检索结果-南通市图书馆

作者：马明月中南民族大学

学位级别：硕士

电压依赖性阴离子通道蛋白VDACs(Voltage-dependent anion channels)是广泛定位于线粒体外膜上的孔道蛋白,在线粒体与细胞其它部位的通讯中起重要调节作用。实验室前期从水稻基因组中鉴定出8个osvdacs基因,利用膜蛋白酵母双杂交技术筛... 详细信息

电压依赖性阴离子通道蛋白VDACs(Voltage-dependent anion channels)是广泛定位于线粒体外膜上的孔道蛋白,在线粒体与细胞其它部位的通讯中起重要调节作用。实验室前期从水稻基因组中鉴定出8个osvdacs基因,利用膜蛋白酵母双杂交技术筛选出与osvdac4互作的2个候选蛋白OsV4IP1和OsV4IP2。在此基础上本研究初步探讨了osvdac4与其互作蛋白OsV4IP1和OsV4IP2的功能。主要结果如下:1.构建pM999-osvdac4/OsV4IP1/OsV4IP2-GFP瞬时表达载体,转化水稻原生质体观察荧光信号。利用线粒体标记载体mt-rk CD3-991、细胞核标记载体p2300-35S-H2B-mCherry和线粒体染料Mito Tracker辅助观察,确定osvdac4和OsV4IP1均定位于线粒体和细胞质,OsV4IP2定位于细胞核。2.利用Gateway同源重组技术,将目的基因osvdac4、OsV4IP1和OsV4IP2克隆到pDONR207中,依靠载体上的特定重组位点将目的基因重组到pSPYNE/pSPYCE中。转化农杆菌并注射到烟草叶表皮后,利用激光扫描共聚焦显微镜观察到osvdac4与OsV4IP1/OsV4IP2在活细胞内存在相互作用。3.通过实时荧光定量PCR检测3个水稻品种日本晴(Nip)、粤泰B(YTB)和粤泰A(YTA)的不同组织中osvdac4、OsV4IP1和OsV4IP2的表达量,分析其表达模式。发现osvdac4在YTB和YTA的不同组织中表达模式较为接近,与Nip中的表达模式差异较大。osvdac4在3个水稻品种的花粉粒充实成熟期时均表达量达到最高,推测其可能参与调控水稻花粉粒的成熟过程。OsV4IP1在3个水稻品种中的表达模式较为相似;四叶期的根、茎、叶中均为叶中表达量最高,茎中表达量最低;4个幼穗发育时期表达量普遍较低,且不同时期的表达量差异较小。OsV4IP2在3个水稻品种的不同生长发育阶段的表达差异较大;YTA中花粉粒充实成熟期时OsV4IP2的表达水平相比Nip和YTB中上调明显,推测OsV4IP2可能参与调控YTA花粉粒的成熟过程进而可能影响水稻的育性。4.构建pU1301-OsV4IP1/OsV4IP2超表达载体,利用农杆菌介导转化Nip愈伤组织,获得了OsV4IP1和OsV4IP2超表达植株(OsV4IP1-OE和OsV4IP2-OE)。通过阳性鉴定和表达量检测最终得到表达量上调明显的3株OsV4IP1-OE植株和19株OsV4IP2-OE植株。这些转基因植株均已收获种子,可为后续实验提供研究材料。5.将osvdac4 CRISPR缺失突变体(osvdac4)和超表达植株(osvdac4-OE)的种子进行繁种。通过阳性鉴定和表达量检测,最终确定了14株osvdac4上调明显的超表达植株。通过对CRISPR编辑位点序列的扩增和测序比对,最终确定了19株纯合突变植株,7株杂合突变植株。所有突变体材料均已收获种子。比较osvdac4-OE、OsV4IP1-OE和OsV4IP2-OE籽粒大小,发现随着它们表达量上调,平均单粒重降低,籽粒变小,且表达量上调越高籽粒越小。推测osvdac4和OsV4IP1/OsV4IP2可能参与调控水稻籽粒的发育。6.非生物胁迫实验结果表明osvdac4-OE幼苗对盐胁迫有较高的耐受性,而osvdac4缺失突变体幼苗则对盐胁迫更为敏感,推测osvdac4可能参与正调控水稻耐盐。在甘露醇模拟的干旱胁迫下,osvdac4-OE幼苗生长受到抑制,而osvdac4缺失突变体幼苗则对干旱胁迫有更好的耐受性,表明osvdac4可能负调控水稻耐旱。由此说明盐胁迫下幼苗表型差异并不是由于细胞渗透效应引起的,osvdac4可能通过调控水稻组织的离子转运缓解盐胁迫造成的离子失衡问题,进而参与调控水稻耐盐。osvdac4-OE幼苗对ABA更为敏感,osvdac4缺失突变体幼苗则对ABA具有更好的抗性。推测osvdac4可能参与了ABA信号转导过程。

关键词： osvdac4 互作蛋白亚细胞定位 BiFC 表达模式非生物胁迫

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水稻osvdac4互作蛋白筛选及osvdac5启动子表达模式分析

水稻OsVDAC4互作蛋白筛选及OsVDAC5启动子表达模式分析

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作者：白雪琪中南民族大学

学位级别：硕士

电压依赖性阴离子通道(voltage-dependent anion channels,VDACs)是广泛存在于线粒体上的一种孔道蛋白,可以控制代谢产物、无机盐的运输,维持内环境的稳态,并与细胞凋亡有关。本实验室前期鉴定出了8种水稻VDAC蛋白,本实验主要围绕osvdac... 详细信息

电压依赖性阴离子通道(voltage-dependent anion channels,VDACs)是广泛存在于线粒体上的一种孔道蛋白,可以控制代谢产物、无机盐的运输,维持内环境的稳态,并与细胞凋亡有关。本实验室前期鉴定出了8种水稻VDAC蛋白,本实验主要围绕osvdac4和osvdac5来进行,主要取得以下2个方面结果:1.将osvdac4全长序列连接两个诱饵蛋白载体pBT3-N和pBT3-SUC,膜蛋白酵母双杂交结果表明pBT3-SUC-osvdac4可用于文库筛选。从YTB幼穗cDNA文库中筛选出4个可能与osvdac4互作的蛋白,进一步点对点杂交实验证明只有LOCs02g06640.1和LOCs06g51220.2与osvdac4互作,暂命名为OsV4IP1和OsV4IP2。生物信息学分析发现OsV4IP1蛋白有14次或是22次跨膜,或是没有跨膜。OsV4IP2蛋白没有跨膜结构。OsV4IP1和OsV4IP2都定位在核上。2.对osvdac5的ATG上游4500 bp序列进行生物信息学分析后,将其分为4个5’部分缺失片段pB、pC、pD和pE。将4个片段分别连接双元表达载体DX2181,通过农杆菌介导得到转基因阳性植株。目前只得到了pC、pD和pE表达GFP的阳性植株。对部分植株进行荧光观察结果表明pC、pD和pE在根的厚壁组织、内皮层、中柱表达,pC和pD在叶的表皮和中柱,叶鞘的韧皮部、叶舌、叶节,颖壳,花蕊表达。在根的皮层薄壁组织,叶肉,叶鞘内部都不表达。

关键词： osvdac4 osvdac5 互作蛋白膜蛋白酵母双杂交启动子

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水稻osvdac4诱饵蛋白载体的构建及鉴定

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安徽农业科学 2018年第36期46卷 90-94,124页

作者：白雪琪谭艳平覃永华王亚楠杨武龚秋涵刘学群王春台中南民族大学生命科学学院生物技术国家民委重点实验室/武陵山区特色资源植物种质保护与利用湖北省重点实验室湖北武汉430074

[目的]获得可用于筛选膜蛋白酵母双杂交文库的诱饵蛋白载体。[方法]在对Os VDAC4进行生物信息学分析的基础上,将Os VDAC4全长ORF分别与p BT3-N和p BT3-SUC连接,构建2个诱饵蛋白载体p BT3-Os VDAC4-N-Cub和p BT3-SUC-Os VDAC4-C-Cub,利... 详细信息

[目的]获得可用于筛选膜蛋白酵母双杂交文库的诱饵蛋白载体。[方法]在对Os VDAC4进行生物信息学分析的基础上,将Os VDAC4全长ORF分别与p BT3-N和p BT3-SUC连接,构建2个诱饵蛋白载体p BT3-Os VDAC4-N-Cub和p BT3-SUC-Os VDAC4-C-Cub,利用膜蛋白酵母双杂交技术鉴定出可用于筛库的诱饵蛋白载体。[结果]p BT3-Os VDAC4-N-Cub和p BT3-SUC-Os VDAC4-C-Cub都可以与目标蛋白互作,但由于Os VDAC4的N端有约50个可自由伸展的氨基酸残基导致p BT3-Os VDAC4-N-Cub本底反应非常强,Os VDAC4的C端存在于膜中而没有可自由伸展的氨基酸残基,p BT3-SUC-Os VDAC4-C-Cub的本底反应很弱。[结论]p BT3-SUC-Os VDAC4-CCub可用于文库筛选,这为获取Os VDAC4的互作蛋白提供了基础。

关键词： osvdac4 诱饵蛋白载体膜蛋白酵母双杂交

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