和阴性对照组.采用聚乙二醇-醋酸锂法,前5组分别同时转化pGBKT7-HyI全长、各片段的重组载体与pGADT7-p311重组载体,后2组分别同时转化pGBKT7-53与pGADT7-RecT重组载体、pGBKT7-Lam与pGADT7-RecT重组载体.转化后即刻,取各组部分细胞分别涂布在缺乏亮氨酸、色氨酸、腺嘌呤及组氨酸的培养基（简称四缺培养基）上,另取各组部分细胞分别涂布在缺乏亮氨酸和色氨酸的培养基（简称二缺培养基）上,培养3～6d,观察菌株生长情况,5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷显色反应检测菌落β半乳糖苷酶表达. 结果（1）克隆出的p311片段与Genbank中p311（序号hsu36189）序列一致.与Genbank中HYI（序号AY775560）序列对比,HYI基因扩增片段在496 bp处的A替换为了G.经验证各重组载体插入片段无误.（2）计算机模拟结果显示,组成HYI蛋白的216个氨基酸中,可能形成α螺旋的氨基酸有101个,可能形成无规则卷曲的氨基酸有90个,可能形成延伸链的氨基酸有25个.（3）HYI-1、2、3、4克隆片段大小与预期相符,经验证各重组载体插入片段无误.（4）除阴性对照组菌株未见在四缺培养基上生长外,其他组菌株均在2种培养基上生长,其中HYI-2（α螺旋结构最少）、HYI-3杂交组长出菌落较少.（5）除生长在二缺培养基上的阴性对照组菌落和生长在四缺培养基上的HYI-2杂交组菌落未见β半乳糖苷酶表达外,其他在四缺培养基上长出的各组菌落均有β半乳糖苷酶表达. 结论 HYI与p311蛋白可能以α螺旋结构紧密结合,在增生性瘢痕Fb向肌成纤维细胞转分化过程中发挥重要作用.

关键词：瘢痕成纤维细胞双杂交系统技术羟基丙酮酸异构酶同系物结合结构域 p311

BUB1、DppA2、p311在胃癌组织中的表达及与临床特征相关性研究

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全科医学临床与教育 2023年第10期21卷 930-933,F0002页

作者：王玲玲高敏丽台州市肿瘤医院病理科浙江台州317502 浙江省台州医院综合外科

胃癌在消化系统中发病率较高,是恶性肿瘤死亡原因之一[1]。胃癌细胞多种分子的表达异常在治疗及诊断中有重要意义[2,3]。BUB1是纺锤体检测点的蛋白,在胃癌中染色体的不稳定是由BUB1表达异常出现细胞恶性情况引起的[4]。多能发育相关基因... 详细信息

胃癌在消化系统中发病率较高,是恶性肿瘤死亡原因之一[1]。胃癌细胞多种分子的表达异常在治疗及诊断中有重要意义[2,3]。BUB1是纺锤体检测点的蛋白,在胃癌中染色体的不稳定是由BUB1表达异常出现细胞恶性情况引起的[4]。多能发育相关基因2(developmental pluripotency associated gene 2,DppA2)在多能性细胞中发现,在机体发育过程中DppA2与细胞的多能性有密切关系[5]。胃癌组织中增生性瘢痕相关蛋白(抗原)(p311 protein,p311)蛋白表达量异常增高,且其具体表达量与肿瘤细胞增殖、侵袭、自噬等恶性生物学行为直接相关[6]。本次研究旨在研究BUB1、DppA2、p311在胃癌组织中的表达及与临床特征相关性,为临床提供数据参考。

关键词：胃癌组织机体发育恶性生物学行为增生性瘢痕 p311 多能性胃癌细胞