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植物生理学报 2013年第12期49卷 1400-1406页

作者：林群婷梁卫红李辉张静河南师范大学生命科学学院河南新乡453007

Rop在植物生长、发育、免疫及环境信号应答等多种生物学过程中具有重要作用。已有研究显示水稻Rop基因osrac5可能与育性控制有关,但是该基因的表达特性,以及非生物胁迫和植物生长物质对其表达的影响尚不清楚。本文采用qRT-PCR技术检测了... 详细信息

Rop在植物生长、发育、免疫及环境信号应答等多种生物学过程中具有重要作用。已有研究显示水稻Rop基因osrac5可能与育性控制有关,但是该基因的表达特性,以及非生物胁迫和植物生长物质对其表达的影响尚不清楚。本文采用qRT-PCR技术检测了osrac5在水稻生长发育过程中、非生物胁迫以及植物生长物质处理条件下的表达特性,结果显示osrac5在水稻生长发育过程中在多种组织广泛表达,尤其在根和雌雄蕊形成期的幼穗中高表达;干旱、高盐和低温等非生物胁迫均能诱导osrac5的表达;ABA、GAs、6-BA等植物生长物质能上调osrac5基因表达,提示该基因与水稻幼穗发育、抗逆性及细胞生长等过程相关。

关键词：水稻 Rop osrac5 非生物胁迫植物生长物质

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利用CRISPR/Cas9技术编辑水稻ROP基因osrac5

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中国生物化学与分子生物学报 2018年第12期34卷 1350-1357页

作者：王美娜彭静静王凯婕安文静刘亚菲李珂嘉梁卫红河南师范大学生命科学学院分子细胞生物学实验室河南新乡453007

osrac5基因属于水稻小G蛋白ROP家族。该基因参与了水稻的育性调节,但是osrac5在水稻生长发育中的作用尚不清楚。为鉴定该基因的功能,本文采用CRISPR/Cas9基因组编辑技术,构建了该基因的双靶标载体Cas9-osrac5,并对水稻进行了遗传转化。... 详细信息

osrac5基因属于水稻小G蛋白ROP家族。该基因参与了水稻的育性调节,但是osrac5在水稻生长发育中的作用尚不清楚。为鉴定该基因的功能,本文采用CRISPR/Cas9基因组编辑技术,构建了该基因的双靶标载体Cas9-osrac5,并对水稻进行了遗传转化。对转基因水稻的筛选和分子鉴定显示,在T1代获得了10个纯合突变株系。序列分析显示,在osrac5编辑水稻中,该基因编码区发生了碱基缺失或/和插入,导致预期产生的不同类型osrac5截短蛋白均丧失小G蛋白的保守结构域。对抽穗期osrac5编辑水稻的表型进行统计学分析,结果显示,osrac5编辑水稻与对照在剑叶角度以及剑叶净光合速率上存在极显著差异,其中osrac5编辑水稻剑叶角度增大67%,剑叶净光合速率减小32. 7%。本研究结果提示,osrac5基因通过调控剑叶角度,影响水稻光合效率,与水稻生长发育密切相关。

关键词：水稻 osrac5 CRISPR/Cas9 剑叶角度净光合速率

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osrac5在水稻生长发育中功能的初步鉴定

OsRac5在水稻生长发育中功能的初步鉴定

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作者：王美娜河南师范大学

学位级别：硕士

水稻ROP基因osrac5是从雌雄蕊形成期幼穗中分离得到的功能未知基因。前期研究发现,该基因与光敏核不育水稻农垦58S光周期育性转换相关;该基因在水稻生长发育过程中在多种组织中广泛表达,其中在幼穗中表达量最高;为鉴定该基因的功能,实... 详细信息

水稻ROP基因osrac5是从雌雄蕊形成期幼穗中分离得到的功能未知基因。前期研究发现,该基因与光敏核不育水稻农垦58S光周期育性转换相关;该基因在水稻生长发育过程中在多种组织中广泛表达,其中在幼穗中表达量最高;为鉴定该基因的功能,实验室前期已经构建了其RNA干扰水稻,本研究进一步利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建该基因的敲除水稻,以野生型日本晴水稻(WT)、该基因的RNA干扰水稻(RNAi-osrac5)和敲除水稻(Cas9-osrac5)为材料,对该基因在水稻生长发育中的功能进行初步鉴定。对RNAi-osrac5水稻的PCR和qRT-PCR检测结果表明,与WT水稻相比,检测的18个株系均为转基因株系,其中osrac5基因在15个转基因株系中的表达水平均极显著下调,下调幅度为对照组的0.15.78倍,可以作为后续实验的材料。采用CRISPR/Cas9技术对osrac5基因进行编辑,将构建的Cas9-osrac5载体转化日本晴水稻,PCR和测序证实,在T0代获得6个杂合转基因株系,在T1代筛选获得10个纯合敲除株系,突变的本质为碱基的缺失和/或插入;对不同纯合敲除株系中osrac5基因预期编码蛋白的氨基酸序列进行多序列比对,结果显示,在10个纯合敲除株系中,osrac5序列都发生了移码突变和无义突变,引起氨基酸序列的改变,将导致osrac5截短蛋白的生成。由于截断蛋白保守的GTP/GDP结合位点丧失,GTP酶结构域不完整,因此预期在10个纯合敲除株系中将没有正常osrac5蛋白生成。对水稻种子进行萌发相关实验,结果显示,与WT水稻相比,RNAi-osrac5和Cas9-osrac5水稻种子萌发完成时间分别提前12 h、24 h;在水稻种子萌发3 d、5 d和7d的时候,与WT水稻相比,RNAi-osrac5水稻的胚根伸长量均极显著增加(分别增加1.95倍、1.09倍和1.14倍左右),胚芽伸长量均极显著增加(分别增加0.61倍、0.71倍和0.49倍左右);Cas9-osrac5水稻的胚根伸长量均极显著增加(分别增加2.14倍、1.2倍和1.22倍左右),胚芽伸长量均极显著增加(分别增加0.81倍、0.77倍和0.59倍左右)。说明osrac5基因敲除或表达水平下调,促进了水稻种子萌发与幼苗生长。对水稻小孢子发育8个典型阶段进行细胞学观察,结果显示,RNAi-osrac5和Cas9-osrac5水稻在第1至第6阶段,与WT水稻相比,没有出现明显差异,但在第7阶段(小孢子晚期)出现小孢子萎缩,异常空泡化现象,第8阶段(成熟花粉期)出现更多异常干瘪的花粉粒;对成熟花粉粒进行染色,观察统计活性花粉数,结果显示,与WT水稻相比,RNAi-osrac5和Cas9-osrac5水稻的可育花粉比率极显著降低(分别减小13.4%、20.2%左右)。说明osrac5基因敲除或表达水平下调,影响了小孢子晚期发育,进而影响了花粉的成熟过程,导致可育花粉比率下降。在抽穗期,对剑叶生理指标进行测定,结果显示,与WT水稻相比,RNAi-osrac5和Cas9-osrac5水稻的净光合速率均极显著降低(分别减小9.7%、32.7%左右),而RNAi-osrac5蒸腾速率没有明显变化,Cas9-osrac5水稻蒸腾速率极显著降低(减小27.2%左右)。在成熟期,对水稻进行农艺性状统计,结果显示,与WT水稻相比,RNAi-osrac5和Cas9-osrac5水稻的株高均显著升高(分别增高6.6%、6.0%左右);有效分蘖数均极显著减少(分别减少37.5%、40.5%左右);穗实粒均极显著降低(分别降低8.5%、15.1%左右);RNAi-osrac5结实率显著降低(降低6.0%左右),Cas9-osrac5水稻结实率极显著降低(降低19.7%左右);RNAi-osrac5水稻千粒重没有明显变化,Cas9-osrac5水稻千粒重显著降低(降低12.4%左右);穗长、一级枝梗数、穗总粒、粒长和粒宽等性状没有明显变化。本研究基于实验室前期工作,利用CRISPR/Cas9技术构建了10个水稻osrac5基因敲除纯合株系,以野生型日本晴水稻(WT)、osrac5基因RNA干扰水稻(RNAi-osrac5)和osrac5基因敲除水稻(Cas9-osrac5)为实验材料,开展osrac5基因的功能研究,发现该基因的功能涉及水稻种子萌发、幼苗生长,以及育性、株高、分蘖数、结实率等重要农艺学性状,为深入研究该基因的功能奠定了基础,同时也为探讨该基因在水稻分子设计育种上的价值提供了重要依据。

关键词：水稻 osrac5 RNA干扰 CRISPR/Cas9技术生长发育

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水稻osrac5基因在叶角调控中的功能鉴定

水稻OsRac5基因在叶角调控中的功能鉴定

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作者：冯连杰河南师范大学

学位级别：硕士

植物小G蛋白ROP作为细胞信号转导的分子开关,广泛参与植物的生长发育调控和对环境的应答。本实验室对水稻ROP基因Os Rac5的研究显示,该基因在水稻生长发育过程的多种组织中广泛表达,其中在幼穗中表达量最高,并且ABA、GA和BR等植物激素... 详细信息

植物小G蛋白ROP作为细胞信号转导的分子开关,广泛参与植物的生长发育调控和对环境的应答。本实验室对水稻ROP基因Os Rac5的研究显示,该基因在水稻生长发育过程的多种组织中广泛表达,其中在幼穗中表达量最高,并且ABA、GA和BR等植物激素均能诱导其表达上调。为了鉴定该基因功能,实验室前期利用CRISPR/Cas9基因编辑技术和RNAi技术分别构建了Os Rac5基因敲除水稻和干扰水稻,并发现转基因水稻叶角增加、育性下降。基于实验室前期工作,本研究对鉴定后的T4代Os Rac5敲除水稻开展叶角表型研究,发现与野生型水稻相比,Os Rac5敲除水稻三个株系的倒一叶、倒二叶、倒三叶和倒四叶角度均增大,其中倒一叶角度增大最明显,叶角增幅分别为64.9%、100.6%和115.2%,差异均达到极显著水平。为进一步研究Os Rac5基因与水稻叶角调控的关系,构建了Os Rac5基因过表达水稻。在对T2代Os Rac5过表达水稻筛选和分子鉴定的基础上,检测叶角表型,结果显示与野生型水稻相比,Os Rac5过表达水稻三个株系的叶角普遍减小,其中剑叶角度减小最明显,三个株系的剑叶叶角减小幅度分别为26%、30.8%和38.5%,差异均达到极显著水平。为探究Os Rac5转基因水稻叶角变化的细胞学基础,对野生型水稻、Os Rac5敲除水稻和Os Rac5过表达水稻成熟期剑叶叶枕组织进行石蜡切片分析,结果显示,与野生型水稻相比,Os Rac5敲除水稻叶枕远轴处厚壁细胞面积和数量极显著减少,而Os Rac5过表达水稻则极显著增多,表明Os Rac5基因与叶枕组织厚壁细胞增殖和分化相关。进一步的细胞化学染色证明,木质素在叶枕厚壁细胞次生壁的沉积情况发生变化,与野生型水稻相比,Os Rac5敲除水稻叶枕中木质素沉积较少,而Os Rac5过表达水稻则在维管束鞘及其周围厚壁细胞中都有大量木质素分布,说明Os Rac5基因过表达不仅能够促进叶枕组织中厚壁细胞的形成,并且能够增强木质素在次生壁中的积累,进而通过增加叶枕组织的机械支撑力,导致叶角减小,反之,Os Rac5基因敲除后抑制了厚壁细胞的形成和木质素在次生壁中的积累,导致叶角增大,提示Os Rac5与叶枕发育过程密切相关。由于已知油菜素内酯(Brassinolide,BR)是禾本科叶角调控最为重要的激素,本研究通过施加外源BL,检测了转基因水稻对BR的敏感性,结果表明Os Rac5敲除水稻对BR敏感性降低,而Os Rac5过表达水稻对BR的敏感性却没有明显变化。利用q RT-PCR检测BR相关基因在转基因水稻叶枕中的表达水平,结果显示,BR合成相关基因D2、D11和BRD1在Os Rac5敲除水稻中表达量显著增加,而在Os Rac5过表达水稻中则显著降低,说明Os Rac5基因对叶角的调控与BR稳态有关。已知BR信号在调控叶角的同时会不可避免的影响籽粒大小,因此对大田收获的成熟期转基因水稻种子进行粒型统计,结果显示,与野生型水稻相比,Os Rac5敲除水稻和Os Rac5过表达水稻的粒长和粒宽均无明显变化,表明Os Rac5基因在调控叶角的同时不影响籽粒大小,说明Os Rac5转基因水稻不具有BR突变体的典型表型。由于前期发现Os Rac5基因敲除水稻育性下降,石蜡切片结果显示,Os Rac5影响了水稻小孢子的晚期发育,为此本研究对敲除水稻幼穗进行了半薄切片,结果显示Os Rac5敲除水稻的小孢子在液泡化小孢子期和2细胞花粉期形态异常,出现月牙形和异常破碎现象。对药壁的发育过程观察发现,Os Rac5敲除水稻的绒毡层未能及时退化,提示该基因与调控绒毡层的适时降解有关。本研究基于实验室前期构建的Os Rac5敲除水稻,进一步构建了Os Rac5过表达水稻,对Os Rac5基因调控叶角的机制开展研究,发现该基因是控制叶枕发育的一个新基因,作用机制涉及叶枕厚壁细胞的增殖和分化过程,并与木质素在次生壁的沉积有关,同时发现该基因在调控叶角中与BR等激素信号存在功能联系。此外,该基因在调控叶角的同时,对粒型没有显著影响,提示该基因在改善水稻株型,提高单位面积产量上可能具有应用前景。

关键词：水稻 osrac5 叶角 BR 粒型

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水稻osrac5基因的表达特性及其功能的初步鉴定

水稻OsRac5基因的表达特性及其功能的初步鉴定

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作者：林群婷河南师范大学

学位级别：硕士

Rop是高等植物中一类分布广泛的小G蛋白，参与植物的多种生理过程的调控，在植物的细胞极性生长、器官发育、免疫，以及环境信号等多种生理过程充当分子开关的作用，介导相关信号向下游的传递。因此对Rop的研究有助于理解植物生长发育... 详细信息

Rop是高等植物中一类分布广泛的小G蛋白，参与植物的多种生理过程的调控，在植物的细胞极性生长、器官发育、免疫，以及环境信号等多种生理过程充当分子开关的作用，介导相关信号向下游的传递。因此对Rop的研究有助于理解植物生长发育调控、生物和非生物胁迫应答、激素信号等过程的分子机制。水稻osrac5是从雌雄蕊形成期的幼穗中分离得到的Rop家族成员。已有的研究提示，该基因可能参与调节水稻光周期育性转换相关的信号转导，涉及水稻的育性控制。但是有关其表达特性和确切的功能尚未见报道。采用实时荧光定量RCR技术，本研究分析了该基因在水稻生长发育的3个典型阶段的不同组织的表达情况，结果显示，osrac5在不同时期的根、茎、叶、以及幼穗均有一定的表达，尤其以在雌雄蕊形成期幼穗中表达量最高，说明该基因与水稻生长发育等多种过程相关，且极有可能与水稻花器官的发育形成密切相关。本研究还检测了ABA、IAA、SA、6-BA、GA以及BR等6种植物激素对osrac5基因表达的影响，检测结果显示，该基因对6种激素均有应答，其中ABA、GA、6-BA显著诱导osrac5基因表达的上调，尤其以ABA、GA诱导osrac5基因表达上调幅度最大;另外植物激素IAA能够显著抑制osrac5基因的表达。该结果提示，osrac5基因可能与多种激素应答过程相关。本研究也进行了干旱、高温、高盐等3种常见的非生物胁迫对osrac5基因的研究。结果表明，干旱、低温、高盐等非生物胁迫也能诱导osrac5基因的表达，但其表达模式具有不同的规律，其中相较于低温，该基因对干旱胁迫的应答更为灵敏，尤其是在地上部分;而在高盐胁迫下，该基因在地上部分的表达呈逐渐上升的趋势，且在处理的24h呈下降趋势，与地上部分相比较，在10h前根中该基因的表达趋势与之相反，但在处理24h时基因的表达显著上调。表达特性分析提示，该基因可能与多种非生物胁迫应答生理过程有关。为鉴定osrac5的生物学功能，以实验室前期构建的激活型的osrac5的过表达植物载体1300-MD转化拟南芥，筛选激活型osrac5过表达的转基因拟南芥，目前已筛选获得F2代的转基因植株，并运用PCR技术进行了相关检测，证实目的基因片段已经整合到拟南芥基因组中，为进一步检测激活型osrac5过表达对拟南芥生长发育的影响奠定基础。采用DNA重组技术，构建了osrac5基因的RNAi载体pANDA-osrac5，并连同实验室前期构建的该基因的野生型和激活型过表达植物载体1300-D和1300-MD分别转化水稻，T0代转基因水稻的筛选工作正在进行中。本研究系统分析了osrac5基因的表达特性，并采用两种经典的转基因体系开展对该基因的功能鉴定，为获得转基因植株后，开展该基因过表达和沉默条件下水稻的表型分析、生理检测和分子鉴定等相关研究奠定基础，将有助于全面解析该基因在水稻生长发育、非生物胁迫和激素应答中的生物学功能。

关键词：水稻 Rop osrac5 表达转基因

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水稻ROP基因osrac5的表达特征

水稻ROP基因OsRac5的表达特征

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2013全国植物生物学大会

作者：林群婷李辉张静梁卫红河南师范大学生命科学学院

Rop(Rho of plants)属于Rho家族的成员,是植物特有的小G蛋白,参与调控植物极性生长、免疫及抗逆应答等多种信号应答过程。本实验室前期工作显示,水稻Rop基因osrac5可能与育性控制有关,但是其表达调控机制尚不清楚。为了进一步研究osrac... 详细信息

Rop(Rho of plants)属于Rho家族的成员,是植物特有的小G蛋白,参与调控植物极性生长、免疫及抗逆应答等多种信号应答过程。本实验室前期工作显示,水稻Rop基因osrac5可能与育性控制有关,但是其表达调控机制尚不清楚。为了进一步研究osrac5基因在水稻发育过程、逆境和激素处理下的表达调控机制,本文采取qRT-PCR技术检测了osrac5在水稻发育过程中,以及幼苗期非生物胁迫、激素对其表达的影响,结果显示:1)osrac5在水稻不同发育阶段不同组织广泛表达,其中osrac5在幼苗期及成熟期的表达变化趋势相似,尤其在根中表达量较高;该基因在雌雄蕊形成期幼穗中的表达量最高,分别是同时期其他组织的26.79～58.59倍;2)干旱、高盐和低温等非生物胁迫均能诱导osrac5的表达,尤其是高盐处理24h时,osrac5在地上部分表达量上调至对照的12.38倍;3)6种激素IAA、GA、ABA、BR、SA及6-BA均能影响osrac5的表达,尤其以ABA、GA诱导osrac5上调幅度最为显著,分别在3.96～14.82倍和24.59～61.87倍之间。本研究发现osrac5在水稻的根与雌雄蕊形成期的幼穗中高表达,提示可能该基因与水稻的极性生长、幼穗发育分化过程相关;该基因与非生物胁迫以及ABA、GA等激素应答相关,提示该基因还可能涉及植物的抗逆、生长发育等多种过程。

关键词：水稻 Rop osrac5 非生物胁迫激素 qRT-PCR

来源： cnki会议评论

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