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水稻osbri1基因启动子的克隆及功能分析

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水稻OsBRI1基因启动子的克隆及功能分析

作者：田翠霞山东农业大学

学位级别：硕士

油菜素内酯(Brassinosteroids,BRs)是一种广泛存在于植物中的类固醇激素,已有的研究发现BRs有70多种,其中在被子植物中发现的最具活性的两类BRs为BL和CS。研究表明BRs是通过位于细胞膜上的跨膜类受体蛋白激酶BRI1感知和传递信号,进而激... 详细信息

油菜素内酯(Brassinosteroids,BRs)是一种广泛存在于植物中的类固醇激素,已有的研究发现BRs有70多种,其中在被子植物中发现的最具活性的两类BRs为BL和CS。研究表明BRs是通过位于细胞膜上的跨膜类受体蛋白激酶BRI1感知和传递信号,进而激活下游基因的表达,调控植物生长发育的整个过程。通过GUS染色发现拟南芥AtBRI1在根部、叶柄、叶片、茎、花等组织中表达很高。RT-PCR检测结果也发现AtBRI1在拟南芥的整个植物体内均广泛表达,但RT-PCR检测水稻的osbri1发现其在根部表达不明显。因此BRI1在水稻和拟南芥中的表达存在差异,这种差异是基因本身造成的,还是由于启动子区的差异引起的呢?为了探究其原因,我们以十字花科和禾本科物种为研究对象,首先对十字花科和禾本科BRI1基因序列进行比对,发现BRI1的编码基因比较保守;随后对其启动子区进行了分析,发现其启动子序列存在多样性。因此推测,启动子区的多态性可能导致了BRI1蛋白在水稻和拟南芥中表达的差异。为此,我们克隆了水稻osbri1基因启动子并转化拟南芥,比较其与AtBRI1启动子的表达模式差异,探究BRI1蛋白在水稻和拟南芥中表达差异的原因。试验获得主要结果如下:1.本试验首先对十字花科、禾本科植物BRI1编码基因及其启动子序列进行生物信息学分析,得到BRI1的编码序列在这两科间保守,而启动子序列存在多样性。2.利用PlantCARE和PLACE网站上分析osbri1启动子含有的顺式作用元件,发现该序列含有多个启动子的基本元件TATA-box和CAAT-box,包含多种植物激素响应元件,如油菜素内酯响应元件、生长素响应元件、脱落酸响应元件及水杨酸响应元件;还包含多种植物逆境胁迫响应元件,如热激应答元件、干旱诱导相关的MYB结合位点及防卫和胁迫响应相关元件。同时还含有很多跟光响应相关的元件,如G-box、Sp1、GAG-motif等。3.使用PCR技术,根据已经公布的水稻日本晴基因序列,结合表达载体pCambia2300-GUS上的酶切位点,设计引物克隆得到水稻osbri1启动子,并成功将其与植物表达载体pCambia2300-GUS连接,转化,通过抗性筛选,得到转基因拟南芥。***染色表明,水稻osbri1启动子具有驱动GUS基因在拟南芥中广泛表达的活性。与已报道的拟南芥AtBRI1启动子在拟南芥上的表达模式没有明显差异,只是在根部没有AtBRI1启动子的表达量高,推测可能由于某些顺式作用元件来调控基因表达量的高低。

关键词：水稻 osbri1 启动子克隆功能验证

Phenotypic analysis and molecular characterization of an allelic mutant of the D61 gene in rice

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The Crop Journal 2014年第4期2卷 175-182页

作者： Yanan Gao Guangquan Wang Shoujiang Yuan Yanling Qin Jinfeng Zhao Yanpei Zhang Wenhui Zhang Xueyong Li College of Life Sciences Liaocheng University National Key Facility for Crop Gene Resource and Genetic Improvement Institute of Crop Science Chinese Academy of Agricultural Sciences Shandong Rice Research Institute College of Agriculture Shandong Agricultural University

Brassinosteroids(BRs) are a class of plant-specific steroidal hormones that play important roles in multiple biological processes. In this paper, a classic rice mutant gsor300084,showing erect leaves and semi-dwarf stature, was characterized. Morphological analysis in darkness showed that the mesocotyl of the gsor300084 mutant did not elongate when grown in darkness. Coleoptile elongation and root growth were less affected by the exogenous application of brassinolide(BL), the most active form of BR, in gsor300084 than in the wild-type rice variety Matsumae. Lamina joint bending analysis also showed that gsor300084 was less sensitive to exogenous BL than Matsumae. These results suggested that the gsor300084 mutant is defective in BR sensitivity. Map-based cloning indicated that gsor300084 is a novel allelic mutant of the DWARF61(D61) gene, which encodes the putative BR receptor osbri1. A single-base mutation appears in the LRR domain of osbri1, changing the 444 th amino acid from tryptophan(W) to arginine(R). Subcellular localization analysis suggested that both the wild-type and mutant osbri1 protein are localized at the cytoplasmic membrane. Structure modeling revealed that the W444 R substitution may affect the perception of BRs by the LRR domain.

关键词： Rice Dwarf Brassinosteroid D61 osbri1

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水稻BRI1启动子克隆与表达载体构建

山东农业科学 2016年第8期48卷 1-4,9页

作者：田翠霞魏强李宪彬山东农业大学作物生物学国家重点实验室/山东省作物生物学重点实验室山东泰安271018 陕西师范大学生命科学学院陕西西安710069

为探究拟南芥和水稻BRI1基因差异表达的原因,本研究克隆了Os BRI1启动子,并将其构建在植物表达载体p Cambia2300-GUS上,为进一步转化拟南芥或其他植物并研究其表达模式奠定了基础。

关键词：水稻油菜素内酯 osbri1

BR信号途径关键基因在水稻抗病和产量相互关系中的作用机制研究

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BR信号途径关键基因在水稻抗病和产量相互关系中的作用机制研究

作者：覃晓锋华中农业大学

学位级别：硕士

油菜甾醇类物质(BRs)是植物生长发育必需的一类植物激素。在水稻中,BRs可直接与细胞膜表面的类受体激酶Os BRIl结合,类受体激酶Os BAK1可与Os BRIl互作形成BR的共受体,最终激活的BR信号下游的转录因子进核调控相关基因的表达以调控水稻... 详细信息

油菜甾醇类物质(BRs)是植物生长发育必需的一类植物激素。在水稻中,BRs可直接与细胞膜表面的类受体激酶Os BRIl结合,类受体激酶Os BAK1可与Os BRIl互作形成BR的共受体,最终激活的BR信号下游的转录因子进核调控相关基因的表达以调控水稻生长、发育、繁殖和防御反应等。既然BR信号同时参与调控水稻的生长发育和抗病反应,那么,我们是否可以通过精细调控BR信号中的相关组分,实现对水稻抗病性和产量的改良呢?为了研究BR路径对水稻抗病性和产量的影响,我们分别对Os BZR1-RNAi植株和Os BRI1基因突变体d61-1植株接种白叶枯病菌和细菌性条斑病菌,结果表明:相比野生型,Os BZR1-RNAi植株和d61-1植株对白叶枯病和细菌性条斑病的抗性增强。Os BZR1-RNAi植株的单株产量明显下降。通过CRISPR/Cas9基因编辑技术,我们创建了Os BRI1基因新的突变体d61-10。与野生型相比,d61-10突变体对白叶枯病菌、细菌性条斑病菌和稻瘟菌的抗性增强,且单株产量在统计学上没有改变。我们同样利用CRISPR/Cas9技术创建了Os BAK1基因的突变体osbak1。虽然osbak1突变体对这些病原菌的广谱抗性增强,但是该突变体的单株产量下降。外源喷施BR抑制水稻对这些病原菌的广谱抗性。总之,本研究不仅创建了对病原菌具有广谱抗性且单株产量在统计学上不受影响的突变体d61-10,而且证明了外源BR抑制水稻对病原菌的广谱抗性。本研究的结果为进一步通过精细调控BR信号路径的相关组分,创建更多的抗病性增强、产量不变甚至增加的水稻材料提供了依据和思路。

关键词：油菜素甾醇 osbri1 OsBAK1 OsBZR1 抗病反应茉莉酸

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两个水稻器官大小相关基因的克隆和功能分析

两个水稻器官大小相关基因的克隆和功能分析

作者：管柳蓉海南大学

学位级别：硕士

水稻(Oryza sativa.L)作为最重要的谷物粮食之一,是全世界超过一半人口的主要食物来源。影响水稻产量的三大主要因素是穗数、每穗粒数和粒重,而粒重受水稻籽粒大小和灌浆过程调控。灌浆过程中,碳水化合物在光合组织合成,运输到籽粒,这... 详细信息

水稻(Oryza sativa.L)作为最重要的谷物粮食之一,是全世界超过一半人口的主要食物来源。影响水稻产量的三大主要因素是穗数、每穗粒数和粒重,而粒重受水稻籽粒大小和灌浆过程调控。灌浆过程中,碳水化合物在光合组织合成,运输到籽粒,这一过程直接决定了水稻粒重,而叶片又是水稻进行光合作用的主要场所。因此,水稻籽粒大小和叶型均是影响水稻产量的关键农艺性状,筛选及研究水稻籽粒大小和叶型相关突变体对于提高粮食产量至关重要。本研究通过EMS诱变,筛选得到一个水稻小粒突变体smg12和窄叶突变体w448,并对其候选基因进行克隆和初步功能分析,结果如下:(1)在海南陵水农场和北京昌平农场大田环境种植,突变体smg12相较于野生型籽粒变小、叶片直立、一级枝梗数和二级枝梗数减少、千粒重显著性降低。突变体w448表现为叶片变窄、株高变矮,籽粒变小且穗粒数减少、千粒重显著性降低。(2)对两个突变体进行遗传分析,将两个突变体分别与野生型KYJ回交得到F代,再分别自交产生F代分离群体。数据显示突变体smg12的F代中野生型和小粒突变体表型植株数比例接近3:1,突变体w448的F代中野生型和窄叶突变体植株数比例也接近3:1,卡方适合性测试进一步说明突变体smg12和突变体w448均受一个隐性单基因控制。(3)利用冷冻扫描电子显微镜分别观察smg12突变体的籽粒颖壳表面和w448突变体成熟期剑叶的1/2处横截面,数据结果显示突变体smg12较野生型颖壳的纵向细胞长度明显小于野生型,而细胞数目不变。突变体w448较野生型剑叶横截面的细胞数目显著性降低,而细胞大小不变。说明SMG12通过影响细胞大小来改变水稻籽粒大小,W448通过影响细胞数目调控叶片宽度。(4)利用Mutmap方法对两个突变体的候选基因克隆,并设计dCAPS标记进行验证。根据测序结果推测smg12的候选基因可能为osbri1,且smg12的突变发生在osbri1外显子的第2074个碱基处,发生了由C到T的碱基置换,使得跨膜结构域上该位置编码的丝氨酸变为脯氨酸。突变体w448的候选基因可能为NAL9,且w448的突变发生在NAL9外显子的第965个碱基处,由G突变为A,使得该位置编码的丝氨酸变为苯丙氨酸。(5)通过Luciferase实验和GST-pull down实验证明窄叶基因NAL9和宽叶基因DST能相互作用,因此我们初步推测NAL9和DST在调控叶片宽度时可能作用在同一条信号通路。

关键词：水稻籽粒大小窄叶 Mutmap osbri1 NAL9 DST

一个水稻D61基因等位突变体的表型分析及分子鉴定

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一个水稻D61基因等位突变体的表型分析及分子鉴定

作者：高雅楠聊城大学

学位级别：硕士

水稻是世界上重要的粮食作物之一，随着世界人口的增多，培育高产的水稻品种成为一个重要的育种目标。水稻的株高，尤其是水稻矮生性状的研究可以为选育理想株型提供理论依据，对培育高产水稻品种具有重要意义。已有的研究表明，植物的... 详细信息

水稻是世界上重要的粮食作物之一，随着世界人口的增多，培育高产的水稻品种成为一个重要的育种目标。水稻的株高，尤其是水稻矮生性状的研究可以为选育理想株型提供理论依据，对培育高产水稻品种具有重要意义。已有的研究表明，植物的株高主要受到赤霉素(Gibberellin,GA)和油菜素类固醇(Brassinosteroid,BR)影响，与赤霉素和油菜素类固醇生物合成与信号传导途径相关的基因突变后均能造成植株的矮化。油菜内酯是一种甾醇类植物生长调节剂(BRs)，在生物生长发育的多个进程中扮演着重要角色。本文介绍了一个具有直立叶片的典型半矮秆水稻突变体gsor300084。黑暗条件下的形态建成分析显示，突变体gsor300084的中胚轴在黑暗条件下不会伸长。对野生型施加外源油菜素内酯（BL）后，其胚芽鞘和根的伸长幅度与未施加BL的野生型相比有显著的变化。然而，BL对突变体gsor300084的胚芽鞘和根的伸长幅度不会产生影响，这说明突变体gsor300084对BL不敏感。叶夹角分析结果也显示,突变体gsor300084对BL的敏感程度不及野生型。采用BSA(Bulked SegregationAnalysis)法，利用突变体与籼稻品种Dular杂交构建的F2群体进行基因定位，并且克隆了该基因，通过Rice GenomeAnnotation Project(水稻基因组注释系统)网站预测分析表明，gsor300084的突变基因是DWARF61(D61)基因的一个新的等位突变基因，突变发生在osbri1LRRs结构域的单个碱基,使其编码的第444位的氨基酸由色氨酸(W)变为精氨酸(R)。D61编码BRs的受体osbri1。利用在水稻原生质体中转入瞬时表达载体的亚细胞定位分析表明,野生型和突变体所编码的osbri1蛋白都定位在细胞膜上。通过PyMOL软件比对由CBS Prediction Servers网站预测(http://***/services/)的野生型与突变体的电脑结构模拟图，发现W444R替换可能会影响LRRs结构域对BRs的识别，从而导致BRs信号传导的中断，使得突变体表现出矮杆表型。

关键词：水稻矮杆油菜素内酯 D61 osbri1