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全氟辛酸（pFOA）抑制内皮细胞血管生成功能的机制研究

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全氟辛酸（PFOA）抑制内皮细胞血管生成功能的机制研究

作者：肖荷中国医科大学

学位级别：硕士

目的:全氟辛酸(pFOA)是一种广泛应用于人类生产生活的合成氟表面活性剂,也是一种强环境污染物,具有在环境中不易分解的特点。pFOA可通过消化道、呼吸道和皮肤途径进入人体,导致正常细胞功能受损,并诱发多种疾病产生。pFOA对人体健康的... 详细信息

目的:全氟辛酸(pFOA)是一种广泛应用于人类生产生活的合成氟表面活性剂,也是一种强环境污染物,具有在环境中不易分解的特点。pFOA可通过消化道、呼吸道和皮肤途径进入人体,导致正常细胞功能受损,并诱发多种疾病产生。pFOA对人体健康的严重危害性以及对地球环境污染的日益严重性,已经引起了世界众多环境学家和科研者的注意,成为了环境科研领域的研究热点。流行病学资料显示,pFOA血清水平的增加与心血管疾病存在显著的独立关联。然而,pFOA是否影响内皮细胞血管生成尚无报道。内皮细胞是心血管系统的重要组成部分,排列在从心脏到毛细血管的整个循环系统中。它作为组织与血液之间的重要屏障,对维持循环系统的稳态起着关键性作用。内皮细胞是心血管疾病多种危险因素的直接目标,内皮细胞功能障碍是导致多种心血管疾病发病的使动或促进因素,研究其损伤机制对于疾病预防、治疗和愈后都至关重要。血管生成是衡量内皮细胞功能的重要指标。血管生成的良好调节在许多疾病的转归和恢复中起着关键作用;而当血管生成受抑制时,也会促进心血管疾病的进展并延缓其恢复。因此,血管生成的平衡调节对维持机体的正常生理功能具有重要的意义。蛋白激酶A(protein Kinase A,pKA)是细胞信号转导中重要的第二信使环磷酸腺苷(c AMp)的经典靶向分子。当pKA被上游信号激活时,可磷酸化诸如gsk3β、YAp及pDK1等靶蛋白,继而调节细胞增殖、迁移、分化、自噬、衰老等生物学过程。许多化学物质可以调节细胞内pKA的活性,而pFOA是否可以调控pKA活性尚未见报道。Wnt/β-catenin信号被证明对内皮细胞的血管萌芽和新生具有积极的调控作用,β-catenin是gsk3β的主要下游分子之一,gsk3β与axin/ApC组成的复合体可促进β-catenin的磷酸化和泛素化降解。当该复合物被抑制后,细胞质内的β-catenin得以稳定存在,从而入核发挥转录因子的作用。Snail1是β-catenin的下游靶基因,受转录因子β-catenin转录调控,且snail对促进血管内皮细胞中萌芽血管的生成具有重要意义。在本文中,我们研究了pFOA对人脐静脉内皮细胞HUVEC血管生成功能的影响并探索了其中的具体机制。我们发现,pFOA的应用抑制了内皮细胞的血管生成功能。通过转录组文库构建和二代高通量测序,我们分析出pFOA处理组的pKA活性受到了抑制,Western Blot以及后续的回复实验也验证了测序结果的可靠性;pFOA的处理还导致了下游gsk3β/β-catenin信号的抑制,使用gsk3β抑制剂Li Cl以及构建β-catenin核定位慢病毒转染细胞后进行的回复实验说明了gsk3β/β-catenin信号也介导了血管生成的抑制过程;最后我们检测出pFOA导致转录因子snail的表达下调。我们拟通过pFOA处理血管内皮细胞为研究模型,探究pFOA抑制血管生成的具体机制,并希望为心血管疾病的基础研究提供理论依据。研究方法:1、将人脐静脉内皮细胞系HUVEC分为对照组及pFOA处理组,进行CCK8细胞活力检测实验、Matrigel血管形成实验、划痕愈伤实验和三维发芽实验,明确pFOA对血管生成的影响;2、提取对照组及pFOA处理组细胞的m RNA,进行转录组文库构建、二代测序、GSEA富集分析,通过Western Blot检测p-pKA的表达;3、使用pKA激活剂8-Bromo-c AMp刺激pFOA处理组的HUVEC,进行血管形成的回复实验;4、Western Blot检测对照组和pFOA处理组p-pKA下游靶蛋白p-gsk3β(Ser9)的表达,并使用gsk3β抑制剂Li Cl干预后进行血管形成的回复实验;5、通过免疫荧光实验检测gsk3β下游的β-catenin的细胞内定位,以及构建β-catenin核定位慢病毒转染细胞,进行血管形成的回复实验;6、通过Western Blot和q pCR实验检测pFOA处理前后HUVEC内End MT相关指标在蛋白和基因层面的变化,检测到snail在pFOA的作用下表达下调。结果:1、pFOA抑制HUVEC的血管生成;2、pFOA抑制HUVEC中pKA的磷酸化;3、pFOA通过抑制pKA的磷酸化,减少HUVEC的血管生成;4、pFOA通过抑制pKA的磷酸化,影响gsk3β磷酸化;5、gsk3β的磷酸化影响血管生成;6、pFOA通过抑制β-catenin入核影响血管生成;7、pFOA导致HUVEC中snail的表达下调。结论:pFOA可能通过抑制HUVEC内pKA的活性,下调p-gsk3β(Ser9)的表达,使β-catenin入核减少,导致snail的转录和表达下降,抑制了血管生成。

关键词： pFOA 血管生成 pKA p-gsk3β β-catenin snail

gsk-3β在慢性甲基苯丙胺戒断大鼠戒断稽延性症状中的作用

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GSK-3β在慢性甲基苯丙胺戒断大鼠戒断稽延性症状中的作用

作者：胡媛媛福建医科大学

学位级别：硕士

目的药物成瘾作为一种慢性、复发性脑病,已成为全球普遍存在的公共卫生问题,复吸作为药物依赖的重要特征,治疗药物成瘾的关键是防治脱毒后复吸。因此,本课题通过建立甲基苯丙胺戒断大鼠模型,将海马作为研究重点,探究海马中慢性甲基苯丙... 详细信息

目的药物成瘾作为一种慢性、复发性脑病,已成为全球普遍存在的公共卫生问题,复吸作为药物依赖的重要特征,治疗药物成瘾的关键是防治脱毒后复吸。因此,本课题通过建立甲基苯丙胺戒断大鼠模型,将海马作为研究重点,探究海马中慢性甲基苯丙胺大鼠戒断后稽延性症状与gsk-3β及其磷酸化形式和节律基因Bmal1的关系,从时间生物学角度为开发有效的防复吸治疗提供新思路。方法1.选取体重介于200-250g的SD大鼠,在12h/12h昼夜循环的环境下饲养7天,随机分为甲基苯丙胺戒断组和生理盐水组并进行旷场和Cpp测试。利用条件位置性偏爱箱隔天对甲基苯丙胺组大鼠腹腔注射甲基苯丙胺(3mg/kg)建立成瘾模型,生理盐水组大鼠则每天注射生理盐水(1ml/kg),共14天。之后进行旷场及Cpp后测试。随后进行戒断,10天后,将两组大鼠断头取脑(ZT4),取出海马(Hip),用Western Blot方法检测gsk-3β及p-gsk3β和节律分子Bmal1的蛋白表达量。2.将SD大鼠经过7天的12h/12h光暗循环饲养之后,随机分为4组(甲基苯丙胺抑制剂组、甲基苯丙胺溶媒组、生理盐水抑制剂组与生理盐水溶媒组),在慢性甲基苯丙胺大鼠成瘾模型建立之后,用脑立体定位给药的方法在海马脑区给予gsk-3β抑制剂SB216763,戒断10天之后测旷场及Cpp,并取出海马(Hip),用Western Blot检测Bmal1蛋白表达量。结果1.甲基苯丙胺组大鼠条件位置偏爱效应显著增强(pp3.与生理盐水组相比,甲基苯丙胺戒断后大鼠的gsk-3β与p-gsk3β的表达量降低(ppp)中Bmal1较溶媒组大鼠相比,Bmal1表达量升高(pgsk-3β与节律基因Bmal1参与甲基苯丙胺大鼠戒断后稽延性症状的产生,在海马中注射gsk-3β特异性抑制剂后,促进了大鼠成瘾的消退,使节律基因的表达量发生变化。

关键词：甲基苯丙胺 gsk-3β p-gsk3β Bmal1 条件性位置偏爱

SD大鼠脑缺血再灌及丹参多酚酸盐干预后HSp22表达变化的研究

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SD大鼠脑缺血再灌及丹参多酚酸盐干预后HSP22表达变化的研究

作者：张金囡中南大学

学位级别：硕士

目的：本研究在建立SD大鼠脑缺血再灌注动物模型基础上,通过检测对缺血再灌注后及丹参多酚酸盐干预后HSp22、AKT、p-AKT、 gsk3β及p-gsk3β表达变化,探讨丹参多酚酸盐干预的神经保护作用及机制。方法：将60只健康雄性SD大鼠随机分为假... 详细信息

目的：本研究在建立SD大鼠脑缺血再灌注动物模型基础上,通过检测对缺血再灌注后及丹参多酚酸盐干预后HSp22、AKT、p-AKT、 gsk3β及p-gsk3β表达变化,探讨丹参多酚酸盐干预的神经保护作用及机制。方法：将60只健康雄性SD大鼠随机分为假手术组、缺血再灌注模型组、丹参多酚酸盐干预组。使用Logan线栓法建立大鼠脑缺血再灌注MCAO模型,缺血2小时后拔出拴线,进入再灌注期。干预组于再灌注后0h、24h及48h腹腔注射丹参多酚酸盐(18mg/kg),假手术组及模型组均腹腔注射同等剂量生理盐水。再灌注72h后三组进行神经功能缺损评分,并将动物断头处死,快速取脑组织制作标本,TTC染色观察脑组织梗死体积,HE染色观察大鼠脑缺血再灌注后损伤的形态学变化,TUNEL染色观察脑组织细胞凋亡数目,Western Blot检测HSp22、AKT、p-AKT、gsk3β及p-gsk3p蛋白表达变化。数据采用SpSS18.0进行统计分析。结果：1.丹参多酚酸盐干预组大鼠神经功能缺损评分明显优于缺血再灌注模型组(ppppp22表达较假手术组有明显增高(pp22表达较模型组明显升高(pp-AKT及p-gsk3β较假手术组升高(pp-AKT及p-gsk3β表达升高较模型组更为显著(pgsk3β总蛋白表达无明显差异(p>0.05)。结论:1.脑缺血再灌注后细胞凋亡增加,HSp22. p-AKT及p-gsk3β蛋白表达均高于对照组。2.丹参多酚酸盐可能通过增加大鼠脑缺血再灌注损伤后脑组织中HSp22表达,同时升高p-AKT及p-gsk3β蛋白表达,抑制缺血再灌注后细胞凋亡,缓解细胞病理变化,减轻脑组织缺血再灌注损伤,而发挥神经保护作用。

关键词：脑缺血再灌注丹参多酚酸盐 HSp22 AKT p-AKT gsk3β p-gsk3β 细胞凋亡神经保护

老化过程中特定脑区神经干细胞增殖能力和脑内胰岛素/胰岛素样生长因子信号的关系

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老化过程中特定脑区神经干细胞增殖能力和脑内胰岛素/胰岛素样生...

作者：姚婷婷兰州大学

学位级别：硕士

特定脑区成体干细胞和脑可塑性有关,涉及损伤后修复及活动依赖性脑结构重建。但神经干细胞状态受到众多因素的调节,目前认为年龄是影响神经干细胞状态的关键因素,年龄增加导致的脑内代谢环境的变化是复杂而立体的,虽然尚无法确定年龄增... 详细信息

特定脑区成体干细胞和脑可塑性有关,涉及损伤后修复及活动依赖性脑结构重建。但神经干细胞状态受到众多因素的调节,目前认为年龄是影响神经干细胞状态的关键因素,年龄增加导致的脑内代谢环境的变化是复杂而立体的,虽然尚无法确定年龄增加后何种因素影响到神经干细胞的功能状态。但部分研究表明随年龄增加,脑内胰岛素/胰岛素样多肽信号下降,而胰岛素/胰岛素样多肽在胚胎神经发育中发挥关键作用。但目前尚不清楚成年后脑内胰岛素信号变化和脑内成体干细胞状态之间存在何种关系。因此本研究拟探讨小鼠老化过程中脑室下区(subventricular zone, SVZ)内成体干细胞随年龄增加增殖活性的变化和脑内胰岛素样肽(ILps)的相关性。方法：C57B/L小鼠分别饲养至2月,12月,18月时处死,处死前用Morris水迷宫法检测小鼠空间记忆能力,检测小鼠血浆生化的变化。各组动物处死前腹腔注射BrdU (60mg/kg,处死前3大开始注射,连续注射3天,1次/天)部分动物断头取脑,冰台上游离前额皮层,冷冻备用,部分动物灌注固定,连续冠状冰冻切片备用。利用CV染色结合立体计数评价前额皮层椎体细胞密度。利用免疫组织化学方法检测SVZ区BrdU、Ki67表达水平。利用Western blot技术检测前额皮层内β-Catenin, p-gsk3的表达水平,利用pCR技术检测海马insulin, IGF-1, IGF1受体转录水平结果：18个月小鼠空间记忆能力比2月的小鼠明显下降,而血清胰岛素水平18月组明显高于2月组。锥体细胞密度随年龄增加明显下降。18个月小鼠SVZ区BrdU和Ki67阳性细胞与2月小鼠比较明显有所减少(pp-gsk3β在12个月小鼠表达最高,18月时逐渐减少。pCR结果可见海马insulin, IGF1受体转录水平在2个月小鼠最高,12个月和18个月小鼠明显减少,IGF1转录水平在12个月小鼠水平最高,18个月小鼠明显减少。结论：上述结果表明SVZ区干细胞的增殖能力随老化增加逐渐下降可能与脑内胰岛素样肽信号的减弱有关。

关键词：脑室下区前体细胞增殖 β-Catenin p-gsk3β insulin IGF-1 IGF1受体小鼠

miR-199a-5p对心脏缺血再灌注细胞模型细胞活力和细胞凋亡的影响及可能机制探究

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中国血液流变学杂志 2021年第4期31卷 458-462页

作者：郭玉冰王皓谷云飞洛阳市中心医院河南洛阳471000

目的探究微小RNA-199a-5(microRNA-199a-5p,miR-199a-5p)对心脏缺血再灌注细胞模型细胞活力和细胞凋亡的影响及可能机制。方法利用H9C2细胞株建立氧糖剥夺再灌注模型,模拟心肌细胞缺血再灌注。利用miR-199a-5p inhibitor抑制H9C2细胞中m... 详细信息

目的探究微小RNA-199a-5(microRNA-199a-5p,miR-199a-5p)对心脏缺血再灌注细胞模型细胞活力和细胞凋亡的影响及可能机制。方法利用H9C2细胞株建立氧糖剥夺再灌注模型,模拟心肌细胞缺血再灌注。利用miR-199a-5p inhibitor抑制H9C2细胞中miR-199a-5p的表达,细胞分组为空白对照组、模型组、miR-199a-5p inhibitor组。观察空白对照组、模型组细胞中miR-199a-5p的表达水平,比较空白对照组、模型组、miR-199a-5p inhibitor组细胞活力、凋亡能力及缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)、糖原合成激酶3β(gsk3β)、p-gsk3β蛋白表达水平。结果模型组H9C2细胞中miR-199a-5p表达水平显著高于空白对照组(ppp inhibitor组H9C2细胞OD值显著高于模型组,凋亡率显著低于模型组(pp-gsk3β蛋白表达水平均显著低于空白对照组。miR-199a-5p inhibitor组H9C2细胞HIF-1α、p-gsk3β蛋白表达水平均显著高于模型组(pp在心脏缺血再灌注细胞模型中的表达水平增加,敲低其表达水平后可抑制细胞活力并促进细胞凋亡,其作用机制可能是通过上调HIF-1α、p-gsk3β表达水平实现的。

关键词： miR-199a-5p 心脏缺血再灌注 HIF-1α p-gsk3β