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截短的弓形虫p30基因在***中的高效表达及纯化条件的探索

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中国人兽共患病杂志 2001年第2期17卷 14-18页

作者：龚娅陈晓光杨培梁中国人民解放军第157中心医院检验科广州510515 第一军医大学寄生虫学教研室

目的　构建能在E .coli中高效表达的弓形虫主要表面抗原 (p30 )基因的重组表达质粒 ,并对纯化条件进行优化。方法　对已知的弓形虫p30基因序列进行部分取舍 ,用pCR技术从弓形虫ZS1株的基因组DNA中扩增出截短的p30基因片段 ,插入载体pET ... 详细信息

目的　构建能在E .coli中高效表达的弓形虫主要表面抗原 (p30 )基因的重组表达质粒 ,并对纯化条件进行优化。方法　对已知的弓形虫p30基因序列进行部分取舍 ,用pCR技术从弓形虫ZS1株的基因组DNA中扩增出截短的p30基因片段 ,插入载体pET 30 (a)中 ,转化大肠杆菌DH5α,IpTG诱导表达 ,包涵体经洗涤、变性、复性及不同程度的浓缩后 ,进行SDS pAGE及免疫印迹分析。结果　从弓形虫ZS1株基因组DNA中扩增出截短的p30基因片段 ,成功构建重组表达质粒 pET p30 ;SDS -pAGE显示蛋白表达带的分子量约为 31kD ,表达量占菌体总蛋白的 31.5 8% ,经 1M及 2M尿素洗涤后 ,其纯度分别达 6 3.42 %及 75 .74% ;免疫印迹显示 ,该纯化蛋白能被弓形虫病人阳性血清所识别 ,而且当浓缩至初始体积的 1/ 3～ 1/ 6时 ,纯化蛋白与DNA免疫鼠血清的反应最强。结论　成功构建重组质粒 pET p30 ,并以融合蛋白的形式进行了高效表达 ,经变性、复性后 ,该蛋白具有特异的免疫反应性 ,为弓形虫诊断试剂盒的研制打下基础。

关键词：弓形虫 p30基因蛋白表达 E.coli 纯化

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弓形虫p30基因MBp融合蛋白的表达

中国人兽共患病杂志 2000年第1期16卷 29-31页

作者：丛华古钦民黄勇李瑛禹卉山东医科大学寄生虫教研室济南250012

目的　构建弓形虫主要表面抗原Ｐ３０基因的原核表达载体并在Ｅ－ｃｏｌｉ中表达。方法　根据已发表的弓形虫Ｐ３０基因序列，自行设计合成一对引物并在引物５’端分别引入限制性内切酶ＥｃｏＲＩ、ＳａｌＩ酶切位点，用ＰＣＲ技术从... 详细信息

目的　构建弓形虫主要表面抗原Ｐ３０基因的原核表达载体并在Ｅ－ｃｏｌｉ中表达。方法　根据已发表的弓形虫Ｐ３０基因序列，自行设计合成一对引物并在引物５’端分别引入限制性内切酶ＥｃｏＲＩ、ＳａｌＩ酶切位点，用ＰＣＲ技术从弓形虫ＲＨ株基因组ＤＮＡ中扩增Ｐ３０基因片段，插入ｐＭＡＬＰ２质粒转化大肠杆菌ＤＨ５ａα感受态细胞，于氨苄ＬＢ培养平板上筛选阳性克隆，经过酶切及ＰＣＲ扩增鉴定重组子。将阳性重组子经ＩＰＴＧ诱导表达，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及免疫印迹分析。结果　从弓形虫ＲＨ株ＤＮＡ中扩增出９７６ｂｐ的Ｐ３０基因，构建成功ｐＭＡＬＰ２－Ｐ３０重组质粒；ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳及Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ显示ＭＢＰ／Ｐ３０融合蛋白条带的分子量约为７７－５ｋＤ，减去ＭＢＰ的分子量４３ｋＤ，得出Ｐ３０蛋白分子量为３４－５ｋＤ，且能被弓形虫高免鼠血清识别。结论　从弓形虫基因组ＤＮＡ中获取Ｐ３０基因，并成功构建ｐＭＡＬＰ２－Ｐ３０重组质粒，诱导表达了Ｐ３０的融合蛋白。为进一步Ｐ３０蛋白的分离纯化及其对动物的免疫原性研究作好准备。

关键词：弓形虫 p30基因融合蛋白基因表达 MBp

绵羊肺炎支原体Y98 p30基因的克隆、表达及免疫试验

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中国兽医学报 2012年第3期32卷 397-400,405页

作者：赵红艳刘文青车腾飞卢金华宋静岚赵宝华河北师范大学生命科学学院河北石家庄050016

根据猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp)跨膜蛋白p30基因序列设计引物,通过pCR克隆出绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae,MO)膜蛋白p30基因片段。通过对该序列的同源性分析表明MOp30基因与Mhp p30基因核苷酸序列同源性为... 详细信息

根据猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp)跨膜蛋白p30基因序列设计引物,通过pCR克隆出绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae,MO)膜蛋白p30基因片段。通过对该序列的同源性分析表明MOp30基因与Mhp p30基因核苷酸序列同源性为79%。抗原表位及跨膜结构预测的结果表明,MO p30基因与Mhp p30基因的抗原表位及跨膜结构均具有高度的一致性。该片段中含1个TGA编码Trp,而不是终止密码子。将p30基因与原核表达载体pET-28a连接构建pET-28a-p30表达质粒,转化受体菌Rossta得到重组菌株Rossta(pET-28a-p30)。经诱导后SDS-pAGE表明有30 000左右的目的条带出现;Western blot表明Rossta(pET-28a-p30)表达的30 000蛋白主要以包涵体的形式存在;小鼠免疫试验表明Rossta(pET-28a-p30)原核表达的蛋白对小鼠具有一定的保护作用。

关键词：绵羊肺炎支原体Y98 p30基因基因表达免疫动物

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弓形虫主要表面抗原p30基因克隆与表达

中国兽医学报 1999年第4期19卷 356-358页

作者：赵文忠王祥生刘万臣解放军农牧大学军事兽医研究所长春130062

将液氮保存的弓形虫ＮＴ株经小鼠复壮后，取腹腔液提取弓形虫基因组ＤＮＡ，采用ＰＣＲ方法从弓形虫ＮＴ株中扩增出约８００ｂｐ的片段。产物经ＥｃｏＲＩ和ＸｂａＩ酶切后，克隆到ｐＵＣ１９载体中... 详细信息

将液氮保存的弓形虫ＮＴ株经小鼠复壮后，取腹腔液提取弓形虫基因组ＤＮＡ，采用ＰＣＲ方法从弓形虫ＮＴ株中扩增出约８００ｂｐ的片段。产物经ＥｃｏＲＩ和ＸｂａＩ酶切后，克隆到ｐＵＣ１９载体中，构建了ｐＢＶ Ｐ３０非融合表达质粒和ｐＥＴ Ｐ３０融合表达质粒。ｐＢＶ Ｐ３０转化到宿主菌ＤＨ５α、ｐＥＴ Ｐ３０转化到宿主菌ＢＬ２１（ＤＥ３）后，分别经温控诱导和ＩＰＴＧ诱导，产物经ＳＤＳ ＰＡＧＥ分析，ｐＢＶ Ｐ３０未发现表达产物，ｐＥＴ Ｐ３０出现约３００００的产物。Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ显示，该蛋白与兔抗弓形虫血清发生特异性反应；薄层扫描显示，该蛋白占菌体总蛋白的２０％以上。

关键词：弓形虫表面抗原 p30基因克隆表达

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含弓形虫p30基因插入昆虫杆状病毒的研究

中国寄生虫学与寄生虫病杂志 1996年第4期14卷 270-273页

作者：陈晓光刘国章江静波第一军医大学寄生虫学教研室中山大学生物系/生物工程中心

目的：将弓形虫ＺＳ１株主要表膜抗原（Ｐ３０）基因插入到昆虫杆状病毒基因组中，为在昆虫细胞或昆虫体内表达及生产Ｐ３０作准备。方法：先将Ｐ３０基因亚克隆到转移载体质粒ｐＳＸ－ＩＶＶＩ＋Ｘ３中，然后用此重组载体质粒ＤＮＡ与... 详细信息

目的：将弓形虫ＺＳ１株主要表膜抗原（Ｐ３０）基因插入到昆虫杆状病毒基因组中，为在昆虫细胞或昆虫体内表达及生产Ｐ３０作准备。方法：先将Ｐ３０基因亚克隆到转移载体质粒ｐＳＸ－ＩＶＶＩ＋Ｘ３中，然后用此重组载体质粒ＤＮＡ与亲本株病毒ＤＮＡ共转染培养的草地夜蛾细胞，经空斑纯化筛选出重组病毒株。结果：已得到含Ｐ３０基因的重组杆状病毒ＴｎＮＰＶ－Ｐ３０。结论：本文已将弓形虫ＺＳ１株Ｐ３０基因亚克隆到昆虫杆状病毒ＴｎＮＰＶ中。

关键词：弓形虫 p30基因昆虫杆状病毒

弓形虫p30基因DNA免疫小鼠诱导小鼠体液免疫应答及保护性研究

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中国人兽共患病杂志 1999年第5期15卷 41-43页

作者：周永安陈观今郭虹郑焕钦中山医科大学寄生虫学研究所广州510089

目的　用重组质粒ｐｃＤＮＡ３－Ｐ３０免疫ＢＡＬＢｃ小鼠，观察其ＤＮＡ免疫所诱导的小鼠体液免疫反应和保护性作用。方法　大量制备质粒ＤＮＡ，肌肉注射免疫小鼠。ＥＬＩＳＡ测定ＩｇＧ抗体滴度；... 详细信息

目的　用重组质粒ｐｃＤＮＡ３－Ｐ３０免疫ＢＡＬＢｃ小鼠，观察其ＤＮＡ免疫所诱导的小鼠体液免疫反应和保护性作用。方法　大量制备质粒ＤＮＡ，肌肉注射免疫小鼠。ＥＬＩＳＡ测定ＩｇＧ抗体滴度；免疫鼠血液组织Ｐ３０基因ＰＣＲ扩增；弓形虫攻击感染。结果　用ＥＬＩＡＳ法检测的抗体ＩｇＧ滴度１∶２５６０，免疫后３周及６个月从免疫鼠血液组织中检测到Ｐ３０基因；攻击感染实验组的存活时间较对照时间延长（Ｐ＜００５），结论　重组质粒ｐｃＤＮＡ３－Ｐ３０免ＢＡＬＢｃ小鼠可诱导一定的体液免疫应答，对抗攻击感染具有一定的保护性。

关键词： DNA 弓形体病 p30基因免疫应答小鼠

编码弓形虫表面抗原p30基因的克隆及在***中的表达

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中国人兽共患病杂志 2003年第3期19卷 31-33页

作者：占国清吴少庭李国光高世同林敏郑春福十堰市人民医院肝病研究室深圳市疾病预防控制中心深圳518020 同济医科大学流行病学教研室重庆医科大学寄生虫学教研室

目的　构建编码弓形虫RH株表面抗原p30基因重组表达质粒 ,初步观察p30基因在E coli表达。方法　将p30基因定向克隆到分支杆菌 -大肠杆菌穿梭表达质粒热休克蛋白 70 (hsp70 )起动基因的下游的多克隆位点 ,构建重组表达质粒pBCG -p30 ;采... 详细信息

目的　构建编码弓形虫RH株表面抗原p30基因重组表达质粒 ,初步观察p30基因在E coli表达。方法　将p30基因定向克隆到分支杆菌 -大肠杆菌穿梭表达质粒热休克蛋白 70 (hsp70 )起动基因的下游的多克隆位点 ,构建重组表达质粒pBCG -p30 ;采用亚克隆技术 ,将含p30和hsp70起动基因的复合片段 ,插入表达载体 pBK -CMV质粒 ,转化大肠杆菌DH5α ,在卡那霉素阳性LB培养基平板筛选阳性重组子 ,并经双酶切及pCR扩增鉴定。重组质粒 pBK -p30转化大肠杆菌 ,IpTG诱导表达后进行SDS -pAGE和Westernboltting分析。结果　 1)阳性重组质粒 pBCG -p30、pBK -p30经酶切和pCR鉴定 ,与预期的结果相符合。 2 )序列测定证实克隆的基因为编码p30抗原的基因。 3)p30基因在大肠杆菌诱导表达后获得4 5kDa融合蛋白 ,此抗原未被弓形虫高免兔血清识别。结论　成功构建编码弓形虫表面抗原p30重组表达质粒 ,并在大肠杆菌中获得表达。

关键词：编码弓形虫表面抗原 p30基因克隆 E.coli 表达基因重组弓形虫

针对非洲猪瘟病毒p30基因CRISpR/Cas9基因编辑系统的构建和初步鉴定

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中国动物传染病学报 2023年第2期31卷 59-66页

作者：于海男崔帅王洋刘雪婷高新桃房立春郭晓宇朱鸿飞中国农业科学院北京畜牧兽医研究所北京100193 中国农业科学院生物技术研究所北京100181 山东省农业科学院家禽研究所济南250031

构建针对非洲猪瘟病毒(ASFV)p30(Cp204L)基因的CRISpR/Cas9基因编辑系统,探究该系统对p30蛋白真核表达的影响。以含p30基因序列的质粒p30-IRES为模板,定向扩增目的基因片段并克隆至pmCherry-N1载体,构建含有p30、红色荧光报告基因的融... 详细信息

构建针对非洲猪瘟病毒(ASFV)p30(Cp204L)基因的CRISpR/Cas9基因编辑系统,探究该系统对p30蛋白真核表达的影响。以含p30基因序列的质粒p30-IRES为模板,定向扩增目的基因片段并克隆至pmCherry-N1载体,构建含有p30、红色荧光报告基因的融合表达质粒;通过网站http://***/设计靶向Cp204L的单导向RNA(sgRNA),并克隆至Cas9表达质粒eSpCas9-2A-GFp(pX458)中。将融合表达质粒与Cas9表达质粒共转染HEK 293T细胞,同时设置对照组,转染48 h后通过Western blot和荧光定量pCR(qpCR)方法分别检测转染细胞中p30蛋白和mRNA表达水平。由于CRISpR/Cas9基因编辑系统靶向切割p30基因,Western blot和qpCR结果显示转染靶向p30基因的Cas9质粒后,p30蛋白的真核表达受到抑制,具有显著性差异(ppR/Cas9基因编辑系统可以高效切割非洲猪瘟p30基因,抑制该蛋白的真核表达水平,该体系为抑制病毒生长和疫情防控提供了新的研究思路。

关键词：非洲猪瘟病毒 p30基因 CRISpR/Cas9 单导向RNA 真核表达

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非洲猪瘟病毒p30基因纳米pCR检测方法的建立

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中国兽医科学 2022年第5期52卷 547-553页

作者：魏宇王海璐孙飞雁王楠孙亮程悦宁郭利中国农业科学院特产研究所农业农村部经济动物疫病重点实验室吉林长春130112 吉林农业大学中药材学院吉林长春130118 吉林省动物疫病预防控制中心吉林长春130000

为了建立准确、敏感的早期快速检测非洲猪瘟病毒(ASFV)的分子生物学方法,根据ASFV中p30蛋白在感染机体中早期表达的特点,设计出1对ASFV中p30基因保守序列的特异性引物,应用纳米pCR建立一种适用于早期检测ASFV的方法,并对其敏感性、特异... 详细信息

为了建立准确、敏感的早期快速检测非洲猪瘟病毒(ASFV)的分子生物学方法,根据ASFV中p30蛋白在感染机体中早期表达的特点,设计出1对ASFV中p30基因保守序列的特异性引物,应用纳米pCR建立一种适用于早期检测ASFV的方法,并对其敏感性、特异性和临床样品检测进行研究和分析。结果显示:该纳米pCR的最低检出限为2.47×10^(3)copies/μL,而普通pCR的最低检出限为2.47×10^(4)copies/μL,表明纳米pCR的敏感性是普通pCR的10倍;同时,与猪瘟病毒、猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征病毒、伪狂犬病病毒均未发生交叉反应。此外,分别应用所建立的ASFV p30基因纳米pCR和普通pCR对18份临床样品进行检测,纳米pCR的阳性率为33.33%,普通pCR的阳性率为22.22%。上述结果表明,建立的纳米pCR检测方法可以对早期感染ASFV的病猪进行快速临床检测,具有良好的敏感性和特异性,为非洲猪瘟的诊断和防控提供了一定的技术保障。

关键词：非洲猪瘟病毒 p30基因纳米pCR检测技术早期检测