检索结果-南通市图书馆

作者：郑罗凝浙江理工大学

学位级别：硕士

目的采用Opti Prep密度梯度离心结合免疫磁珠负向筛选法富集循环肿瘤细胞(Circulating Tumor Cell,CTC),并联合多色免疫荧光标记和荧光原位杂交技术检测CTC,建立一种简易高效的富集和鉴定癌症患者外周血CTC的方法,有效应用于临床肿瘤患... 详细信息

目的采用Opti Prep密度梯度离心结合免疫磁珠负向筛选法富集循环肿瘤细胞(Circulating Tumor Cell,CTC),并联合多色免疫荧光标记和荧光原位杂交技术检测CTC,建立一种简易高效的富集和鉴定癌症患者外周血CTC的方法,有效应用于临床肿瘤患者外周血的CTC计数检测。在此基础上,进一步探索建立单细胞捕获技术平台,对特定CTC细胞或者CTC细胞群进行单细胞组学的研究。显微镜观察到CTC后进行显微切割和显微吸取以获取单细胞进行分子鉴定,这一研究将促进CTC的分子鉴定,开发新的治疗靶点,并产生对癌症患者更有效的治疗方案。方法1.利用不同密度细胞的沉降系数不同,配比不同浓度的Opti Prep溶液梯度离心分离外周血各细胞成分,验证单核细胞聚集细胞层。分别选取QGY-7701等多种肿瘤细胞混入外周血,模拟体内循环肿瘤细胞状态。比较Opti Prep液与Ficoll液富集肿瘤细胞的效率、回收率、活性率。密度梯度离心结合免疫磁珠建立最优的循环肿瘤细胞富集体系。2.选取5种肿瘤细胞株:肝癌细胞(QGY-7701、Huh-7、SMMC-7721)、卵巢癌细胞HO-8910、肺癌细胞A549分别进行CD45和CK18两种抗体的细胞免疫荧光染色,CIK细胞作对照。FISH标记CIK细胞染色体数目。将肿瘤细胞混入正常人外周血模拟外周血循环肿瘤细胞进行富集,免疫荧光技术结合FISH检测,准确识别肿瘤细胞。3.联合富集和检测方法精确检测癌症患者的外周血循环肿瘤细胞,进行方法学验证评估。并根据患者CTC检测数目和临床预后数据分析我们建立的CTC检测对于肿瘤患者预后判断的作用。4.尝试显微切割和显微吸取提取单个靶细胞及较纯的目的细胞群,应用Carl Zeiss PALM Combi System和Cell Ector Plus两大系统捕获单个细胞,并进行RT-PCR检测肿瘤细胞的基因表达情况。结果*** Prep液能有效分离单核细胞,将QGY-7701肿瘤细胞富集于白膜层。肝癌细胞(QGY-7701、Huh-7、SMMC-7721)、卵巢癌细胞HO-8910、肺癌细胞A549在Opti Prep中肿瘤细胞的富集效率均高于Ficoll,两组间差异均有统计学意义(P<0.05)。单细胞操作取50个左右肿瘤细胞入血模拟循环肿瘤细胞,比较Opti Prep与Ficoll的回收率较一致。2.免疫荧光结果显示,仅CIK细胞观察到CD45红色荧光,而CK18则是仅CIK细胞无绿色荧光。荧光原位杂交结果表明能显著标记细胞染色体,以此识别染色体异常细胞。3.通过对33例入组患者外周血的检验验证以上富集和检测循环肿瘤细胞的方法,均发现有循环肿瘤细胞的存在,说明建立的这一方法能有效检出癌症患者血液中的CTC。实验结果显示,CTC数量较多对应较短生存期,较差预后。4.本研究根据实验需要,涉及两种可识别荧光标记的单细胞获取技术,结果显示均能迅速准确的得到单个目的细胞,解决细胞异质性问题,获取纯净靶细胞,进而为少量CTC的下一步分子鉴定提供了机会,显示了良好的应用前景。结论本研究成功建立了Opti Prep密度梯度离心结合免疫磁珠负向筛选法富集CTC,并联合多色免疫荧光标记结合荧光原位杂交技术检测CTC,有效应用于临床肿瘤患者外周血的CTC鉴定。另外,尝试单细胞捕获新技术获取稀有循环肿瘤细胞,为后续单细胞目的基因表达鉴定和进一步的基因测序研究探寻方向,为癌症的预后及预测信息指明方向、为个体化指导治疗和用药的合理选择提供参考。

关键词：循环肿瘤细胞 optiprep分离介质密度梯度离心法细胞免疫荧光染色荧光原位杂交技术单细胞捕获

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基于optiprep的循环肿瘤细胞富集体系研究

引用

浙江理工大学学报（自然科学版） 2015年第5期33卷 699-705页

作者：郑罗凝徐增辉王真钱其军浙江理工大学生命科学学院杭州310018 第二军医大学东方肝胆外科医院上海200438

建立一种简易高效的外周血循环肿瘤细胞(circulating tumor cell,CTC)富集方法。配比不同浓度的optiprep溶液梯度离心分离外周血各细胞成分,比较optiprep液与现行Ficoll液富集肿瘤细胞的效率、回收率、活性率。以此系统富集肿瘤患者血... 详细信息

建立一种简易高效的外周血循环肿瘤细胞(circulating tumor cell,CTC)富集方法。配比不同浓度的optiprep溶液梯度离心分离外周血各细胞成分,比较optiprep液与现行Ficoll液富集肿瘤细胞的效率、回收率、活性率。以此系统富集肿瘤患者血样中的CTC,结合免疫磁珠筛选、染色体原位荧光杂交和表面抗原免疫荧光技术精确鉴定CTC细胞。结果显示optiprep液以1.079g/mL的密度浓度在1 900r/min离心20min为最优分离条件。32例临床肿瘤患者血样的CTC检测实验中,均发现有循环肿瘤细胞的存在。结果表明基于optiprep液结合免疫磁珠筛选能有效富集外周血循环肿瘤细胞,为实验室常规开展CTC的计数、培养等研究奠定基础。

关键词： optiprep分离介质密度梯度离心法循环肿瘤细胞免疫磁珠

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