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羟基喜树碱对人增生性瘢痕成纤维细胞p-smad3表达影响和兔耳增生性瘢痕作用的实验研究

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羟基喜树碱对人增生性瘢痕成纤维细胞P-Smad3表达影响和兔耳增生...

作者：余冬平南昌大学

学位级别：硕士

病理性瘢痕的防治是烧伤整形科的一个难题。目前治疗病理性瘢痕的方法有很多,主要有手术、药物、放射、冷冻、压力等,这些治疗方法虽然取得了一定的试验或临床治疗效果,但远期疗效、满意度远远没有达到患者要求的程度,甚至一些治疗方法... 详细信息

病理性瘢痕的防治是烧伤整形科的一个难题。目前治疗病理性瘢痕的方法有很多,主要有手术、药物、放射、冷冻、压力等,这些治疗方法虽然取得了一定的试验或临床治疗效果,但远期疗效、满意度远远没有达到患者要求的程度,甚至一些治疗方法可以产生严重的并发症,这也给病理性瘢痕的治疗带来了更大的阻力,因此研究一种安全有效、方便可靠的治疗方法仍是广大医务工作者的艰难任务。至今,病理性瘢痕的治疗仍未取得突破性的进展,和病理性瘢痕发生、发展、转归的机制研究发展较慢密切相关。病理性瘢痕是人体对创伤产生过度愈合反应的结果,主要包括增生性瘢痕（hypertrophic scar, HS）和瘢痕疙瘩（keloid, K）,它们都以成纤维细胞（fibroblast, FB）的大量增殖和细胞外基质（Extracellular matrix, ECM）的过度沉积为特征。目前对病理性瘢痕的研究主要从成纤维细胞、组织胶原、细胞生长因子、基因研究、动物瘢痕模型等方面进行,以期待了解病理性瘢痕的形成机制,从而为临床防治病理性瘢痕提供科学的理论依据。目的：拟通过羟基喜树碱（hydroxycamptothecin, HCpT）对人增生性瘢痕成纤维细胞进行培养干预,检测成纤维细胞p-smad3mRNA及蛋白,以期了解TGF-β/smad信号转导通路中信号介导子smad3在增生性瘢痕发病机制中的作用。同时,应用羟基喜树碱局部注射兔耳增生性瘢痕模型,证实其对增生性瘢痕的治疗作用,进一步了解其防治机制,为临床研究提供可靠的理论依据。方法：1、人增生性瘢痕标本取自本院整形科患者,采用改进组织块培养法体外培养成纤维细胞后,分为：空白对照组及实验组。空白对照组,细胞仅加入成纤维细胞培养基;实验组：细胞加入成纤维细胞培养基和不同浓度羟基喜树碱,药物浓度分别为125、250、500ng/ml三个浓度,作用培养24小时。采用逆转录-聚合酶链反应（RT-pCR法）检测p-smad3mRNA表达,蛋白印迹法（Western-blot）法检测p-smad3蛋白表达。2、新西兰大白兔25只,双侧兔耳腹侧面制作增生性瘢痕动物模型。待瘢痕形成后随机分为4组。分别于瘢痕基底部及瘢痕内注射羟基喜树碱或生理盐水,注射总用量为60μl。A组：生理盐水,B组：1.25mg/ml,C组：2.5 mg/ml,D组：5 mg/ml。每组用药：一次/3天。继续喂养4周。分别于注药后2、4周切取瘢痕组织做HE染色,免疫组化测Bcl-2、增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen,pCNA）表达,Western-blot检测Cx43蛋白的表达。结果：1、各浓度HpCT作用24小时后p-smad3mRNA表达水平光密度比值为：500 ng/ml组（157.66±14.39）,250 ng/ml组（235.75±20.82）,125 ng/ml组（321.644±29.26）,空白组（398.23±35.45）,各组差异有统计学意义（p＜0.05）;p-smad3蛋白表达水平光密度比值两两比较也有差异（p＜0.05）。实验结果表明,各浓度（125、250、500ng/mL）HCpT作用后增生性瘢痕成纤维细胞p-smad3mRNA及蛋白表达均降低。其中,500ng/mL浓度组抑表达作用最强。2、2.5mg/ml组（C组）、5.0mg/ml组（D组）在注药2、4周时较对照组（A组）、1.25mg/ml组（B组）瘢痕颜色变浅,体积减小,质地变软,胶原少而齐整,与注药时间正相关;C组、D组与A组、B组两两间比较瘢痕增生指数、成纤维细胞数差异有统计学意义（p＜0.01）;1.25mg/ml组与对照组比较无明显差异（p＞0.01）。pCNA、Bcl-2阳性表达率：C组、D组在注药2、4周时与对照组、1.25mg/ml组两两间差异有统计学意义（p＜0.01）,B组与对照组比较无明显差异（p＞0.01）。Cx43蛋白表达水平光密度比值：C组（157.46±17.55）、D组（193.68±±18.35）与A组（120.12±12.36）、B组（126.37±13.86）,两两比较差异有统计学意义（p＜0.01）;B组与对照组对比无明显差异（p＞0.01）。结论：1、羟基喜树碱对人增生性瘢痕成纤维细胞p-smad3mRNA及蛋白表达有明显的抑制作用,对防治增生性瘢痕有一定意义。2、羟基喜树碱能够抑制兔耳瘢痕的增生,机理可能是减少pCNA、Bcl-2和增加Cx43的表达,从而减少成纤维细胞增殖,促进其凋亡,增加细胞间缝隙连接通讯,这又为临床应用羟基喜树碱治疗增生性瘢痕提供了科学依据。

关键词：羟基喜树碱增生性瘢痕成纤维细胞 p-smad3 兔耳

补肾调冲法对肾虚排卵障碍型不孕大鼠卵巢smad3、p-smad3表达水平影响研究

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补肾调冲法对肾虚排卵障碍型不孕大鼠卵巢Smad3、P-Smad3表达水平...

作者：黄昕成都中医药大学

学位级别：硕士

目的：在前期实验研究的基础上,进一步研究以“补肾调冲法”立法的通脉大生片对大鼠卵巢TGF-β/smads信号转导通路的调控作用,探索中医补肾调冲法促卵泡发育的机制,从而为补肾调冲法治疗肾虚排卵障碍型不孕提供科学依据。方法：选取9日... 详细信息

目的：在前期实验研究的基础上,进一步研究以“补肾调冲法”立法的通脉大生片对大鼠卵巢TGF-β/smads信号转导通路的调控作用,探索中医补肾调冲法促卵泡发育的机制,从而为补肾调冲法治疗肾虚排卵障碍型不孕提供科学依据。方法：选取9日龄SD大鼠,通过给予颈背部皮下注射丙酸睾酮,建立肾虚排卵障碍型不孕大鼠(ASR)模型,根据大鼠阴道脱落细胞涂片的表现,筛选出造模成功的大鼠,随机分为七个组,分别为模型组、通脉大生片高剂量组(简称通高组)、通脉大生片中剂量组(简称通中组)、通脉大生片低剂量组(简称通低组)、来曲唑组(LE)、右归丸组、正常组,于大鼠第80日龄,分别给予相应药物进行干预,连续干预5周后股动脉取血并处死动物,迅速剥离大鼠卵巢,每组选取三只大鼠的卵巢组织,立即置于Eppendorf管中,储存于液氮中以备检测。采用免疫印迹法,检测各组大鼠卵巢smad3及p-smad3的表达水平。结果：1、与模型组相比,正常组、通高组、通中组、来曲唑组大鼠卵巢smad3的表达水平较高,差异有显著意义(psmad3水平亦有所升高,差异有统计学意义(psmad3水平的效果明显高于通低组。2、与模型组相比,正常组、通高组、来曲唑组、右归丸组大鼠卵巢p-smad3的表达水平较高,差异有显著意义(pp-smad3水平亦有所升高,差异有统计学意义(pp-smad3水平的效果明显高于通中组、通低组。结论：1、成功复制了采用皮下注射丙酸睾酮法制造肾虚排卵障碍型不孕大鼠(ASR)模型。2、通脉大生片能提高肾虚排卵障碍型不孕大鼠smad3及p-smad3的表达水平,进而改善卵巢局部的微环境。3、通脉大生片通过对卵巢局部因子smad3及p-smad3的调控以促进卵泡的生长、发育和成熟卵泡破裂及卵子的排出。4、说明中医补肾调冲法治疗肾虚排卵障碍型不孕可以通过调控卵巢局部因子来实现,特别是通过对卵巢TGF-β/smads信号通路的调控。

关键词：补肾调冲法肾虚排卵障碍 smad3 p-smad3 通脉大生片

TGF-β1介导的smad3与p38MApK在绒癌JEG-3细胞中的串话作用

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TGF-β1介导的Smad3与p38MAPK在绒癌JEG-3细胞中的串话作用

作者：谭宇思承德医学院

学位级别：硕士

绒毛膜癌是一种高度恶性滋养细胞肿瘤，起源于培养滋养层，可能发生于流产之后，或异位妊娠过程中。绒癌可通过静脉和淋巴系统广泛地转移到其他器官或组织中。早期血液和淋巴结转移可导致患者迅速死亡。近年来转化生长因子β(transformi... 详细信息

绒毛膜癌是一种高度恶性滋养细胞肿瘤，起源于培养滋养层，可能发生于流产之后，或异位妊娠过程中。绒癌可通过静脉和淋巴系统广泛地转移到其他器官或组织中。早期血液和淋巴结转移可导致患者迅速死亡。近年来转化生长因子β(transforming growth factor-β，TGFβ)成为肿瘤研究的热点因子之一，并且它在绒癌的发生和发展中是一个关键因素。转化生长因子β（TGFβ）是一种具有多生物学活性功能的多肽类细胞因子，TGFβ至少有5种异构体（TGF-β1～5），其中TGF-β1是主要存在形式，几乎所有的细胞都能分泌TGF-β1。它可以调节细胞增殖、分化、促进细胞外基质(ECM)形成，参与胚胎发育调节等，并且其与肿瘤的发生发展密切相关。TGFβ/smads信号转导通路主要由细胞膜表面的TGFβ受体及其下游胞质内smad蛋白家族组成。TGFβ首先识别并与细胞膜表面的受体结合，受体复合物再激活其下游的蛋白smad2、3，使其磷酸化。被激活的smad2、3与smad4结合，形成复合物，然后进入细胞核与核内的各类转录因子结合，调控靶基因的转录。近年来p38丝裂素活化蛋白激酶（p38mitogen-activated protein kinase,p38MApK）在肿瘤的侵袭转移的研究中也成为热点之一，并且有报道显示TGFβ可激活p38MApK通路，在胃癌和大鼠心肌成纤维细胞中两个通路有交互作用，但在绒毛膜癌中TGFβ与p38MApK通路相互作用的关键位点及其机制尚不明确，因此本实验拟应用TGF-β1受体阻滞剂及p38MApK抑制因子对被TGF-β1刺激活化的绒癌JEG-3细胞进行干预，对两条通路的下游蛋白进行检测以揭示两条信号通路在绒毛膜癌中交互作用的位点和作用机制。目的：探讨TGF-β1介导的smad3与p38MApK在绒癌JEG-3细胞中的串话作用。方法：1.人绒癌细胞系JEG-3生长在含10%的胎牛血清，2mmol/L谷氨酰胺，1mmol/L丙酮酸钠，100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的RpMI-1640培养基中，置于37℃，5%CO2培养箱中培养，每2-3d换液一次。当细胞长至70-80%左右时用0.02%EDTA和0.25%胰酶消化液按1:3的比例进行传代。2.JEG-3细胞以初始浓度为5×104个/mL接种于24孔板，置于37℃，5%CO2培养箱中培养，次日换以无血清的RpMI-1640饥饿培养12h。将细胞分为空白对照组，2h TGF-β1刺激组，6h TGF-β1刺激组。培养终止前2h和6h分别给予不同组细胞5ng/ml的TGF-β1刺激，空白对照组除外。每组设置3个复孔，用免疫荧光染色法对p-smad的表达及核转位情况进行检测。3. JEG-3细胞以初始浓度为5×104个/mL接种于6孔板，置于37℃，5%CO2培养箱中培养，次日换以无血清的RpMI-1640饥饿培养12h。将细胞分组设置为6个组，分别为：空白对照组，TGF-β1刺激组，p38抑制剂（SB203580）1μM组，p38抑制剂（SB203580）3μM组， TGF-β1受体阻滞剂（LY364947）1μM组，TGF-β1受体阻滞剂（LY364947）3μM组。培养终止前4h分别给予各抑制剂组细胞相应浓度的TGF-β1受体阻滞剂（LY364947）及p38抑制剂（SB203580）。在终止培养前2h，给予各组细胞5ng/ml的TGF-β1刺激，空白对照组除外。用免疫印迹法检测各组细胞中smad3以及p-smad3的蛋白表达水平。4. JEG-3细胞以初始浓度为5×104个/mL接种于6孔板，置于37℃，5%CO2培养箱中培养，次日换以无血清的RpMI-1640饥饿培养12h。将细胞分组设置为6个组，分组情况如上所述。培养终止前4h分别给予各抑制剂组细胞相应浓度的TGF-β1受体阻滞剂（LY364947）及p38抑制因子（SB203580）。在终止培养前2h，给予各组细胞5ng/ml的TGF-β1刺激，空白对照组除外。用实时定量pCR法检测smad3的mRNA表达水平。结果：1.在对照组中，p-smad的表达成云雾状主要呈现在胞浆中，少量表达在细胞核。TGF-β1给予2h后，p-smad3呈现胞浆胞核均表达。在TGF-β1给予6h后，p-smad3主要表达在胞核，即TGF-β1给予6h，p-smad3基本完成了由胞浆到胞核的核转位过程。2．与空白对照组相比，TGF-β1刺激组的smad3，p-smad3蛋白表达增高(p364947）1μM组，TGF-β1受体阻滞剂（LY364947）3μM组中随TGF-β1受体阻滞剂浓度的升高，smad3，p-smad3的蛋白表达呈浓度依赖性降低(pp3

关键词：转化生长因子β1 p38丝裂素活化蛋白激酶 smad3 p-smad3 绒毛膜细胞癌

软皮汤对硬皮病小鼠模型皮肤组织中p-smad3、FLI1因子表达的影响

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湖南中医药大学学报 2014年第9期34卷 19-22,65页

作者：齐庆李永贤陈英杰李东海朱珂查旭山广州中医药大学第一临床医学院第一附属医院皮肤科广东广州510405 广州中医药大学第一临床医学院 2009级本科班广东广州510405

目的前期研究显示软皮汤能改善硬皮病小鼠疾病模型皮肤纤维化程度,本研究进一步探讨软皮汤对纤维化重要通路TGF-β途径的活化因子smad3和抑制因子FLI1的影响。方法构建硬皮病小鼠疾病模型,采用Masson三色染色皮肤组织,Western Blot法检... 详细信息

目的前期研究显示软皮汤能改善硬皮病小鼠疾病模型皮肤纤维化程度,本研究进一步探讨软皮汤对纤维化重要通路TGF-β途径的活化因子smad3和抑制因子FLI1的影响。方法构建硬皮病小鼠疾病模型,采用Masson三色染色皮肤组织,Western Blot法检测皮肤CollagenⅠ、Fibronectin、p-smad3和FLI1表达水平。结果 (1)Masson染色结果显示,模型对照组动物皮肤中胶原纤维含量明显高于正常对照组(pp-smad3的表达水平高于正常对照组,而FLI1的表达则低于正常对照组(pp0.05);软皮汤处理组小鼠皮肤中CollagenⅠ、Fibronectin、p-smad3的表达水平低于模型对照组,而FLI1的表达则高于模型对照组(pp-smad3、上调抑制因子FLI1有关。

关键词：硬皮病软皮汤小鼠皮肤组织 p-smad3 FLI1

MEBT/MEBO对糖尿病足创面TGF-β1、p-smad3表达的调控

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MEBT/MEBO对糖尿病足创面TGF-β1、P-smad3表达的调控

护卵汤对慢性应激超排卵小鼠卵巢TGF-β1,p-smad3及FSHR mRNA表达的影响

2016年中华中医药学会外科分会学术年会

作者：唐乾利李利青李辉曾鸿孟王澍刘明郭满赵曦右江民族医学院/桂西高发病防治重点实验室湖南中医药大学广西中医药大学

目的观察皮肤原位再生医疗技术(Moist exposed burn therapy/Moist exposed burn ointment,MEBT/MEBO)对大鼠糖尿病足创面TGF-β1、p-smad3表达的调控作用。方法100只SD大鼠随机分为糖尿病足造模组(80只)与空白对照组(20只),从糖尿病足... 详细信息

目的观察皮肤原位再生医疗技术(Moist exposed burn therapy/Moist exposed burn ointment,MEBT/MEBO)对大鼠糖尿病足创面TGF-β1、p-smad3表达的调控作用。方法100只SD大鼠随机分为糖尿病足造模组(80只)与空白对照组(20只),从糖尿病足造模组成功造模大鼠中取60只,随机分为模型组、贝复济组及MEBO组,各20只。于用药第5天、14天,各取相同部位创面组织,采用Western blotting技术检测TGF-β1、smad3、p-smad3(磷酸化smad3)蛋白表达水平。结果四组大鼠smad3蛋白表达差异无统计学意义(p>0.05);MEBO组与贝复济组TGF-β1、p-smad3蛋白表达无差异(p>0.05),均低于空白对照组、高于模型组(ppp-smad3表达量下降,差异具有统计学意义(pp-smad3蛋白的表达,促进创面损伤修复;而在创面修复后期,MEBT/MEBO可能通过下调创面TGF-β1、p-smad3蛋白的表达,减少瘢痕愈合。

关键词：糖尿病足皮肤原位再生医疗技术 TGF-β1 p-smad3

来源： cnki会议评论

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cnki会议

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湖南中医药大学学报 2017年第11期37卷 1192-1195页

作者：刘碧源申可佳申奏秦旋付灵梅熊桀湖南中医药大学湖南长沙410208

目的观察护卵汤对慢性应激超排卵小鼠卵巢转化生长因子-β1(transforming growth factor beta 1,TGF-β1)、信号蛋白p-smad3及卵泡刺激素受体(follicle-stimulating hormone receptor,FSHR)mRNA表达的影响。方法建立慢性应激小鼠模型,造模成功后,随机分为模型组、护卵汤组和生长激素组,另设正常组。在超排卵第3天和注射绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin,HCG)24 h后,检测各组卵巢TGF-β1、p-smad3及FSHR mRNA表达。结果与模型组比较,在超排卵第3天,护卵汤组和生长激素组TGF-β1、p-smad3及FSHR mRNA表达均显著升高(pppsmads信号通路,发挥促进卵泡发育和改善卵巢功能的作用。

关键词：护卵汤慢性应激超排卵卵巢转化生长因子-β1 p-smad3 卵泡刺激素受体

TGF-β/smad信号通路在类风湿性关节炎相关的间质性肺纤维化小鼠中的作用

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中国药理学通报 2023年第3期39卷 483-488页

作者：付蓓蓓陆雨琳陈萌檬鲍兰馨刘楠楠叶静陈晓宇安徽医科大学基础医学院安徽合肥230032 安徽医科大学临床医学系安徽合肥230032 安徽医科大学第二附属医院呼吸内科安徽合肥230601

目的研究TGF-β/smad信号通路在类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis,RA)相关的间质性后肺纤维化小鼠中的作用。方法通过小鼠尾根部皮下给药完全弗氏佐剂(complete Freund′s adjuvant,CFA)与鸡Ⅱ型胶原蛋白(chickenⅡcollagen,Col-Ⅱ)... 详细信息

目的研究TGF-β/smad信号通路在类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis,RA)相关的间质性后肺纤维化小鼠中的作用。方法通过小鼠尾根部皮下给药完全弗氏佐剂(complete Freund′s adjuvant,CFA)与鸡Ⅱ型胶原蛋白(chickenⅡcollagen,Col-Ⅱ),构建RA小鼠模型。空白组给等量蒸馏水,对照组给等量冰醋酸(溶媒)。监测小鼠足趾肿胀程度(关节肿胀度与关节炎指数)评价小鼠建模情况;通过HE、Masson染色观察小鼠肺组织病理变化;免疫组化法观察肺间质细胞的胞质中TGF-β表达;采用化学发光法测量肺组织中羟脯氨酸水平;Western blot检测肺组织中smad2、smad3及p-smad2、p-smad3蛋白表达。结果与空白组、溶媒组相比,模型组小鼠关节肿胀、关节炎指数明显升高;给药21 d后,HE染色显示模型组肺间质有炎性改变,Masson染色显示模型组小鼠肺间质胶原纤维沉积,免疫组化染色显示模型组小鼠肺间质细胞的胞质中TGF-β表达升高,呈棕黄色;同时,与空白组、溶媒组相比,模型组肺组织匀浆显示羟脯氨酸表达明显升高;且进一步Western blot研究发现,与空白组、溶媒组相比,p-smad2与p-smad3在模型组中表达明显升高(ppp-smad2与p-smad3表达上调,在肺纤维化和RA相关的间质性后肺纤维化中起重要作用。

关键词：类风湿性关节炎间质性肺病肺纤维化 TGF-β/smad信号通路 p-smad2 p-smad3

补中益气汤对慢性间歇性低氧诱发的小鼠肺间质纤维化的作用

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中国应用生理学杂志 2022年第5期38卷 559-564页

作者：唐毅刘兵兵陈琦李亭亭吉恩生李杰茹河北中医学院生理学教研室石家庄050200 河北省中医药结合氢医学技术创新中心石家庄050091

目的:观察慢性间歇性低氧(CIH)对小鼠肺组织转化生长因子-β(TGF-β)、p-samd3和血清层粘连蛋白(LN)、透明质酸(HA)、表达的影响以及补中益气汤对CIH小鼠肺间质沉积损害的干预作用。方法:随机将50只SpF级C57BL小鼠分为5组(n=10):空白对... 详细信息

目的:观察慢性间歇性低氧(CIH)对小鼠肺组织转化生长因子-β(TGF-β)、p-samd3和血清层粘连蛋白(LN)、透明质酸(HA)、表达的影响以及补中益气汤对CIH小鼠肺间质沉积损害的干预作用。方法:随机将50只SpF级C57BL小鼠分为5组(n=10):空白对照组、CIH模型组、CIH+低、中、高剂量补中益气汤组。分别置于常氧或CIH条件下,中药组给予对应剂量药物。在第35日无创肺功能检测后处死。HE染色评估病理学改变,Masson染色行胶原沉积评估;Western blot法检测TGF-β1、p-smad3等通道蛋白和下游α-SMA、Collagen I的蛋白表达水平;ELISA法检测血清中TGF-β1、LN、HA的质量浓度。结果:HE染色显示,CIH小鼠肺泡塌陷,肺间隔增厚,上皮细胞坏死;Masson显示,CIH小鼠肺间质大量胶原纤维增生、沉积,而补中益气汤干预组肺组织上述改变较CIH模型组明显减轻。CIH模型组肺组织中TGF-β1、p-smad3及Collagen I、CollagenⅢ、α-SMA蛋白表达水平与空白对照组相比明显上调(ppp-smad3、Collagen I蛋白及SMA-α的表达水平相较于CIH组有明显下调(psmads信号通路的相关蛋白表达有关。

关键词：慢性间歇性低氧补中益气汤肺间质纤维化 TGF-β1 p-smad3 Ⅰ型胶原小鼠

达格列净对慢性睡眠剥夺小鼠心血管功能的保护作用及机制研究

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达格列净对慢性睡眠剥夺小鼠心血管功能的保护作用及机制研究

作者：胡博文中国人民解放军海军军医大学

学位级别：硕士

研究背景及目的睡眠是人类普遍存在且必不可少的一种生理现象,充足的睡眠是维持人体健康的基本保证。然而,随着社会的发展,工作节奏的加快,城市电气化所需的24小时轮班等现象愈发普遍,相当一部分人群主动或被动受到程度不一的睡眠困扰,... 详细信息

研究背景及目的睡眠是人类普遍存在且必不可少的一种生理现象,充足的睡眠是维持人体健康的基本保证。然而,随着社会的发展,工作节奏的加快,城市电气化所需的24小时轮班等现象愈发普遍,相当一部分人群主动或被动受到程度不一的睡眠困扰,比如医务人员轮班、司机夜间驾驶、军人执行时敏性军事任务和夜间执勤任务等。上述情况下,人们充足的睡眠或规律的作息无法得到保证,常导致慢性睡眠剥夺的发生。长期的睡眠剥夺会引发人体多系统的负面影响,如易发生神经精神异常、代谢功能紊乱、内分泌功能失调、免疫力下降等。对于心血管系统来说,已有研究提示慢性睡眠剥夺可以导致不同程度的血压升高、心律失常、心脏功能减退等。诚然,避免睡眠剥夺导致健康损伤的最佳方案是保证充足的睡眠,但在上述特殊情况下难以实现。因此,慢性睡眠剥夺情况下有效的心血管保护方案变得尤为重要。钠-葡萄糖共转运体-2（sodium-glucose co-transporter 2,SGLT-2）抑制剂是一类新型口服降糖药物,除了具有良好的降糖效果,还在多项大型临床试验中被证实具有显著的心血管保护作用。然而,在慢性睡眠剥夺情况下,SGLT2抑制剂是否仍能发挥其心血管保护效应,尚无文献报道。因此,本课题的主要目的是对SGLT-2抑制剂达格列净（dapagliflozin,DApA）对慢性睡眠剥夺小鼠心血管功能障碍的保护作用及机制进行研究。本课题共分为三部分研究,第一部分明确慢性睡眠剥夺对小鼠心血管功能的影响,第二部分探究达格列净对慢性睡眠剥夺小鼠心血管功能的保护作用,第三部分探究达格列净防止慢性睡眠剥夺小鼠心血管功能障碍的机制。第一部分慢性睡眠剥夺对小鼠心血管功能的影响研究方法1.实验分组、建立小鼠慢性睡眠剥夺模型。（1）将8-10周龄雌性C57BL/6小鼠随机分为对照（Control,Ctrl）组和慢性睡眠剥夺（Sleep Deprivation,SD）组。（2）将SD组小鼠置于KW-BD大小鼠睡眠剥夺仪中,设定中央横杆转速为4圈/分钟,每24小时转动18小时、停止6小时,持续28天,以此建立慢性睡眠剥夺模型。将Ctrl组小鼠置于另一个相同的KW-BD大小鼠睡眠剥夺仪中,横杆保持静止,持续28天。（3）在造模过程中,保证小鼠的自由饮食饮水,及时更换垫料,保持小鼠生活环境干燥卫生。2.观察小鼠一般情况、监测小鼠心血管功能相关指标（1）观察小鼠毛色、精神状态、活动度等一般情况。（2）监测小鼠体重（body weight,BW）、心脏重量（heart weight,HW）、心重/体重比值（HW/BW）、血糖（blood glucose）、心率（heart rate,HR）、血压、心脏功能、冠脉微循环功能,评估慢性睡眠剥夺对小鼠心血管功能的影响。（3）留取心脏组织标本,制作病理切片,行HE染色、Masson染色、ROS探针-DHE荧光及CD31免疫组化,评估慢性睡眠剥夺小鼠心脏组织病理改变、心肌纤维化程度、氧化应激水平和毛细血管密度的情况。研究结果1.慢性睡眠剥夺使小鼠体重明显下降（1）相较于Ctrl组,SD组小鼠BW明显下降（p＜0.05）。（2）Ctrl组与SD组小鼠HW、HW/BW比值、血糖水平无明显差异。2.慢性睡眠剥夺导致小鼠血压升高（1）相较于Ctrl组,SD组小鼠收缩压（systolic blood pressure,SBp）、舒张压（diastolic blood pressure,DBp）、平均动脉压（mean arterial pressure,MAp）均显著升高（p＜0.01）。（2）Ctrl组与SD组小鼠HR无明显区别。3.慢性睡眠剥夺导致小鼠心脏舒张功能障碍（1）相较于Ctrl组,SD组小鼠E/A比值显著降低、E峰下降时间（descending time,DT）、等容舒张时间（isovolumic relaxation time,IVRT）均显著延长（p＜0.01）。（2）Ctrl组与SD组小鼠左室射血分数（left ventricular ejection fracture,LVEF）、缩短分数（fractional shortening,FS）、室间隔厚度（interventricular septal thickness,IVST）、左室内径（left ventricular internal diameter,LVID）、左室后壁厚度（left ventricular posterior wall thickness,LVpW）均无明显差异。4.慢性睡眠剥夺导致小鼠冠脉微循环障碍（1）相较于Ctrl组,SD组小鼠冠脉血流储备（coronary flow reserve,CFR）显著降低（p＜0.01）。（2）相较于Ctrl组,SD组小鼠心脏毛细血管密度显著下降（p＜0.01）。5.慢性睡眠剥夺导致小鼠心脏组织炎症浸润等改变。（1）Ctrl组小鼠心肌细胞排列较整齐,未见明显坏死和

关键词：睡眠剥夺高血压心脏功能冠脉微循环氧化应激心肌纤维化达格列净血压冠脉血流储备 TGF-β smad3 p-smad3