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伤寒沙门菌线性质粒pBSSB1的p17基因的生物学功能分析

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生物技术通报 2014年第10期30卷 168-173页

作者：朱云霞吴佳龚明玉侯书宁张绮思陈敏洁张海方江苏大学基础医学与医学技术学院医学生物化学系镇江212013 苏州大学附属第二医院检验科苏州215004

H:z66阳性伤寒沙门菌含有一特有的介导鞭毛单向相变换的线性质粒pBSSB1,其上第17号基因(p17)编码一未知功能蛋白(p17)。利用λ-Red系统制备p17基因缺陷变异株,测定变异株和野生株的生长曲线,比较其生长差异,同时通过半固体LB培养基进行... 详细信息

H:z66阳性伤寒沙门菌含有一特有的介导鞭毛单向相变换的线性质粒pBSSB1,其上第17号基因(p17)编码一未知功能蛋白(p17)。利用λ-Red系统制备p17基因缺陷变异株,测定变异株和野生株的生长曲线,比较其生长差异,同时通过半固体LB培养基进行动力试验比较其动力差异。利用pCR技术扩增获得p17基因,构建其重组表达载体pET28a(+)-p17,通过镍柱纯化目的蛋白p17-His6,纯化后蛋白作为抗原免疫兔子以制备多克隆抗体。结果显示,制备了p17基因缺陷变异株,变异株的生长明显迟缓于野生株(ppET28a(+)-p17,纯化获得了高纯度的目的蛋白p17-His6并制得相应的多克隆抗体。

关键词：伤寒沙门菌线性质粒 pBSSB1 p17

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禽呼肠孤病毒p17蛋白在细胞中的定位与其诱导的自噬以及病毒复制相关

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禽呼肠孤病毒p17蛋白在细胞中的定位与其诱导的自噬以及病毒复制...

作者：李晨曦扬州大学

学位级别：硕士

禽呼肠孤病毒（avian reovirus, ARV）属于呼肠孤病毒科（Reoviridae）正呼肠孤病毒属（Orthoreovirus）,是禽类重要的病原体。病毒基因组是由10个节段的双链RNA组成,可分为大（L）、中（M）、小（S）3组,主要编码10种结构蛋白和4种非... 详细信息

禽呼肠孤病毒（avian reovirus, ARV）属于呼肠孤病毒科（Reoviridae）正呼肠孤病毒属（Orthoreovirus）,是禽类重要的病原体。病毒基因组是由10个节段的双链RNA组成,可分为大（L）、中（M）、小（S）3组,主要编码10种结构蛋白和4种非结构蛋白。其中,p17蛋白是由ARV S1基因第二个开放阅读框编码的非结构蛋白,包含146个氨基酸,大小约为17 kD。由先前的研究可知,p17是细胞核-细胞质穿梭蛋白,其C端有核输入信号。而p17在核质中的分配与细胞的转录活性有关,且出核并不依赖于CRM1蛋白。p17可以通过pTEN、AMpK和pKR/eIF2a信号通路正调控细胞自噬,并增强病毒的复制。在调控细胞周期和宿主细胞翻译方面,p17蛋白可以通过激活p53通路来阻碍细胞的生长。因此,p17蛋白是一种多功能病毒蛋白,它在调控细胞自噬、细胞周期以及蛋白翻译方面都起着重要的作用。尽管如此,目前对p17蛋白功能的研究仍然还存在许多未知的地方。本研究通过鉴定p17蛋白的核输入信号与核输出信号,并突变p17蛋白核输入信号相关的功能氨基酸位点后,探究p17蛋白的细胞定位对其诱导的细胞自噬的影响以及对病毒复制的影响。1.禽呼肠孤病毒p17蛋白核输入信号与核输出信号的鉴定本研究首先将p17蛋白基因插入真核表达载体pEGFp-C1中,在宿主细胞中表达融合蛋白GFp-p17,建立了绿色荧光蛋白标记的细胞定位的方法。所得结果也与文献报道中的p17蛋白定位一致,也于ARV感染后的间接免疫荧光实验一致,说明本方法可以用于p17蛋白定位的研究。同时,选取转染pEGFp-p17后的不同时间点（9h、18 h、24 h、36h、48 h）,观察p17蛋白在细胞中的分布情况。此外,也与p10、σNS另两个S基因组编码的非结构蛋白的定位进行了比较,结果也与p17蛋白在细胞中的定位不同。为鉴定p17的核输入信号,参考文献中报道的序列,并将该序列中以及周围存在的几个连续的碱性氨基酸进行突变,观察p17突变体的细胞定位情况。发现突变p17蛋白C端的第122和123位的氨基酸后,可使p17蛋白的核定位发生改变,观察到大部分荧光进入细胞质中,从而确定这两个氨基酸在p17蛋白的核定位中发挥着重要的作用。此外,p17是核质穿梭蛋白,目前的研究仅知道p17蛋白可以出核,且出核途径是CRM1蛋白非依赖的。本研究通过软件预测与序列比对,在p17蛋白的序列中找到多个疑似核输出信号的序列。将这些序列插入pEGFp-C1中进行表达鉴定,根据观察融合蛋白的表达情况后发现,在p17蛋白的N端第19-26位有一段氨基酸片段能使细胞核中大量的GFp进入细胞质,并认为它能够介导p17蛋白的出核,且这种出核可能是通过CRM1以外的其他途径。2.禽呼肠孤病毒p17蛋白核输入信号的突变调节细胞自噬与病毒的复制已有研究证实,p17可以诱导细胞产生自噬,但是对于p17调控细胞自噬的分子机制尚有待进一步的研究。本研究探讨了p17核输入信号对其引起细胞自噬及病毒复制的影响。为了研究p17蛋白的核定位与诱导细胞自噬的关系,构建了突变p17第122位和第123位的氨基酸的重组真核表达载体。在Vero细胞和DF1细胞中,表达p17核输入信号突变体短时间内的自噬水平均显著低于表达野生型p17的细胞。通过进一步检测p17入核对病毒增殖的影响,转染野生型p17再感染ARV后的病毒复制水平显著升高,说明p17可促进细胞自噬的同时促进病毒复制。而在感染病毒一定时间内,转染细胞p17入核信号突变体并不能明显的促进病毒的复制水平,与转染野生型p17的结果差异显著。

关键词：禽呼肠孤病毒 p17 核输入信号细胞自噬病毒复制

禽呼肠孤病毒非结构蛋白p17的宿主互作蛋白筛选及pRpS2功能的初步研究

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禽呼肠孤病毒非结构蛋白p17的宿主互作蛋白筛选及PRPS2功能的初步...

作者：赵富熙扬州大学

学位级别：硕士

禽呼肠孤病毒(avian reovirus,ARV)在鸡群中普遍存在,与病毒性关节炎/腱鞘炎、矮小综合征、慢性呼吸道疾病相关,并能导致免疫抑制,给养禽业造成严重的经济损失。p17是ARV编码的一种非结构蛋白,可诱导细胞自噬进而促进病毒增殖,与病毒的... 详细信息

禽呼肠孤病毒(avian reovirus,ARV)在鸡群中普遍存在,与病毒性关节炎/腱鞘炎、矮小综合征、慢性呼吸道疾病相关,并能导致免疫抑制,给养禽业造成严重的经济损失。p17是ARV编码的一种非结构蛋白,可诱导细胞自噬进而促进病毒增殖,与病毒的致病作用关系密切。本研究拟筛选与p17互作的宿主蛋白,探讨其与病毒复制的关系,为深入阐明ARV感染的致病机制奠定基础。1.与ARV p17互作的宿主蛋白筛选以ARV GX/2010/1株感染7日龄SpF鸡,每只鸡的感染量为104.3TCID50。7天后提取鸡肝组织总RNA,应用SmartTM技术构建ARV感染鸡肝组织cDNA文库,文库滴度为2.6×107cfu/mL。构建表达p17的重组诱饵质粒pGBKT7-p17,将其转化至酵母感受态细胞Y2H Gold中,检测显示该质粒无自激活活性并对酵母菌无毒性。利用酵母双杂交系统筛选,并经酵母回补验证,共得到9个与p17互作的宿主蛋白。经测序并与NCBI数据库比对,9个宿主蛋白分别为核糖磷酸焦磷酸激酶2(pRpS2)、γ-干扰素诱导蛋白16(IFI16)、聚谷氨酰胺结合蛋白1(pQBp1)、核仁GTp结合蛋白1(GTpBp4)、胰岛素样生长因子2 mRNA结合蛋白1(IGF2Bp1)、羧酸酯水解酶(CES1L2)、成纤维细胞生长因子1(FGF1)、3’-磷酸腺苷-5’-磷酸硫酸合酶(pApSS2)和钙黏蛋白-2(CDH2)。通过gene ontology(GO)通路注释分析,这9个与p17互作的宿主蛋白参与细胞代谢过程及具有催化活性。其中,pRpS2参与嘌呤代谢和蛋白质的合成,并与抑制细胞增殖、阻滞细胞周期和引发细胞凋亡等密切相关。2.pRpS2与p17互作的鉴定及其对ARV复制的影响本研究进一步验证pRpS2与p17的相互作用并探究pRpS2对病毒复制的影响。分别构建重组质粒pcDNA-Myc-p17和pcDNA-Flag-pRpS2,共转染DF-1细胞,经间接免疫荧光试验,于激光共聚焦显微镜观察发现p17与pRpS2在细胞内具有共定位现象;通过免疫共沉淀检测,pRpS2与p17在细胞内具有相互作用;构建pEGX-6p-1-p17原核表达载体,通过GST pull-down证明p17与pRpS2在细胞外也能够相互结合。ARV感染DF-1细胞,经q-pCR检测在不同时间点pRpS2的mRNA表达水平,发现pRpS2在ARV感染早期表达水平显著上调,推测pRpS2可能参与病毒的增殖过程。将质粒pcDNA-Flag-pRpS2和空白载体pcDNA3.1分别转染DF-1细胞,再感染ARV病毒,分别在感染后不同时间点收集细胞总RNA和蛋白样品。经q-pCR检测发现,过表达pRpS2细胞在ARV感染24 h时病毒复制水平达到峰值,比空载体组感染病毒细胞提高了约30%。同样,我们观察到在过表达pRpS2的情况下,ARV p17蛋白的表达量也显著增加。结果表明,过表达pRpS2能显著促进ARV复制。利用si RNA技术敲低pRpS2表达,q-pCR检测显示si-pRpS-1和si-pRpS-2均能显著下调pRpS2的mRNA转录水平。在DF-1细胞中分别转染si-pRpS2-1、si-pRpS-2和Nc-si RNA,再感染ARV,分别在不同时间点收集细胞总RNA和蛋白样品。经q-pCR检测发现,在ARV感染6 h、12 h和24 h三个时间点,敲低pRpS2表达可使得ARV复制水平显著下降,并且敲低pRpS2可导致p17蛋白水平明显降低。结果表明,敲低pRpS2可显著抑制ARV的复制。综上所述,本研究首次发现并证实宿主pRpS2蛋白与ARV p17非结构蛋白之间存在相互作用,并且pRpS2对ARV的增殖具有正向调控作用。

关键词：禽呼肠孤病毒 p17 pRpS2 相互作用病毒复制

靶向HSp60的金纳米颗粒及其对乳腺癌肿瘤细胞的光热杀伤作用研究

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靶向HSP60的金纳米颗粒及其对乳腺癌肿瘤细胞的光热杀伤作用研究

作者：孙博北京协和医学院

学位级别：硕士

目的:乳腺癌已超过肺癌成为全球最常见的癌症,且患者年龄趋于年轻化,但是,在治疗上仍亟需研发更为有效的治疗方法,提高患者生存率。根据分子分型,乳腺癌可分为以下四种:LuminalA型、LuminalB型、HER-2过表达型和三阴性乳腺癌。目前,乳... 详细信息

目的:乳腺癌已超过肺癌成为全球最常见的癌症,且患者年龄趋于年轻化,但是,在治疗上仍亟需研发更为有效的治疗方法,提高患者生存率。根据分子分型,乳腺癌可分为以下四种:LuminalA型、LuminalB型、HER-2过表达型和三阴性乳腺癌。目前,乳腺癌的治疗方法主要有:手术、放疗、化疗、内分泌治疗（针对表达雌激素受体（ER）和孕激素受体（pR）的乳腺癌）和靶向治疗（抗HER-2治疗）。三阴性乳腺癌由于其表面雌激素受体、孕激素受体和HER2均低表达,因而缺乏有效的靶向药物。开发三阴性乳腺癌的潜在治疗靶点具有重要的科学研究意义和临床应用价值。热休克蛋白60（Heat Shock protein 60,HSp60）是一种重要的分子伴侣,属于热休克蛋白（Heat Shock protein,HSp）家族,存在于所有的原核生物和真核生物的线粒体、高尔基体、细胞质和细胞膜上。HSp60在肿瘤发生中能够抑制线粒体凋亡,并且促进肿瘤组织中的血管生成和癌症转移。越来越多的研究表明,HSp60在乳腺癌组织或细胞中的含量显著高于正常的组织或细胞。从正常乳腺上皮细胞到原位导管癌再到侵袭性乳腺癌,HSp60的含量逐渐增加。这表明,HSp60可能成为乳腺癌的诊断标志物或潜在的治疗靶点。所在实验室前期研发出了一种能够与HSp60特异性结合的多肽（命名为p17）。本研究拟将此靶向多肽与金纳米颗粒（Gold nanoparticles,AuNps）相结合,构建光热治疗用靶向金纳米颗粒,在小鼠三阴性乳腺癌细胞株4T1细胞上研究其光热杀伤效果。金纳米颗粒作为光热转换剂具有光热转换效率高的优势,同时它的生物相容性好,表面易于修饰;而光热疗法具有高选择性和低副作用的优点,是一种新的肿瘤治疗方法。方法:首先,使用柠檬酸钠还原氯金酸HAuCl4制备AuNp;使用透射电子显微镜（Transmission Electron Microscope,TEM）对 AuNp 的形貌进行表征。使用人工合成多肽p17修饰AuNp,制备得到连接了 p17的AuNp（AuNp-p17）,通过紫外-可见-近红外吸收光谱（UV-vis-NIR spectroscopy）获得AuNp-p1 7的特征光谱;通过动态光散射方法（Dynamic Light Scattering,DLS）检测AuNp-p17的粒径和Zeta电势。使用流式细胞术检测小鼠乳腺癌细胞株4T1细胞表面和细胞内的HSp60的表达、p17与4T1细胞的结合。使用倒置显微镜观察AuNp和AuNp-p17被4T1细胞的摄取情况。使用便携式热电偶温度计测定4T1细胞与AuNp或AuNp-p17孵育24 h后经激光照射2或4 min的温度。采用CCK-8试剂盒测定不同浓度p17、AuNp和AuNp-p17在光照前后对4T1细胞活性的影响。结果:AuNp呈颗粒状,大小均匀,并且分散性好;在528 nm左右具有经典SpR单峰。当与p17共孵育后,随p17浓度的增加,AuNp的SpR吸收峰强度有所降低,且长波处吸收值抬高,表明p17连接到AuNp上。DLS结果显示,AuNp表面连接p17后,平均粒径随着p17比例增加而增大,从（51.8±0.1）nm变为（52.1± 2.2）、（60.8±1.9）和（64.5 ± 2.5）nm。Zeta电势从（-29.3± 0.3）mV变为（-29.6±0.6）、（-26.4±0.4）和（-26.9±2.5）mV。流式细胞术结果显示,在4T1细胞膜和细胞内均有HSp60表达。p17能够与4T1细胞膜上和细胞内HSp60有效结合。细胞活性实验结果表明,p17在20μM范围以下对4T1细胞的活性几乎没有影响;与此同时,在金原子浓度不超过100μg/mL浓度下,AuNp或AuNp-p17对4T1细胞的活性均无显著影响。这些结果说明,p17、AuNp和AuNp-p17本身具有良好的生物相容性。倒置显微镜观察结果显示,在两种纳米颗粒与4T1细胞共孵育4、6或8h时,AuNp处理组与对照组相比,细胞颜色无明显变化,表明AuNp与4T1细胞的结合不明显;而AuNp-p17处理组的细胞中可见金纳米颗粒的红色,说明AuNp-p17与4T1细胞的结合非常明显,p17促进了4T1细胞对金纳米颗粒的摄取,表明AuNp-p17具有靶向性。当4T1细胞在与AuNp和AuNp-p17共孵育后,被激光照射时其培养基温度发生变化,AuNp-p17处理组在激光照射4分钟后,培养基的温度从（22.9±0.4）℃升高到（52.0±3.9）℃;对于AuNp处理组,细胞培养基的温度只升高到（47.2±0.6）℃,而对照组仅升温到（38.2±2.4）℃。细胞活性检测结果显示,在激光照射2分钟时,AuNp、AuNp-p17处理组的细胞活性与对照组相比,无显著性变化。当激光照射4分钟后,AuNp-p17处理组细胞的相对活性降低到（1.3±2.8）%,AuNp处

关键词： HSp60 金纳米颗粒光热治疗 p17 4T1细胞

取向硅钢p17和B10的定量影响规律及机理的探讨

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武钢技术 1987年第1期 44-52页

作者：计甫祥硅钢片厂工程师

一、前言冷轧取向硅钢片生产工艺复杂,影响因素比较多。武钢自1979年试炼以硫化锰为有利夹杂的取向硅钢片以来,现在已能全部采用公司自炼料生产取向硅钢片。为了定量研究在大生产条件下的冶炼成份、热轧条件以及冷轧过程中的有关参数对... 详细信息

一、前言冷轧取向硅钢片生产工艺复杂,影响因素比较多。武钢自1979年试炼以硫化锰为有利夹杂的取向硅钢片以来,现在已能全部采用公司自炼料生产取向硅钢片。为了定量研究在大生产条件下的冶炼成份、热轧条件以及冷轧过程中的有关参数对取向硅钢片的p17和B10的影响规律,用以指导工艺参数的调整,进一步提高取向钢的磁性,稳定产品质量,我们随机收集了1985年生产的50炉武钢自炼二次冷轧取向硅钢片（Q112B）的

关键词：取向硅钢磁性有利夹杂二次再结晶次级再结晶 p17 B10 脱碳退火原始碳量

鄂尔多斯20+10(T10地块及p17地块)

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城市环境设计 2017年第3期 234-239页

作者：汤桦贾璇

鄂尔多斯20+10项目是一次集群设计,用地范围约120ha,为不规则狭长地块。其长边约3km,宽边约400m。项目为西北至东南走向,西南侧为排洪沟,名为昆独龙川,东北侧为规划的城市主干道。基地从城市干道方向开始向排洪沟方向的地势呈下坡走向,... 详细信息

鄂尔多斯20+10项目是一次集群设计,用地范围约120ha,为不规则狭长地块。其长边约3km,宽边约400m。项目为西北至东南走向,西南侧为排洪沟,名为昆独龙川,东北侧为规划的城市主干道。基地从城市干道方向开始向排洪沟方向的地势呈下坡走向,高差约30m,靠近排洪沟的一侧坡度较为平缓,而靠近道路一侧则较陡,呈丘陵地貌地势的复杂多变。项目规划总平面将用地分成60块办公用地,按照地形不同,用地分为"山顶"地形,"山坡"地形及"平滩"地形三种类型。该方案设计的地块有两个,T10地块属于

关键词：地块传统院落 p17 T10 鄂尔多斯

αB-晶体蛋白对乳鼠心肌细胞在缺氧/复氧条件下的表达及保护作用的实验研究

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中国城乡企业卫生 2010年第3期25卷 92-94页

作者：李立宇王林天津医科大学第二医院急诊科 300211 天津医科大学第二医院心脏科 300211

目的研究在缺氧/复氧条件下随着缺氧时间延长αB-晶体蛋白对原代培养心肌细胞中caspase-3的影响。方法以阳离子脂质体(LipofectamineTM2000)介导,将原代培养SD大鼠乳鼠心肌细胞分为转染组(转染pEGFp-αB-crystallin-C3)、空载组(转染pEG... 详细信息

目的研究在缺氧/复氧条件下随着缺氧时间延长αB-晶体蛋白对原代培养心肌细胞中caspase-3的影响。方法以阳离子脂质体(LipofectamineTM2000)介导,将原代培养SD大鼠乳鼠心肌细胞分为转染组(转染pEGFp-αB-crystallin-C3)、空载组(转染pEGFp-C3)和空白组(无任何质粒转染),转染后分别缺氧培养6、12、18h后复氧12h,Western Blot半定量检测αB-晶体蛋白和caspase-3活化产物p17表达。结果转染组心肌细胞αB-晶体蛋白表达有下降趋势,但差异无显著性(p>0.05);转染组p17与空白组和空载组比较,明显降低(pp>0.05);在缺氧12h后,各组p17表达量趋于平稳。结论在缺氧/复氧条件下,αB-晶体蛋白可能具有抑制caspase-3活化,抗细胞凋亡作用;在缺氧6～18h内,随着缺氧时间延长,αB-晶体蛋白抑制caspase-3活化的作用虽有下降趋势,但基本相对稳定。

关键词： αB-晶体蛋白凋亡 caspase-3 心肌细胞 p17

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