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新生儿脑膜炎大肠埃希菌ompt敲除株毒力分析

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中华微生物学和免疫学杂志 2013年第8期33卷 574-577页

作者：惠长野刘晓露郭妍彭亮张艳芳王佃鹏曹虹深圳市职业病防治院 518001 深圳市医学继续教育中心广州南方医科大学病原生物学系

目的探讨新生儿脑膜炎大肠埃希菌ompt对菌株毒力的影响。方法对比野生致病株E44及ompt敲除株FA4：Aompt两者体外黏附人脑微血管内皮细胞的能力；构建回复株，并考察ompt回补质粒pST及点突变质粒pST85能否恢复敲除株的黏附能力；考察omp... 详细信息

目的探讨新生儿脑膜炎大肠埃希菌ompt对菌株毒力的影响。方法对比野生致病株E44及ompt敲除株FA4：Aompt两者体外黏附人脑微血管内皮细胞的能力；构建回复株，并考察ompt回补质粒pST及点突变质粒pST85能否恢复敲除株的黏附能力；考察ompt缺失对菌株定植乳鼠肠道能力的影响；考察ompt缺失对菌株穿越乳鼠血脑屏障的影响。结果相比野生株，E44：Aompz黏附人脑微血管内皮细胞能力明显降低；低拷贝质粒pST及点突变质粒pST85部分恢复了E44：Aompt的黏附能力；ompt缺失不影响菌株肠道定植能力；E44：Aompt可诱导与野生株相似水平的菌血症，但穿越乳鼠血脑屏障的能力显著降低。结论ompt与菌体黏附脑微血管内皮细胞及穿越血脑屏障相关，ompt蛋白水解酶活性在其中的作用有待进一步研究。

关键词：脑膜炎大肠埃希菌 ompt 脑微血管内皮细胞黏附毒力

鸡源大肠杆菌OMP和ompt基因与血清型相关性

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中国兽医学报 2013年第8期33卷 1217-1222页

作者：贾青辉张艳英史秋梅房海陈翠珍张香斋李佩国河北科技师范学院河北预防兽医学重点实验室河北昌黎066600

为了解禽致病性大肠杆菌分离株0MP、ompt基因与血清型相关性，对6种血清型（O78、O38、O9、O91、O11、O157）的7株鸡源大肠杆菌菌株进行了外膜蛋白（OMP）和外膜蛋白酶T（ompt）基因的研究。用N-十二烷酰肌氨酸法提取其外膜蛋白，经SDS-... 详细信息

为了解禽致病性大肠杆菌分离株0MP、ompt基因与血清型相关性，对6种血清型（O78、O38、O9、O91、O11、O157）的7株鸡源大肠杆菌菌株进行了外膜蛋白（OMP）和外膜蛋白酶T（ompt）基因的研究。用N-十二烷酰肌氨酸法提取其外膜蛋白，经SDS-PAGE电泳后考马斯亮蓝染色，对鸡源大肠杆菌菌株进行了外膜蛋白分型；用PCR和生物信息学的方法对ompt基因进行检测与分析。7株大肠杆菌共有3个OMP型，其中，分离株5，32，9主要由相对分子质量接近的2条带组成，为OMP-1型；分离株11主要由相对分子质量接近的3条带组成，为OMP-2型；分离株14，7主要由相对分子质量接近的1条带组成，为0MP-3型。这表明同一血清型的菌株可能属于不同的OMP型，而血清型不同的分离株之间却可具有相同的0MP型。PCR检测结果显示7株鸡源大肠杆菌均携带ompt基因，与GenBank登录的序列比较发现其同源性为91．9％～100．0％，不同血清型菌株间的同源性为91．9％～98．0％。该试验证实了同一血清型分离株之间可发生遗传分化，而不同血清型分离株之间也可具有不同程度的遗传相关性；不同血清型分离株间的ompt基因的同源性存在一定的差异。

关键词：鸡源大肠杆菌外膜蛋白血清型 ompt SDS-PAGE

大肠杆菌外膜蛋白酶基因ompt的克隆及表达

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中国农业科技导报 2011年第2期13卷 53-58页

作者：董世雷刘伟朱立颖王学琴于宏伟王欣浙江师范大学化学与生命科学学院浙江金华321004 浙江省农业科学院植物保护与微生物研究所杭州310021 内蒙古工业大学化工学院呼和浩特010051 马歇尔大学微生物学与免疫学院

ompt(Outer-membrane proteases T)是革兰氏阴性细菌分泌到细胞表面具有丝氨酸蛋白酶活性的一种重要蛋白。利用大肠杆菌ompt降解抗菌肽特性来筛选和改造新型抗菌肽,可以为开发抗ompt蛋白酶水解新抗菌肽序列提供新的思路和创造条件。根... 详细信息

ompt(Outer-membrane proteases T)是革兰氏阴性细菌分泌到细胞表面具有丝氨酸蛋白酶活性的一种重要蛋白。利用大肠杆菌ompt降解抗菌肽特性来筛选和改造新型抗菌肽,可以为开发抗ompt蛋白酶水解新抗菌肽序列提供新的思路和创造条件。根据大肠杆菌外膜蛋白酶ompt的基因序列设计一对引物,应用聚合酶链式反应(PCR)方法,从大肠杆菌K12基因组中扩增获得一段为954 bp的序列,测序结果显示此序列与已公布序列同源性达99.99%。将其序列定向克隆到原核表达载体pET28a上构建重组表达质粒pET28a-ompt。经IPTG诱导后,在表达宿主菌中特异性的表达出分子量约为36 kDa且具有生物活性的ompt蛋白。生长曲线试验显示,抗菌肽LL37对带重组表达质粒pET28a-ompt的大肠杆菌生长没有影响,而对照组的生长明显受到抗菌肽的抑制作用。

关键词： ompt 克隆与表达外膜蛋白酶抗菌肽

禽病原性大肠杆菌ompA、ompt基因和肠炎沙门氏菌ompA、pgtE基因突变株的构建及其生物学特性研究

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禽病原性大肠杆菌ompA、ompT基因和肠炎沙门氏菌ompA、pgtE基因突...

作者：周业菲扬州大学

学位级别：硕士

禽大肠杆菌病(Avian colibacillosis)是由禽致病性大肠杆菌(avian pathogenic Escherichia coli, APEC)引起的一种常见的局部或全身性感染的细菌性传染病,且易与其它病原细菌、病毒并发或混合感染。目前,该病已成为危害养禽业的重要细菌... 详细信息

禽大肠杆菌病(Avian colibacillosis)是由禽致病性大肠杆菌(avian pathogenic Escherichia coli, APEC)引起的一种常见的局部或全身性感染的细菌性传染病,且易与其它病原细菌、病毒并发或混合感染。目前,该病已成为危害养禽业的重要细菌病,给世界范围内养禽业造成了巨大的经济损失。肠炎沙门氏菌(Salmonella enteritidis, SE)是一类泛嗜性沙门氏菌,是人和动物的重要致病菌,它不仅能引起多种畜禽疾病,造成全身性感染、腹泻和胃肠炎等,而且是引起人类食物中毒的主要病原菌之一,主要污染蛋类和禽肉类食品,在兽医公共卫生学上具有重要意义。OmpA (outer-membrane protein A)是革兰氏阴性细菌OMPs的主要蛋白,在维持外膜结构稳定、作为噬菌体TuⅡ受体等方面有重要的功能,同时也作为黏附素或侵袭素,与细菌的毒力相关。ompt (outer-membrane proteases T)是革兰氏阴性细菌尤其是大肠杆菌的一种重要防御性分子,属于omptin外膜蛋白家族,包括肠炎沙门氏菌的PgtE蛋白已被证明是重要的毒力因子。研究表明ompt基因编码外膜蛋白酶,ompA基因编码外膜蛋白A,在尿路感染和脑膜炎临床分离株中的检出率很高,是假定的致病性大肠杆菌的毒力相关因子。本研究旨在探讨ompA、ompt和pgtE基因与APEC和SE致病性之间的关系,了解APEC ompA、ompt与SE ompA、pgtE基因突变株的生物学特性,为揭示APEC和SE的致病机理及进一步构建APEC和SE弱毒疫苗株奠定基础。本研究运用λ-Red同源重组的方法构建了E058AompA、E058Δompt及CVCC3378ΔompA、CVCC3378ApgtE基因缺失突变株,同时将带有相应启动子的缺失基因完整阅读框插入表达载体pGEX-6P-1中,通过电转化突变株来筛选获得回复株。PCR扩增带酶切位点的ompA基因并插入到pMD(?)18-T simple vector载体中,筛选出阳性重组子T-ompA,然后运用分子克隆方法将Zeocin抗性基因插入到目的基因ompA中,构建出带Zeocin抗性基因的质粒T-ompA-Zeo。PCR扩增出片段ompA-Zeo,并电转化入带有质粒pKD46的禽病原性大肠杆菌分离株E058中,运用同源重组的方法,筛选出基因突变株E058ΔAompA。运用相同的同源重组方法,依次筛选出基因突变株E058Δompt、 CVCC3378ΔompA、CVCC3378ΔpgtE。RT-PCR结果表明各突变株基因的缺失只影响突变基因本身的表达,而其上下游基因的转录正常;生长曲线的测定结果显示,各突变株、回复株的生长速度与亲本株相似,并未表现出明显差异;SPF鸡血清杀菌试验、HD-11细胞吞噬试验、1日龄SPF鸡致死试验结果说明,与野生株E058和CVCC3378相比,突变株E058ΔompA、E058Δompt、 CVCC3378ΔompA、CVCC3378ΔpgtE均表现出了轻微致弱;体内竞争及动态分布试验表明,与野生株相比,各突变株在各个被检脏器中数量均明显下降,差异显著,而回复株较相应的突变株毒力则有显著提高。

关键词：禽致病性大肠杆菌肠炎沙门氏菌 ompA ompt pgtE 突变株致病性

禽病原性大肠杆菌O2分离株外膜蛋白ompt纯化与结晶条件的初步研究

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禽病原性大肠杆菌O2分离株外膜蛋白OmpT纯化与结晶条件的初步研究

作者：张旭扬州大学

学位级别：硕士

禽大肠杆菌病是由禽致病性大肠杆菌(avian pathogenic Escherichia coli,APEC)引起禽类的一种复杂的多系统综合征的总称。禽致病性大肠杆菌病目前已成为鸡群中非常严重的一种细菌病,大肠杆菌败血症、心包炎、肝周炎、气囊炎等是大肠杆... 详细信息

禽大肠杆菌病是由禽致病性大肠杆菌(avian pathogenic Escherichia coli,APEC)引起禽类的一种复杂的多系统综合征的总称。禽致病性大肠杆菌病目前已成为鸡群中非常严重的一种细菌病,大肠杆菌败血症、心包炎、肝周炎、气囊炎等是大肠杆菌病在临床上的主要表现特征,并常常伴随不同程度的死亡率,给养殖业造成严重的经济损失,同时越来越多的证据表明APEC具有人兽共患病的潜能。外膜蛋白T(Outer membrane protein T,ompt)定位于大肠杆菌外膜,是具有高度底物特异性的蛋白水解酶,属于革兰氏阴性菌外膜蛋白家族。APEC中的ompt蛋白由位于染色质的ompt基因(c-ompt)和位于质粒中的ompt基因(p-ompt)分别编码,但在行使功能方面存在一定差异。通过基因的序列比对可以发现位于质粒pAPEC-O2-ColV中的ompt基因(p-ompt)与位于染色质的ompt基因(c-ompt)同源性为79%。本研究旨在探讨p-ompt的结构和功能之间的关系,了解c-ompt和p-ompt的结构差异,从而阐明c-ompt和p-ompt之间功能上的差异问题,为了解APEC的致病机理和探求特异性防治措施奠定基础。通过同时构建含有c-ompt或p-ompt基因的重组表达载体,并分别转化到工程宿主菌BL21(DE3)中进行诱导表达。鱼精蛋白抑制试验显示,含有p-ompt基因的细菌生长受到抑制,而含有c-ompt的细菌则生长不受影响。为了进一步研究p-ompt的结构和功能之间的关系。本实验以禽致病性大肠杆菌E058的基因组为DNA模板,PCR扩增出p-ompt基因片段,并且连接在表达载体上,构建成重组表达质粒。然后在大肠杆菌BL21(DE3)中进行了异源表达。由于诱导表达过程中形成无蛋白活性的包涵体,需要经过变性和复性,以恢复蛋白生物活性,然后利用离子交换和凝胶过滤层析进行蛋白纯化,得到高纯度且聚合状态单一的p-ompt蛋白样品。将纯化出来的蛋白利用气相扩散坐滴法进行蛋白结晶条件筛选,并对结晶条件进行优化。我们获得了 p-ompt的蛋白晶体,并对其进行X-射线的衍射,收集数据分析。为p-ompt晶体的进一步优化和获得优质蛋白晶体打下基础。根据大肠杆菌ompt能够降解抗菌肽的特性来筛选和改造新型抗菌肽,为开发抗ompt蛋白酶水解新抗菌肽序列提供新的思路。

关键词：禽致病性大肠杆菌 ompt 鱼精蛋白蛋白晶体

禽病原性大肠杆菌E058株ompt、cvaC基因突变株的构建及其生物学特性

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禽病原性大肠杆菌E058株ompT、cvaC基因突变株的构建及其生物学特...

作者：何洪波扬州大学

学位级别：硕士

禽大肠杆菌病(Avian colibacillosis)是指部分或全部由禽病原性大肠杆菌(Avian pathogenic Escherichia coli, APEC)引起的局部或全身性感染的疾病,主要包括大肠杆菌性败血症、大肠杆菌肉芽肿(Hjarre氏病)、滑膜炎、气囊病(慢性呼吸道病... 详细信息

禽大肠杆菌病(Avian colibacillosis)是指部分或全部由禽病原性大肠杆菌(Avian pathogenic Escherichia coli, APEC)引起的局部或全身性感染的疾病,主要包括大肠杆菌性败血症、大肠杆菌肉芽肿(Hjarre氏病)、滑膜炎、气囊病(慢性呼吸道病,CRD)、腹膜炎、输卵管炎、禽蜂窝织炎、肿头综合症、全眼球炎及脐炎／卵黄囊感染等。该病给世界范围内养禽业带来了严重的经济损失。研究表明,ompt基因编码外膜蛋白酶,cvaC是大肠杆菌素V的结构基因,流行病学调查发现,ompt、cvaC基因在有毒力菌株中的阳性率很高。本研究旨在研究ompt、cvaC基因与致病性之间的关系,了解APEC ompt与cvaC基因突变株的生物学特性,为揭示APEC的致病机理及进一步构建APEC弱毒疫苗株奠定基础。本试验运用同源重组的方法构建ompt和cvaC的基因缺失突变株。首先PCR扩增ompt和cvaC基因,并将其插入到pMD(?)18-T simple vector载体,再运用分子克隆的方法将Zeocin抗性基因分别插入到目的基因ompt和cvaC中,构建出带Zeocin抗性基因标志的载体T-ompt-Zeo和T-cvaC-Zeo,最后PCR扩增片段ompt-Zeo和cvaC-Zeo,并电转化禽致病性大肠杆菌分离株E058,筛选出E058突变株E058Aompt及E058AcvaC。Southern blot结果显示Zeocin抗性基因片段单拷贝插入;RT-PCR结果表明突变株的ompt基因及cvaC基因不能转录,但其上下游基因的转录正常;生长曲线测定结果显示,突变株E058△ompt及E058△cvaC的生长速度与亲本株E058相似,并未表现出明显差异;SPF鸡血清杀菌试验、HD11细胞吞噬试验、12日龄SPF鸡胚致死试验结果说明,与野生株E058相比,突变株E058△ompt及E058△cvaC只表现出了轻微致弱;E058、E058Aompt、和E058△AcvaC的半数致死量(LD50)为分别为104.4、106.0和105.1CFU;体内竞争及动态分布试验表明,与野生株相比,突变株E058△ompt在各个被检脏器中数量均明显下降,差异显著,而E058△cvaC在部分被检脏器中数量有所下降,但并未达到显著水平,差异不显著。结果表明,E058△ompt突变株较野生株毒力下降明显,E058△cvaC突变株毒力较野生株相比没有明显的差异,从而表明ompt基因与APEC E058株的致病性有关,cvaC与APEC E058株的致病性不相关。

关键词：禽致病性大肠杆菌 ompt cvaC 突变株致病性

禽致病性大肠杆菌ompt缺失株特性及其对雏鸡小肠炎症相关基因表达的影响

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禽致病性大肠杆菌ompT缺失株特性及其对雏鸡小肠炎症相关基因表达...

作者：王琦安徽农业大学

学位级别：硕士

禽致病性大肠杆菌(Avian pathogenic Escherichia coli,APEC)导致的禽大肠杆菌病被公认为是影响世界范围内养禽业的主要细菌性疾病,给养禽业带来重大的经济损失。APEC的毒力因子有菌毛、摄铁系统、毒素和外膜蛋白等,致病性复杂,血清型... 详细信息

禽致病性大肠杆菌(Avian pathogenic Escherichia coli,APEC)导致的禽大肠杆菌病被公认为是影响世界范围内养禽业的主要细菌性疾病,给养禽业带来重大的经济损失。APEC的毒力因子有菌毛、摄铁系统、毒素和外膜蛋白等,致病性复杂,血清型多样。细菌调控基因转录表达的途径众多,PhoP/Q二元调控系统是其中一个关键途径,其中调控与外膜蛋白合成相关基因的表达是其功能之一。本实验室前期研究发现APEC phoP/Q的缺失引起ompt基因表达的显著下调。外膜蛋白酶T(Outer-membrane protease T,ompt)是革兰氏阴性菌中的一种外膜蛋白酶,它不仅可以作为水解蛋白的蛋白酶发挥功能,还可能是细菌的一个毒力相关因子,在病原菌的感染致病过程中起着一定作用。本试验通过Red重组技术构建了ompt缺失株及回复株,并进行生物学特性分析,基于RNA-Seq技术对ompt缺失株测序筛选并分析差异表达基因,并对ompt缺失株感染雏鸡小肠炎症相关基因mRNA水平的表达进行检测,为进一步研究ompt基因在禽致病性大肠杆菌中的致病作用提供理论依据,研究内容及结果如下:1.ompt基因缺失株、回复株的构建及其生物学特性和致病性分析本试验以AE17为野生株,通过Red重组技术成功构建了ompt缺失株及回复株。细菌生长曲线测定结果显示与野生株相比,ompt基因缺失株差异不显著;环境耐受性试验表明ompt基因缺失导致菌株耐酸性显著增加(pompt缺失株对雏鸡的致病力降低;组织载菌量试验结果表明,ompt缺失株显著降低感染雏鸡组织(脾脏、肝脏、肺脏)的载菌量(pompt基因缺失后,菌株对APEC的运动能力、抗生素的敏感性及抗吞噬能力差异不显著。2.基于RNA-Seq筛选APEC ompt缺失株差异表达基因为了探索ompt缺失对APEC基因水平的影响,本试验通过RNA-Seq技术从转录组水平筛选ompt缺失引起的差异表达基因,结果显示有490个差异表达基因,其中包括125个下调表达基因,365个上调表达基因。GO功能结果表明差异基因主要涉及铁离子稳态、裂解酶活性、肽聚糖生物合成过程、细胞形态调控等生物学过程;KEGG通路分析结果显示差异基因主要涉及细菌趋化性、生物膜形成、鞭毛装配、脂多糖生物合成等通路。筛选出fliY、ompF、ibeT、aphA、motB、rfaQ、flgK、cheA、irp2、asnC、ycgR、lpxK、kpsU等与毒力相关的基因。通过RT-PCR验证了部分差异基因(fliY、ompF、ibeT、aphA、motB、rfaQ、cheA、irp2)的表达,结果与RNA-Seq中基因表达变化趋势一致,说明RNA-Seq结果可靠。3.RT-PCR检测ompt缺失株感染雏鸡小肠炎症相关基因mRNA的转录水平通过RT-PCR比较攻毒组与对照组雏鸡空肠炎症相关基因PTGDS、MME mRNA水平的转录水平。结果显示攻毒12h、24h和48h后缺失株攻毒组的PTGDS基因mRNA的表达量较AE17攻毒组显著降低(pompt缺失株及回复株,缺失ompt后导致耐酸性增强,耐碱性、耐热性降低,肝脏、脾脏、肺脏载菌量减少,显著降低了APEC的毒力和致病性,但对运动性、药物敏感性、抗吞噬能力方面影响不显著。APEC ompt基因的缺失引起毒力相关基因(fliY、ompF、ibeT、aphA、motB、rfaQ、flgK、cheA、irp2、asnC、ycgR、lpxK、kpsU)的表达变化。APEC感染雏鸡引起空肠炎症相关基因PTGDS、MME mRNA的表达变化,且菌株缺失ompt后影响空肠炎症相关基因PTGDS、MME mRNA的表达,说明炎症相关基因PTGDS、MME参与了机体抗APEC感染的过程,且ompt可能参与APEC感染机体的过程。

关键词：禽致病性大肠杆菌 ompt 基因缺失生物学特性雏鸡小肠炎症相关基因

外膜蛋白T在尿路致病性大肠杆菌致病机理中作用的初步研究

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外膜蛋白T在尿路致病性大肠杆菌致病机理中作用的初步研究

作者：刘晓露南方医科大学

学位级别：硕士

一、研究背景和目的尿路感染(Urinary tract infection, UTIs)是临床上最普遍的细菌感染之一。女性比男性易感,约有81%的UTIs发生在女性,年龄在16到35岁之间,其中27%女性在初次尿路感染后半年内复发,48%在一年内复发。其次,UTIs也是老... 详细信息

一、研究背景和目的尿路感染(Urinary tract infection, UTIs)是临床上最普遍的细菌感染之一。女性比男性易感,约有81%的UTIs发生在女性,年龄在16到35岁之间,其中27%女性在初次尿路感染后半年内复发,48%在一年内复发。其次,UTIs也是老年人和小儿常见的感染性疾病[1-3］。目前尿路感染以抗生素治疗为主。尿路致病性大肠杆菌(Uropathogenic Escherichia coli, UPEC)引起的UTIs占80%—90%。大部分尿路致病菌起源于肠道,并经尿道上行至膀胱,约95%的UTIs起始感染部位是膀胱。目前对尿路感染的研究主要围绕UPEC展开的。UPEC相关毒力因素包括：α-溶血素、细胞毒坏死因子1等毒素;含铁产气杆菌素;荚膜;脂多糖等和一些粘附器官[4-9］。其中UPEC对宿主尿路上皮细胞的粘附能力是其致病的最重要因素,粘附素的表达常常是致病的关键,其有助于UPEC黏附尿路从而避免被大量尿液冲刷清除。流行病学分析及临床研究表明：不同于直肠来源的大肠杆菌,UPEC几乎都是B2型,表达典型的UTIs相关O抗原,带有许多与尿路致病相关的毒力基因,如：编码FimH黏附素的基因fimH,编码P菌毛的基因pap,编码S菌毛的基因sfaS,编码溶血素的基因hly,编码鼠疫菌素受体的基因fyuA以及编码大肠杆菌外膜蛋白T的基因ompt等。这些毒力基因的功能多与粘附、侵袭、血清抗性和代谢等相关,并得到实验证实[11]。但有些基因,如ompt,绝大多数UPEC都携带此基因,是假定的UTIs相关毒力基因,而关于ompt在尿路致病机制中的功能一直未得到实验证实。本课题的目的在于初步研究基因ompt在UPEC的致病机理中是否起到一定作用。本研究利用Red同源重组系统构建UPCE CFT073的ompt基因敲除株,命名为COTD,建立人膀胱上皮细胞株5637体外细胞模型,考察ompt基因的缺失对致病株黏附及侵袭能力的影响。并且通过红细胞凝集试验观察ompt基因对Ⅰ型菌毛的表达是否有影响。同时建立UPEC易感小鼠C57BL/6的UTIs模型,考察ompt基因的缺失是否对细菌体内侵袭能力产生影响;通过病理切片分析,观察细菌体内聚集形态的变化。为进一步研究ompt基因敲除导致的致病差异是否通过ompt酶活性起作用,需克隆表达ompt及失去蛋白酶活性的ompt。因此本文第三章内容为构建蛋白ompt及其失去酶活的点突变体的表达纯化及复性方法,并对两者酶活进行鉴定,观察ompt体外水解抗菌肽的能力以及对UPCE的保护作用。二、研究方法 1、Red同源重组本方法是利用大肠杆菌λ噬菌体的Red重组系统可在细菌内高效介导同源重组事件的原理,将两端带有同源重组臂的一段外源DNA序列导入并替换细菌基因组上同源重组臂序列间的DNA序列,达到目标基因敲除的目的。第一步构建敲除子。根据NCBI网站上获得的ompt基因序列,选取该基因开放阅读框上下游50 bp片段作为同源重组臂。然后根据卡那抗性基因序列设计一对扩增引物,分别与同源重组臂组成敲除子引物,命名为omptan2和omptan2,以pET28a载体为模板,利用PCR技术扩增并纯化敲除子。第二步,将编码Red重组系统gam.bet和exo基因的重组质粒pKD46电转化到CFT073,以氨苄抗性平板筛选阳性克隆,把敲除子电转化到转化了pKD46的CFT073中,通过L-阿拉伯糖诱导同源重组的发生,以卡那霉素平板筛选出发生同源重组的克隆。最后通过正向和反向筛选鉴定敲除体：正向筛选,在5’和3’同源重组臂的外侧设计PCR引物。比较用这对引物从卡那霉素抗性克隆和CFT073扩增出的PCR片段的大小。从未发生正确重组的细菌克隆上,这对引物扩增产物的长度为1781 bp;而从发生正确敲除的细菌克隆(敲除体)上,这对引物扩增产物的长度为2066 bp;反向筛选,在ompt基因开放阅读框序列内部设计一对引物。从CFT073和未发生正确重组的细菌克隆上,这对引物可扩增出预期长度的PCR片段;而从已正确敲除ompt基因的敲除体上,这对引物不能扩增出相应的产物。将成功构建的敲除体命名为COTD. 2、CFT073与COTD生长曲线的绘制以及菌落培养 (1)生长曲线：从新鲜涂布的平板中挑取单菌落接种到5 mL新鲜LB培养基中静置培养过夜,次日再将菌液以1：100的比例接种到LB培养基,37℃,160r/min摇床培养,间隔一定时间取样测OD600,绘制生长曲线图。 (2)菌落培养：将冻存菌液以1：100的比例接种到新鲜LB培养基中,37℃静置培养14 h,取菌液做系列10倍稀释,取10-6和10-7稀释菌液50μl涂布LB平板,静置培养过夜后计菌落数。 3、体外细菌黏附及侵袭实验体外细胞模型采用人膀胱癌上皮细胞5637,将该细胞接种到24孔细胞培养板,待细胞铺满单层(约1×105细胞/

关键词：尿路感染 ompt 基因敲除黏附侵袭

nklin大肠杆菌ompt基因的相对表达定量PCR方法的建立

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实验动物与比较医学 2011年第4期31卷 269-272页

作者：徐晓静殷为民赵李祥苏州大学医学院苏州215123

目的建立ompt基因表达水平解析的定量方法。方法利用嵌合荧光（SYBR GreenI）标记，以编码甘油醛3-磷酸脱氢酶的看家基因gapA为内参基因，建立用于ompt基因表达水平解析的两步法实时定量反转录PCR。通过大肠杆菌的鸡体内感染模型，获取... 详细信息

目的建立ompt基因表达水平解析的定量方法。方法利用嵌合荧光（SYBR GreenI）标记，以编码甘油醛3-磷酸脱氢酶的看家基因gapA为内参基因，建立用于ompt基因表达水平解析的两步法实时定量反转录PCR。通过大肠杆菌的鸡体内感染模型，获取感染菌体，利用该定量PCR对感染菌体中ompt基因在感染鸡体内的表达水平进行了解析。结果成功建立了ompt基因表达水平解析的定量PCR。定量PCR结果显示，相对于体外培养，APECE058株ompt在鸡体内的表达上调了6．69倍。结论建立的ompt基因定量PCR方法稳定、可靠，可用于ompt表达水平的解析。

关键词： SYBR GreenI 定量反转录PCR ompt 表达