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水稻osszf1基因的克隆与其功能初步分析

水稻OsSZF1基因的克隆与其功能初步分析

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作者：朱天生华中农业大学

学位级别：硕士

水稻是世界三大粮食作物之一，进行水稻研究，培育优良水稻品种具有十分重要的意义。水稻基因组测序的完成是水稻研究的一个里程碑，使人类在DNA水平上对水稻有了更深入的了解。中国是个水资源缺乏的国家，尽管不同的研究者从诸多方面... 详细信息

水稻是世界三大粮食作物之一，进行水稻研究，培育优良水稻品种具有十分重要的意义。水稻基因组测序的完成是水稻研究的一个里程碑，使人类在DNA水平上对水稻有了更深入的了解。中国是个水资源缺乏的国家，尽管不同的研究者从诸多方面对植物的抗旱作了大量的研究，但由于植物抗旱性是一个非常复杂的数量性状，涉及大量的功能各异的基因，其抗旱性的遗传机制一直不太清楚，所以抗旱相关基因的发掘是抗旱性研究的热点。本研究选用粳型旱稻品种“沪旱3号”为模式材料，在本研究室对抗旱QTL定位的基础上，，采用RT-PCR策略，从抗旱QTL区间克隆水稻逆境胁迫相关基因，并进行功能验证。通过SMART RACE技术，从EST片段的保守区，分别获得osszf1基因的3’和5’端序列，利用Vector NTI 8.0将保守区、3’和5’拼接后得到osszf1基因全长cDNA。通过相关的生物信息分析，获得一个开放阅读框，编码367个氨基酸，3’端有210bp的非翻译区，5’端也有182bp的非翻译区，具有保守的C3HC4结构，是典型的RING型锌指蛋白基因。通过RT-PCR技术，扩增水稻osszf1基因开放阅读框，Southern杂交分析表明osszf1基因在水稻基因组中为单拷贝。分别用3种不同浓度梯度的NaCl、脱落酸(ABA)、水杨酸(SA)和甘露醇(Mannitol)和甲基茉莉酸(m-JA)处理水稻幼苗1h后剪取叶片和根，抽提总RNA反转录成cDNA为模板，以3’非编码区设计引物，使用荧光定量PCR检测osszf1基因在不同处理的表达情况，结果显示osszf1基因受不同处理诱导表达，以ABA，NaCl的表达差异最大，水杨酸和甲基茉莉酸低浓度处理就可诱导osszf1基因表达，但随着处理浓度的升高表达反而下降，不同浓度甘露醇处理后，osszf1基因的表达量随着浓度的增加而增加，由此表明水稻osszf1基因和植物的抗逆性有关系，且该基因对不同浓度的处理有不同的应答，是ABA依赖的DNA表达蛋白。构建了植物表达载体pCAMBIA2300-osszf1，并通过冻融法将该重组质粒成功的导入根癌农杆菌菌株EHA105中，利用该农杆菌转化烟草。对转基因烟草苗的PCR分析和Southern blot分析表明，外源基因osszf1已经整合到了烟草的基因组中，其拷贝为单拷贝。由于时间的限制，该基因的功能还需进一步进行研究。

关键词：水稻抗旱 osszf1 转化 Southern blot 荧光定量PCR

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