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哈维氏弧菌外膜蛋白ompk基因的克隆及原核表达

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水产学报 2006年第1期30卷 9-14页

作者：张崇文于涟毛芝娟褚武英钱荣华浙江大学生物医学工程学院浙江大学动物预防医学研究所

根据哈维氏弧菌外膜蛋白ompk的基因序列设计一对引物,应用聚合酶链式反应(PCR)方法,从分离自患病大黄鱼的哈维氏弧菌基因组中扩增获得一段约800bp的序列。将其克隆到pGEMTeasy载体,测序结果证明该序列是哈维氏弧菌外膜蛋白ompk基因。用... 详细信息

根据哈维氏弧菌外膜蛋白ompk的基因序列设计一对引物,应用聚合酶链式反应(PCR)方法,从分离自患病大黄鱼的哈维氏弧菌基因组中扩增获得一段约800bp的序列。将其克隆到pGEMTeasy载体,测序结果证明该序列是哈维氏弧菌外膜蛋白ompk基因。用PCR方法去除其信号肽序列,定向克隆到原核表达载体pGEX4T2构建重组表达质粒pGEX4Tompk。IPTG诱导后能够在大肠杆菌BL21中高效表达分子量约为53kD的GSTompk融合蛋白。用纯化后的融合蛋白免疫新西兰兔获得了高效价的抗血清。Westernblotting分析表明,它与从哈维氏弧菌中提取的约27kD的外膜蛋白能够发生特异反应,提示外膜蛋白ompk可能是哈维氏弧菌的重要保护性抗原之一。

关键词：哈维氏弧菌外膜蛋白 ompk 原核表达

鱼类4种病原弧菌耐药性及主要外膜蛋白ompk基因检测

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海洋湖沼通报 2009年第3期 98-104页

作者：张晓君阎斌伦秦国民秦蕾徐静淮海工学院江苏省海洋资源开发研究院江苏省海洋生物技术重点实验室江苏连云港222005

对鱼源4种病原弧菌(鳗弧菌、哈氏弧菌、鱼肠道弧菌、秦皇岛弧菌)进行了对常用抗菌类药物的耐药性测定,结果表明,鳗弧菌对青霉素G、苯唑青霉素、氨苄青霉素、克林霉素、万古霉素、杆菌肽等6种常用药物耐药;哈氏弧菌对青霉素G、苯唑青霉... 详细信息

对鱼源4种病原弧菌(鳗弧菌、哈氏弧菌、鱼肠道弧菌、秦皇岛弧菌)进行了对常用抗菌类药物的耐药性测定,结果表明,鳗弧菌对青霉素G、苯唑青霉素、氨苄青霉素、克林霉素、万古霉素、杆菌肽等6种常用药物耐药;哈氏弧菌对青霉素G、苯唑青霉素、氨苄青霉素、杆菌肽等4种常用药物耐药;鱼肠道弧菌对苯唑青霉素和杆菌肽等2种耐药;秦皇岛弧菌对青霉素G、苯唑青霉素、氨苄青霉素、克林霉素、杆菌肽等5种耐药。根据已知的弧菌外膜蛋白ompk序列设计1对简并引物,利用聚合酶链式反应(PCR)方法从4种病原弧菌总DNA中均扩增外膜蛋白ompk的基因片断,结果鳗弧菌、哈氏弧菌、秦皇岛弧菌及鱼肠道弧菌均扩增得到约800bp DNA片段,但鱼肠道弧菌扩增的片段较模糊。

关键词：弧菌耐药性外膜蛋白 ompk

鲍曼不动杆菌ompk/Omp22融合蛋白的制备及诱导小鼠抗体应答水平检测

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中国生物制品学杂志 2018年第11期31卷 1188-1191页

作者：郭三君任珊谢勇恩川北医学院免疫与分子生物研究所四川南充637000

目的制备鲍曼不动杆菌ompk/Omp22融合蛋白,并检测其抗原特异性抗体应答水平。方法以鲍曼不动杆菌标准株19606基因组DNA为模板,通过重叠延伸PCR技术获取ompk/Omp22融合基因片段,将其定向克隆入原核表达质粒pColdI,筛选重组质粒并进行酶切... 详细信息

目的制备鲍曼不动杆菌ompk/Omp22融合蛋白,并检测其抗原特异性抗体应答水平。方法以鲍曼不动杆菌标准株19606基因组DNA为模板,通过重叠延伸PCR技术获取ompk/Omp22融合基因片段,将其定向克隆入原核表达质粒pColdI,筛选重组质粒并进行酶切及DNA测序鉴定。重组质粒转化大肠埃希菌BL21株,经IPTG诱导表达,镍亲和纯化柱纯化重组蛋白。小鼠背部皮下注射重组融合蛋白(20μg/只,体积50μL)和等体积完全弗氏佐剂,并于初次免疫后第14和21天相同剂量加强免疫1次,分别于末次免疫后7、21 d小鼠内眦取血,测定小鼠血清中抗原特异性抗体滴度。结果 PCR扩增获得约1 400 bp的基因片段,定向克隆筛选到约5 800 bp的重组质粒,纯化的重组融合蛋白相对分子质量约52 000,小鼠血清中检测到特异性IgG抗体,最高抗体滴度可达1∶102 400。结论成功制备了鲍曼不动杆菌ompk/Omp22融合蛋白,小鼠血清中检测到高滴度特异性IgG抗体,为进一步研究其免疫活性奠定了基础。

关键词：鲍曼不动杆菌 ompk Omp22 融合蛋白抗体应答

副溶血弧菌外膜蛋白ompk免疫磁珠检测方法的建立

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生物技术通报 2013年第6期29卷 209-214页

作者：李雨辰闻一鸣童吉宇向军俭暨南大学抗体工程研究中心广东省分子免疫与抗体工程重点实验室广州510632

构建重组基因克隆表达副溶血弧菌外膜蛋白ompk并制备多克隆抗体,建立副溶血弧菌的免疫磁珠富集,结合化学显色检测方法。利用生物软件Primer 5设计副溶血弧菌ompk基因的引物,通过PCR扩增出ompk基因,并将其克隆至pET28a(+)原核表达载体,... 详细信息

构建重组基因克隆表达副溶血弧菌外膜蛋白ompk并制备多克隆抗体,建立副溶血弧菌的免疫磁珠富集,结合化学显色检测方法。利用生物软件Primer 5设计副溶血弧菌ompk基因的引物,通过PCR扩增出ompk基因,并将其克隆至pET28a(+)原核表达载体,转化至大肠杆菌BL21进行优化表达。镍柱纯化表达产物,免疫小鼠,制备其多克隆抗体。Western blot鉴定重组蛋白,ELISA分析其免疫原性。间接ELISA检测多抗效价及交叉性,并与protein G磁珠偶联结合显色平板检测副溶血弧菌。结果显示,成功表达ompk蛋白;免疫小鼠获得特异性抗血清,效价为1∶64 000;Western blotting证明抗血清能与副溶血弧菌28 kD处条带特异性结合。制备的免疫磁珠敏感度最高能达到104CFU/mL。成功克隆表达副溶血弧菌外膜蛋白ompk并制备副溶血弧菌特异性鼠多克隆抗体,建立的免疫磁珠检测方法与显色平板法结合较传统的二次增菌法能够节省72 h,整个过程只需要传统方法时间的1/3;相比于常用的免疫学检测方法检测灵敏度提高两个数量级。

关键词：副溶血弧菌 ompk 多克隆抗体免疫磁珠

鲍曼不动杆菌外膜蛋白ompk的原核重组表达与纯化

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中国病原生物学杂志 2017年第9期12卷 837-839页

作者：郭三君任珊谢勇恩川北医学院免疫与分子生物学研究所四川南充637007

目的通过分子克隆方法制备重组鲍曼不动杆菌外膜蛋白K(ompk)并进行纯化,为进一步研究该蛋白的免疫活性奠定基础。方法采用PCR方法扩增鲍曼不动杆菌标准菌株ATCC19606外膜蛋白K编码基因,将该基因克隆入原核表达载体pColdI,构建重组质粒pC... 详细信息

目的通过分子克隆方法制备重组鲍曼不动杆菌外膜蛋白K(ompk)并进行纯化,为进一步研究该蛋白的免疫活性奠定基础。方法采用PCR方法扩增鲍曼不动杆菌标准菌株ATCC19606外膜蛋白K编码基因,将该基因克隆入原核表达载体pColdI,构建重组质粒pColdI/ompk。将重组质粒转化至大肠埃希菌BL21,经IPTG诱导表达重组蛋白,通过镍亲和层析柱进行纯化。结果 PCR扩增获得大小约726bp的目的基因片段,将其克隆入原核表达载体pColdI后进行酶切和DNA测序分析,pColdI/ompk构建正确,重组质粒转化BL21经IPTG诱导后表达目的蛋白(相对分子质量约30×103),经镍亲和纯化得到高纯度的重组ompk。结论通过分子克隆技术使鲍曼不动杆菌ompk蛋白在构建的原核表达系统中得到高效表达,并获得了高纯度的重组蛋白,为进一步研究鲍曼不动杆菌ompk的免疫活性奠定了基础。

关键词：鲍曼不动杆菌 ompk 表达纯化

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弧菌外膜蛋白ompk免疫交叉反应性的分析

汕头大学学报（自然科学版） 2013年第3期28卷 52-63页

作者：伦镜盛袁传飞夏常艳王娅琴郭川黄通旺胡忠汕头大学生物系微生物实验室广东汕头515063 汕头市疾病预防控制中心广东汕头515041

本研究旨在研究弧菌外膜蛋白（oute rmembrane protein，OMP）ompk免疫交叉反应的特征，探讨ompk免疫交叉反应性的分子机制．利用克隆得到5株弧菌的ompk基因，通过比对10种（22株）弧菌的ompk基因序列发现，ompk基因在弧菌中高度保守，... 详细信息

本研究旨在研究弧菌外膜蛋白（oute rmembrane protein，OMP）ompk免疫交叉反应的特征，探讨ompk免疫交叉反应性的分子机制．利用克隆得到5株弧菌的ompk基因，通过比对10种（22株）弧菌的ompk基因序列发现，ompk基因在弧菌中高度保守，其核苷酸序列的相似性达77％～93％．对副溶血弧菌（***）VPL4—90的ompk基因进行原核表达，利用纯化的ompk重组蛋白，制备了兔抗ompk血清．通过westernblot分析发现，ompk抗血清能够与16种不同的弧菌发生交叉识别反应，其中***、***、***和***这4种弧菌ompk的免疫交叉反应为首次报道，并且证实弧菌ompk的免疫交叉反应具有种属特异性．通过抗原表位预测和比对发现，弧菌的ompk具有8个保守的抗原表位，包括7个T细胞表位以及1个T细胞和B细胞的共同表位．流式细胞术分析显示，ompk抗体能够识别这些相同或相似的抗原表位，提示这些抗原表位可能位于细菌表面．结果表明，这些保守的且位于细胞表面的ompk抗原表位可能是弧菌ompk具有免疫交叉反应性的分子基础．

关键词：弧菌外膜蛋白 ompk 免疫交叉反应性

基于载体减毒单增李斯特菌的弧菌疫苗菌株构建

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中国免疫学杂志 2017年第9期33卷 1281-1285,1290页

作者：丁承超陈国薇谢曼曼郭亮李杰孙静娟刘箐上海理工大学医疗器械与食品学院上海200093

目的:利用减毒单增李斯特菌作为疫苗载体的优势,拟构建基于载体减毒单增李斯特菌的弧菌疫苗菌株。方法:使用单增李斯特菌表达载体p ERL3过表达弧菌中共同的靶标抗原ompk;利用PCR和RT-PCR技术分别对过表达菌株鉴定和抗原基因的检测。结果... 详细信息

目的:利用减毒单增李斯特菌作为疫苗载体的优势,拟构建基于载体减毒单增李斯特菌的弧菌疫苗菌株。方法:使用单增李斯特菌表达载体p ERL3过表达弧菌中共同的靶标抗原ompk;利用PCR和RT-PCR技术分别对过表达菌株鉴定和抗原基因的检测。结果:PCR结果显示成功构建3株ompk过表达菌株Lm-ompk(L-O)、Lm-Lmo0576-ompk(L-L-O)和Lm-P-ompk(L-P-O);测序结果显示过表达菌株中外源基因的序列与NCBI结果相似性为100%;RT-PCR结果显示ompk基因在3株过表达菌株中的转录水平均极为显著(Pompk基因在各过表达菌株中的表达水平显著高于在非抗性条件下的转录水平(Pompk在3株重组菌株中均可以稳定表达。

关键词：减毒单增李斯特菌疫苗载体弧菌疫苗 ompk 抗原基因

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哈氏弧菌特异性检测方法的建立和应用

水产科技情报 2010年第5期37卷 214-217页

作者：梁利国秦国民杨家新张晓君阎斌伦南京师范大学生命科学学院南京210046 淮海工学院江苏省海洋生物技术重点实验室连云港222005

针对哈氏弧菌外膜蛋白ompk的基因序列设计了一对引物,从分离自患病长鳍真鲨体内的哈氏弧菌基因组中扩增获得一段约800bp大小的基因片段。进行了PCR方法的特异性和敏感性以及海产品检测试验,建立了一种检测致病性弧菌的PCR检测方法。结... 详细信息

针对哈氏弧菌外膜蛋白ompk的基因序列设计了一对引物,从分离自患病长鳍真鲨体内的哈氏弧菌基因组中扩增获得一段约800bp大小的基因片段。进行了PCR方法的特异性和敏感性以及海产品检测试验,建立了一种检测致病性弧菌的PCR检测方法。结果表明,该法只检测出致病性哈氏弧菌。同时对不同浓度的细菌悬液扩增,结果显示,此方法对哈氏弧菌菌体DNA的最低检测量为0.139ng/μL,可以为哈氏弧菌的检测提供参考依据。

关键词：长鳍真鲨哈氏弧菌 ompk PCR

鲍曼不动杆菌三种重组表达蛋白的免疫原性和免疫保护性研究

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鲍曼不动杆菌三种重组表达蛋白的免疫原性和免疫保护性研究

作者：郭三君川北医学院

学位级别：硕士

目的:通过原核重组表达获得鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii,AB)重组蛋白ompk、Omp22及Omp K/Omp22融合蛋白,动物免疫接种后检测并比较分析其免疫原性和免疫保护性,探讨构建鲍曼不动杆菌基因重组亚单位疫苗的新策略。方法:1.采用... 详细信息

目的:通过原核重组表达获得鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii,AB)重组蛋白ompk、Omp22及Omp K/Omp22融合蛋白,动物免疫接种后检测并比较分析其免疫原性和免疫保护性,探讨构建鲍曼不动杆菌基因重组亚单位疫苗的新策略。方法:1.采用PCR的方法以鲍曼不动杆菌标准菌株ATCC19606基因组DNA为模板扩增ompk、Omp22基因,并通过重叠延伸PCR获得ompk/Omp22融合基因,将ompk、Omp22基因及ompk/Omp22融合基因分别克隆入pColdI质粒载体,对筛选到的重组质粒进行酶切鉴定和DNA测序鉴定。将重组质粒分别转化大肠杆菌BL21(DE3)株,重组菌经异丙基硫代半乳糖苷诱导后,镍亲和柱纯化重组蛋白。2.分别将3种重组蛋白各20μg(溶于PBS缓冲液50μL)与等体积弗氏佐剂混合后作为抗原免疫接种Balb/c小鼠,并于初次免疫后第14、21天以相同剂量重组蛋白与弗氏佐剂混合后各加强免疫一次,设置PBS对照组(即只给每只动物注射PBS溶液50μL和等体积弗氏佐剂)。于末次免疫后第7、21天小鼠内眦取血,酶联免疫吸附试验测定抗血清效价。3.末次免疫后第3周分离小鼠脾淋巴细胞,体外经相应抗原刺激后,MTT法检测脾淋巴细胞增殖水平,ELISA法测定IFN-γ细胞因子释放水平。4.末次免疫3周后以鲍曼不动杆菌临床分离株攻击免疫小鼠,记录小鼠存活率,采集小鼠外周血检测其细菌载量,分离小鼠肺组织HE染色后观察其病理变化。结果:成功构建了3个重组质粒pColdI-ompk/Omp22、pColdI-ompk、pColdI-Omp22,转化大肠杆菌BL21(DE3)株后经IPTG诱导可表达分子量与理论值一致的3个重组蛋白ompk/Omp22、ompk、Omp22,纯化的重组蛋白免疫小鼠后获得的抗血清均具有特异性,末次免疫后的第7、21天融合蛋白ompk/Omp22免疫组小鼠血清抗体滴度明显高于Omp K免疫组及Omp22免疫组(Pompk免疫组及Omp22免疫组(Pompk/Omp22、ompk、Omp22免疫小鼠脾淋巴细胞IFN-γ产量分别为:0.521±0.069ng/mL,0.48±0.042ng/mL,0.485±0.050ng/mL均高于PBS对照组(0.423±0.1088ng/mL)。PBS对照组小鼠受到鲍曼不动杆菌临床分离菌株攻击感染后72h内全部死亡,而直至攻击感染后第8天ompk/Omp22、Omp K、Omp22免疫组小鼠存活率分别为66.7%,25%,37.5%。ompk/Omp22、ompk、Omp22免疫小鼠外周血细菌载量均低于PBS对照组(Pompk/Omp22融合蛋白组细菌载量最低(Pompk和Omp22免疫小鼠的肺组织出现中等度肺炎改变及中等度的炎性细胞浸润,而Omp K/Omp22融合蛋白免疫组小鼠肺组织仅表现为轻度的炎症反应和极少量炎性细胞浸润。结论:3种重组蛋白小鼠免疫接种后均表现出较强的免疫原性和一定程度的免疫保护性,融合蛋白ompk/Omp22的免疫原性和免疫保护性明显强于单个重组蛋白ompk及Omp22。该研究结果可为进一步优化鲍曼不动杆菌亚单位疫苗分子设计以及构建包含多个抗原组分的多亚单位疫苗等研究提供参考依据。

关键词：鲍曼不动杆菌 ompk Omp22 融合蛋白亚单位疫苗