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内源褪黑素调控水稻叶片衰老的表观遗传机制研究

内源褪黑素调控水稻叶片衰老的表观遗传机制研究

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作者：步清扬州大学

学位级别：硕士

水稻是重要的粮食作物,叶片衰老的调控对于水稻的产量和品质具有重要的意义。褪黑素(N-乙酰5-甲氧基色胺)是一种重要的植物激素,广泛参与植物的生长、发育阶段转换、逆境响应等生命过程的调节。与此同时,褪黑素也是植物衰老过程中的重... 详细信息

水稻是重要的粮食作物,叶片衰老的调控对于水稻的产量和品质具有重要的意义。褪黑素(N-乙酰5-甲氧基色胺)是一种重要的植物激素,广泛参与植物的生长、发育阶段转换、逆境响应等生命过程的调节。与此同时,褪黑素也是植物衰老过程中的重要调控因子,研究表明通过施加外源褪黑素可以有效地延缓植物的衰老进程。然而,内源褪黑素调控水稻叶片衰老的分子机制目前尚不明确。为了阐明内源褪黑素调控水稻叶片衰老的潜在机理,本研究构建了褪黑素合成途径关键基因oscomt的转基因材料,通过表型考察和生理指标测定揭示了oscomt通过合成褪黑素延缓叶片衰老的功能,进一步通过转录组和表观组学测序,揭示了内源褪黑素延缓叶片衰老的分子机制与表观机理。主要研究结果如下:1.通过对黑暗诱导条件下oscomt转基因植株表型考察,发现oscomt-OE株系相比于野生型(WT)褪黑素水平升高,衰老延缓,叶绿素含量增加;而oscomt-Cas9突变体相较于WT褪黑素水平下降,出现早衰表型,且叶绿素含量下降。外源施加褪黑素能够显著回复oscomt-Cas9突变体的早衰表型,其褪黑素水平和叶绿素含量均恢复到WT水平。结果表明内源褪黑素含量降低是oscomt-Cas9突变体提前衰老的原因。2.通过检测氧化还原水平和生理指标,发现oscomt-Cas9突变体相比于WT积累了更多的过氧化氢(H2O2),细胞活性显著降低,且过氧化氢酶(CAT)和过氧化物酶(POD)活性显著降低。表明内源褪黑素水平的降低负调控细胞抗氧化活性,进而导致早衰表型。3.为了明确内源褪黑素调控水稻叶片衰老的分子机制,对oscomt-Cas9突变体和WT水稻幼苗进行转录组测序,差异基因(DEGs)富集分析结果显示oscomt-Cas9突变体相较于WT表达上调的差异基因主要富集在转录调控、RNA合成、胁迫响应途径、信号转导以及茉莉酸信号途径上;而表达下调的差异基因主要富集在光合作用相关途径、蛋白质的生物合成途径、氧化还原过程、脂质和有机酸代谢中。同时,在外源褪黑素处理后oscomt-Cas9突变体的基因表达水平得到了一定的恢复。结果表明在暗诱导叶片衰老过程中,褪黑素含量的降低导致了转录组的显著变化,且褪黑素在叶片衰老的转录重编程中起着重要作用。4.为了明确黑暗诱导叶片衰老过程中内源褪黑素对全基因组DNA甲基化水平的影响,对暗诱导下的WT以及oscomt-Cas9突变体进行了全基因组甲基化测序。结果显示在暗诱导衰老过程中,oscomt-Cas9突变体的CG和CHG甲基化水平相比于WT显著下降,同时CHH甲基化水平发生变化。其中,CG甲基化变化主要发生在基因区域,CHG甲基化变化主要发生在转座子区域,而CHH甲基化变化大量分布于基因启动子区。5.综合分析DNA甲基化变化和基因表达水平变化,发现基因区域CG甲基化的丢失与部分光合作用和碳水化合物代谢相关基因的表达下降相关,而转座子区域的CG和CHG甲基化丢失与转座子相关基因的表达激活相关。结果表明褪黑素通过维持CG和CHG甲基化水平,促进光合作用相关基因表达,抑制转座子相关基因的表达,维护基因组的稳态,从而延缓叶片衰老。此外,CHH差异甲基化与部分衰老相关基因(Senescence Associated Genes,SAGs)和转座子相关基因(TEGs)的表达变化相关,表明褪黑素可能通过调控这些区域的CHH甲基化调控SAGs的表达动态变化,从而影响叶片衰老过程。6.通过测定S-腺苷甲硫氨酸(SAM)含量,发现其水平在oscomt-Cas9突变体中显著低于WT,且其代谢途径相关基因表达水平在oscomt-Cas9突变体中的表达量相比于WT显著下降,而外源褪黑素处理能够显著回复这些基因的表达水平。通过外源SAM处理oscomt-Cas9突变体,其早衰表型和SAGs表达水平均获得了明显回复。结果表明褪黑素可能通过调节SAM的生物合成和代谢来影响DNA甲基化和基因表达水平。7.通过测定各株系不同时期的单株籽粒产量以及叶片光合作用指标,发现oscomt可以通过延缓叶片衰老和提高光合效率促进水稻籽粒产量提升,表明oscomt通过合成褪黑素调控叶片衰老的机制在水稻育种中具有重要的应用价值。综上,本研究发现oscomt-Cas9突变体由于内源褪黑素含量降低,在黑暗诱导条件下相较于WT提前衰老。转录组和DNA甲基化分析表明,褪黑素缺乏通过影响DNA甲基化稳态来调节光合作用和代谢相关基因的表达水平以及基因组稳定性。本研究从表观遗传学的新视角揭示了植物内源褪黑素的调控机制,并为水稻的遗传改良提供了新的参考依据。

关键词：褪黑素衰老水稻表观修饰 oscomt

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一株产褪黑素的工程益生菌Nissle 1917的构建

一株产褪黑素的工程益生菌Nissle 1917的构建

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作者：王林林吉林大学

学位级别：硕士

睡眠对于动物来说至关重要,睡眠剥夺将导致肠道内活性氧积累。活性氧是肠炎、肿瘤等肠道疾病的诱因之一,严重危害人体健康。褪黑素是一种强抗氧化剂,可以有效清除活性氧。肠道是合成和储存褪黑素的重要场所,睡眠剥夺导致肠道内褪黑素浓... 详细信息

睡眠对于动物来说至关重要,睡眠剥夺将导致肠道内活性氧积累。活性氧是肠炎、肿瘤等肠道疾病的诱因之一,严重危害人体健康。褪黑素是一种强抗氧化剂,可以有效清除活性氧。肠道是合成和储存褪黑素的重要场所,睡眠剥夺导致肠道内褪黑素浓度下降,使得活性氧的积累无法被阻止。因此,睡眠剥夺的人群需要额外补充褪黑素。褪黑素又是一种荷尔蒙,可以导致注意力不集中、困倦和体温降低,并不利于熬夜的人群维持工作状态。因为活性氧的积累是个缓慢的过程,服用褪黑素的量应该与活性氧的产生速度一致,否则过量褪黑素会进入血液,带来副作用。益生菌工程化作为功能分子载体具有定点、持续和可控的优势,它有望成为维护熬夜人群肠道健康,且不影响其工作状态的新手段。已报道的具有产褪黑素能力的微生物数量有限,且存在生物安全性问题。以Nissle1917(EcN)为代表的工程益生菌底盘菌,目前尚未见其可以产褪黑素的报道。本课题拟通过基因工程和蛋白质工程的手段,以EcN为底盘菌去开发利用血清素合成褪黑素的新基因工程菌。本研究的主要内容和研究结果如下:(1)单表达Psmf和oscomt基因工程EcN的构建和全细胞催化(whole-cell biocatalysis)的研究。动物通常以色氨酸为底物,通过四个级联反应合成褪黑素。该过程的第二个代谢中间产物血清素可在肠道内大量产生和分泌,为了使褪黑素的合成途径最短,我们选择Psmf和oscomt,去构建利用血清素合成褪黑素的代谢通路。Psmf(源于Streptomyces griseofuscus的Psmf基因簇)和oscomt(源于Oryza sativa,编码O-methyltransferase)编码的蛋白是该级联反应的最后两步反应的关键酶,其中,Psmf催化血清素转化成N-乙酰血清素的反应,oscomt催化N-乙酰血清素转化为褪黑素的反应。为了探究两基因在EcN中的外源表达情况及表达后活性,我们构建了p BAD-Psmf、p BAD-oscomt表达载体,分别导入到EcN中进行诱导表达和全细胞的催化并与野生型EcN进行对比,探究Psmf和oscomt能否表达和表达后的蛋白活性。结果表明,EcN能够通过诱导表达这两种基因编码的蛋白;1000μg/m L血清素作为单表达Psmf的基因工程菌EcN的全细胞催化的底物,其产物中N-乙酰血清通过HPLC检测,终浓度可达到807.63±25.46μg/m L;100μg/m L N-乙酰血清素作为单表达oscomt的基因工程EcN的全细胞催化的底物,其产物中的褪黑素通过HPLC检测,终浓度可达到3.80±0.25μg/m L。野生型EcN的全细胞催化产物中没有检测到相关物质,表明野生型EcN不具有将血清素转化为N-乙酰血清素和将N-乙酰血清素转化为褪黑素的能力,这同时证明了Psmf和oscomt在EcN中表达后具有活性。(2)共表达Psmf和oscomt基因工程EcN的构建和全细胞催化的研究。为了在EcN中构建以血清素为底物合成褪黑素的代谢通路,我们构建了Psmf和oscomt的共表达体系,探究了Psmf和oscomt共表达后的联合催化活性。Psmf和oscomt的共表达体系是通过构建它们单一转录单元的共表达载体得到。由于单一转录单元的共表达载体启动下游基因顺序与它们的表达相关,我们构建了p BAD-Psmf-oscomt和p BAD-oscomt-Psmf,分别导入EcN中探究Psmf和oscomt的共表达情况并分别进行全细胞的催化探究Psmf和oscomt共表达后的联合催化活性。分别带这两种共表达载体的EcN均可以表达Psmf和oscomt,表明共表达载体构建成功,然而,它们表达的差异并不明显;带有p BAD-oscomt-Psmf的EcN中在1000μg/m L血清素的条件下,可合成645.6±13.4μg/m L N-乙酰血清素和7.8±0.15μg/m L褪黑素。由于带有p BAD-oscomt-Psmf的EcN全细胞催化产物中褪黑素的产率高于带有p BAD-Psmf-oscomt的EcN,带有p BAD-oscomt-Psmf的EcN被用于后续实验。(3)共表达Psmf和oscomt基因工程EcN全细胞催化产褪黑素产率优化的研究。oscomt为级联酶促产褪黑素过程中的限速酶,与Psmf相比其活性远不能满足级联酶促反应的需要。为了进一步提高褪黑素全细胞催化的产量,我们通过对已报道的COMT进行序列比对和结构分析,利用蛋白质工程手段对oscomt进行了改造,提高了其转化N-乙酰血清素的能力,进而提高了共表达Psmf和突变oscomt基因工程EcN全细胞催化产褪黑素的产率。与未进行优化的基因工程EcN相比,以1000μg/m L血清素为底物进行全细胞的催化,褪黑素的产量提高了1倍左右,达到14.7±0.6μg/m L。综上所述,本研究构建了Psmf和oscomt单表达和共表达基因工程EcN,

关键词：睡眠工程益生菌褪黑素 Nissle1917 Psmf oscomt

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