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oy-tes-1诱导的树突状细胞对T淋巴细胞的增殖活化作用

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免疫学杂志 2011年第7期27卷 572-575页

作者：李静郭文文罗彬陈芳王炜炜肖绍文谢小薰广西医科大学基础医学院组织胚胎学教研室、区域高发肿瘤防治研究重点实验室南宁530021 第一临床医院神经外科

目的通过癌-睾丸抗原oy-tes-1致敏树突状细胞(DC),研究其对T淋巴细胞的增殖活化作用。方法体外诱导培养人外周血DC,观察其细胞形态并经流式细胞仪进行表型鉴定;分别用oy-tes-1融合蛋白(oy-MBP)、麦芽糖结合蛋白(MBP)和增强型绿色荧光蛋... 详细信息

目的通过癌-睾丸抗原oy-tes-1致敏树突状细胞(DC),研究其对T淋巴细胞的增殖活化作用。方法体外诱导培养人外周血DC,观察其细胞形态并经流式细胞仪进行表型鉴定;分别用oy-tes-1融合蛋白(oy-MBP)、麦芽糖结合蛋白(MBP)和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)致敏DC,与T淋巴细胞共同培养。CCK-8法检测不同蛋白致敏DC后T淋巴细胞的增殖,ELISA检测致敏DC与T淋巴细胞共同培养后上清液IFN-γ的含量。结果诱导出高表达HLA-DR、CD86、CD83和CD80并具有典型细胞特征的DC。经不同蛋白致敏的DC均能促进T淋巴细胞的增殖活化,其中oy-MBP致敏的DC促进T淋巴细胞增殖的能力明显强于其他各组(Poy-tes-1融合蛋白致敏后,可显著促进T淋巴细胞的增殖活化。

关键词：树突状细胞 oy-tes-1 T淋巴细胞

癌睾丸抗原oy-tes-1在脑胶质瘤中的表达及其抗体血清学分析

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中国癌症杂志 2011年第9期21卷 671-674页

作者：李希圣严峻罗彬贺菽嘉范蓉林永达罗昱肖绍文谢小薰广西医科大学第一附属医院神经外科广西南宁530021 广西医科大学基础医学中心实验室广西南宁530021 滨州医学院附属医院神经外科山东滨州256600 广西医科大学组胚教研室广西南宁530021 广西中医学院组胚教研室广西南宁530021

背景与目的:胶质瘤是最常见的原发性恶性脑肿瘤,预后差,生存率低。近年来,以利用癌睾丸(cancer-testis,CT)抗原作为靶抗原行肿瘤免疫治疗已成为研究的热点,而oy-tes-1是CT抗原家族中的一员。本研究拟了解oy-tes-1在脑胶质瘤中的mRNA表... 详细信息

背景与目的:胶质瘤是最常见的原发性恶性脑肿瘤,预后差,生存率低。近年来,以利用癌睾丸(cancer-testis,CT)抗原作为靶抗原行肿瘤免疫治疗已成为研究的热点,而oy-tes-1是CT抗原家族中的一员。本研究拟了解oy-tes-1在脑胶质瘤中的mRNA表达及其抗体出现情况,探讨将oy-tes-1应用于肿瘤免疫治疗及辅助诊断的可能性。方法:收集51例脑胶质瘤患者肿瘤组织标本及配套血清,107例健康人血清。通过RT-PCR,从mRNA水平研究oy-tes-1在脑胶质瘤组织中的表达;用酶联免疫吸附分析技术(enzyme linkedimmunosorbent assay,ELISA)检测患者及健康人血清oy-tes-1抗体;同时对oy-tes-1 mRNA的表达及血清抗体出现的临床意义做初步分析。结果:在脑胶质瘤患者中oy-tes-1 mRNA阳性率为80.4%(41/51),血清oy-tes-1抗体阳性率为15.7%(8/51),健康人血清则为阴性。oy-tes-1 mRNA的表达和血清抗体的出现均与脑胶质瘤患者的年龄、性别、病理分级、肿瘤大小等临床指标无关。结论:oy-tes-1在脑胶质瘤中存在较高的表达,并能引起部分患者的体液免疫反应,有望作为胶质瘤免疫治疗的靶抗原。

关键词： oy-tes-1 胶质瘤免疫治疗

肿瘤睾丸抗原oy-tes-1氨基端截短蛋白及其多克隆抗体的制备

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免疫学杂志 2011年第3期27卷 254-258页

作者：陈玉升韦连登范蓉罗彬何少健林永达陈芳谢小薰肖绍文广西医科大学第一附属医院神经外科南宁530021 广西医科大学第一附属医院基础医学院南宁530021 广西中医学院南宁530001

目的获得原核表达的oy-tes-1氨基端截短蛋白(oy-tes-1-N),并制备其多克隆抗体。方法扩增编码oy-tes-1-N 268个氨基酸(A6-R273)的cDNA序列;将PCR产物插入原核表达载体pMAL-C2,构建重组质粒,并转化DH5α菌;通过蓝白斑筛选、DNA测序筛出阳... 详细信息

目的获得原核表达的oy-tes-1氨基端截短蛋白(oy-tes-1-N),并制备其多克隆抗体。方法扩增编码oy-tes-1-N 268个氨基酸(A6-R273)的cDNA序列;将PCR产物插入原核表达载体pMAL-C2,构建重组质粒,并转化DH5α菌;通过蓝白斑筛选、DNA测序筛出阳性菌;在优化条件下用IPTG对阳性菌进行诱导表达MBP/oy-tes-1-N融合蛋白;上Amyloseresin亲和层析柱纯化,行Western blot鉴定。以融合蛋白作为抗原免疫新西兰白兔制备抗血清,经活化琼脂糖微球纯化后,采用ELISA法及Western blot法分别检测抗血清的效价和多克隆抗体的特异性。结果成功诱导表达出MBP/oy-tes-1-N融合蛋白。以该蛋白免疫新西兰兔制备抗血清,抗体效价为1∶1 000,Western blot检测证实该抗体能与目的蛋白发生特异性结合。结论成功地表达并纯化了MBP/oy-tes-1-N融合蛋白,并制备了特异性多克隆抗体。

关键词： oy-tes-1 融合蛋白克隆纯化多克隆抗体

卵巢癌细胞中oy-tes-1基因启动子CpG位点甲基化状态分析

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解剖学杂志 2011年第6期34卷 763-765,777页

作者：范蓉黄巍郭文文王炜炜罗彬宋慧肖绍文谢小薰广西中医学院组织学与胚胎学教研室南宁530001 广西中医学院第一附属院妇科南宁530023 广西医科大学组织学与胚胎学教研室南宁530021

目的：了解卵巢癌SKOV3细胞中oy-tes-1启动子区域CpG位点的甲基化状态。方法：运用免疫细胞化学法检测SKOV3细胞中oy-tes-1蛋白表达；通过硫化测序PCR法，分析SKOV3细胞中oy-tes-1启动子区域CpG位点的甲基化状态，并与睾丸组织相比较。... 详细信息

目的：了解卵巢癌SKOV3细胞中oy-tes-1启动子区域CpG位点的甲基化状态。方法：运用免疫细胞化学法检测SKOV3细胞中oy-tes-1蛋白表达；通过硫化测序PCR法，分析SKOV3细胞中oy-tes-1启动子区域CpG位点的甲基化状态，并与睾丸组织相比较。结果：免疫细胞化学法检测结果显示，SKOV3细胞中oy-tes-1蛋白呈阳性反应；在检测的oy-tes-1启动子区域（转录起始点-127bp-＋110bp，含24个CpG位点）中，CpG位点的甲基化频率为80．21％，其甲基化状态明显高于睾丸组织。结论：SKOV3细胞中oy-tes-1启动子CpG位点处于高甲基化状态，进一步可探讨甲基化抑制剂氮杂脱氧胞嘧啶对oy-tes-1甲基化状态及其表达水平的影响。

关键词：癌-睾丸抗原卵巢癌 CpG 甲基化 oy-tes-1

癌-睾丸抗原oy-tes-1致敏的树突状细胞体外抗胶质瘤的免疫效应

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华中科技大学学报（医学版） 2017年第6期46卷 631-635页

作者：刘畅闭水清张庆梅谢小薰肖绍文付骏葛盈盈陈芳罗彬李静广西医科大学第一附属医院神经外科南宁530021 广西医科大学组织学与胚胎学教研室南宁530021 广西医科大学基础医学研究重点实验室南宁530021

目的研究负载癌-睾丸抗原(cancer-testis antigen,CTA)oy-tes-1的树突状细胞(dendritic cell,DC)体外抗胶质瘤的细胞免疫效应。方法细胞因子联合诱导HLA-A2+健康人外周血单核细胞为DC,采用oy-tes-1重组蛋白致敏DC,流式细胞术检测成熟DC... 详细信息

目的研究负载癌-睾丸抗原(cancer-testis antigen,CTA)oy-tes-1的树突状细胞(dendritic cell,DC)体外抗胶质瘤的细胞免疫效应。方法细胞因子联合诱导HLA-A2+健康人外周血单核细胞为DC,采用oy-tes-1重组蛋白致敏DC,流式细胞术检测成熟DC表型分子;进而使DC诱导同体T淋巴细胞产生细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL),CCK8检测T细胞增殖情况,ELISPOT检测IFN-γ含量,乳酸脱氢酶释放法检测CTL对胶质瘤细胞U251和A172的杀伤作用。结果负载oy-tes-1的DC低表达CD14,而高表达CD1a、CD83和CD80表型分子,能明显促进CD8+T细胞的增殖及其IFN-γ的分泌(Poy-tes-1特异性CTL在效靶比为50∶1时对HLA-A2+和oy-tes-1+U251、HLA-A2-和oy-tes-1+A172均有明显杀伤作用(均Poy-tes-1重组蛋白致敏的DC可诱导特异性抗胶质瘤免疫应答,提示oy-tes-1可能成为胶质瘤免疫治疗的靶点。

关键词：树突状细胞 oy-tes-1 胶质瘤免疫治疗

特异性siRNA对卵巢癌SKOV3细胞中oy-tes-1蛋白表达的抑制作用

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中国妇幼保健 2011年第11期26卷 1686-1688页

作者：范蓉郭文文黄巍闫光华王炜炜罗彬肖绍文谢小薰广西中医学院组织学与胚胎学教研室广西南宁530001 广西医科大学组织学与胚胎学教研室

目的:探讨特异性siRNA对卵巢癌SKOV3细胞中肿瘤-睾丸抗原oy-tes-1蛋白表达的影响。方法:针对oy-tes-1基因设计、化学方法合成的siRNA通过脂质体转染体外培养的卵巢癌SKOV3细胞,在转染后24、36、48、72 h,通过免疫细胞化学检测oy-tes-1... 详细信息

目的:探讨特异性siRNA对卵巢癌SKOV3细胞中肿瘤-睾丸抗原oy-tes-1蛋白表达的影响。方法:针对oy-tes-1基因设计、化学方法合成的siRNA通过脂质体转染体外培养的卵巢癌SKOV3细胞,在转染后24、36、48、72 h,通过免疫细胞化学检测oy-tes-1蛋白的表达水平。结果:靶向oy-tes-1基因siRNA转染SKOV3细胞后,oy-tes-1蛋白的表达明显降低,其抑制作用在转染后24 h出现,转染后36 h几乎完全被抑制,转染后72 h开始出现RNAi衰减现象。结论:oy-tes-1特异性siRNA(1 486～1 504)序列可在体外有效地干扰SKOV3细胞中oy-tes-1基因的表达。

关键词： RNA干扰卵巢癌细胞 oy-tes-1 肿瘤-睾丸抗原

癌—睾丸抗原oy-tes-1致敏树突状细胞的体外抗肝癌研究

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癌—睾丸抗原OY-TES-1致敏树突状细胞的体外抗肝癌研究

作者：李静广西医科大学

学位级别：硕士

目的:初步探讨癌-睾丸抗原oy-tes-1致敏树突状细胞诱导的细胞毒性T淋巴细胞对肝癌细胞的杀伤作用,为肝癌的免疫治疗提供实验依据。方法:(1)靶细胞筛选:通过流式细胞仪筛选HLA-A2+和HLA-A2-的肝癌细胞株;运用RT-PCR法和免疫组织化学筛选O... 详细信息

目的:初步探讨癌-睾丸抗原oy-tes-1致敏树突状细胞诱导的细胞毒性T淋巴细胞对肝癌细胞的杀伤作用,为肝癌的免疫治疗提供实验依据。方法:(1)靶细胞筛选:通过流式细胞仪筛选HLA-A2+和HLA-A2-的肝癌细胞株;运用RT-PCR法和免疫组织化学筛选oy-tes-1表达阳性的肝癌细胞株。(2)运用HLA-A2阳性健康人外周血,密度梯度法分离单个核细胞,经rhGM-CSF、rhIL-4和rhTNF-α联合诱导培养为树突状细胞(dendritic cell, DC),通过光学显微镜和电子显微镜及流式细胞仪进行表型鉴定;分别用oy-tes-1融合蛋白(oy-MBP)、麦芽糖结合蛋白(MBP)和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)致敏DC并激活同体T淋巴细胞,使之增殖、分化为细胞毒性T淋巴细胞(CTL);采用CCK-8法检测蛋白致敏DC后刺激同种混合淋巴细胞增殖(MLR)能力;ELISA检测致敏DC与T淋巴细胞共同培养后上清液IFN-γ的含量,并用乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测CTL对肝癌细胞的细胞毒作用。结果:(1)靶细胞筛选:流式细胞仪检测结果显示肝癌细胞株HepG2为HLA-A2+, Bel-7404为HLA-A2-;RT-PCR和免疫细胞化学法结果显示Bel-7404和HepG2均表达oy-tes-1。(2)DC的鉴定和CTL杀伤效应:PBMC经细胞因子联合诱导培养1周后,出现典型的DC形态,并高表达HLA-DR、CD86、CD83和CD80;经不同蛋白致敏的DC均能促进T淋巴细胞的增殖活化,其中oy-MBP致敏的DC促进T淋巴细胞增殖的能力明显强于其他各组(Poy-MBP致敏DC诱导的CTL对靶细胞HepG2有杀伤作用,其杀伤率明显高与其他各组(Poy-tes-1融合蛋白致敏的DC可有效激发CTL,产生较强的抗肝癌细胞毒活性效应,提示oy-tes-1可作为肝癌免疫治疗的靶点。

关键词：树突状细胞 oy-tes-1 细胞毒性T淋巴细胞免疫治疗肝癌

胶质瘤患者oy-tes-1体液免疫反应产生的原因分析

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胶质瘤患者OY-TES-1体液免疫反应产生的原因分析

作者：李希圣广西医科大学

学位级别：硕士

目的:初步了解胶质瘤oy-tes-1基因变异与其血清抗体阳性的关系,探究脑胶质瘤患者外周血oy-tes-1抗体产生的原因,为深入研究oy-tes-1的生物学功能奠定基础。方法:(1)oy-tes-1血清抗体阳性的胶质瘤患者11例,提取其胶质瘤组织总RNA,用逆转... 详细信息

目的:初步了解胶质瘤oy-tes-1基因变异与其血清抗体阳性的关系,探究脑胶质瘤患者外周血oy-tes-1抗体产生的原因,为深入研究oy-tes-1的生物学功能奠定基础。方法:(1)oy-tes-1血清抗体阳性的胶质瘤患者11例,提取其胶质瘤组织总RNA,用逆转录酶合成cDNA,进行逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增oy-tes-1开放阅读框架序列, PCR产物纯化后与T载体连接,进行DNA测序,分析oy-tes-1基因序列情况。(2)利用免疫组织化学法和Western blot,分别检测6例和4例oy-tes-1血清抗体阳性患者的胶质瘤组织。结果:(1)11例oy-tes-1抗体阳性的胶质瘤均可检测到oy-tes-1 mRNA;DNA测序未发现oy-tes-1基因开放阅读框架变异;(2)免疫组织化学和Western blot均可检测到胶质瘤组织表达oy-tes-1蛋白。oy-tes-1蛋白主要分布于肿瘤细胞胞质,小部分位于胞核内;从胶质瘤肿瘤中提取的蛋白能与oy-tes-1抗体结合,但其分子量小于oy-tes-1蛋白的理论值。结论:胶质瘤患者产生oy-tes-1抗体的原因可能不是由oy-tes-1基因变异所致。

关键词：胶质瘤 oy-tes-1 基因变异癌睾丸抗原

肝癌细胞中甲基化及Sp1对oy-tes-1启动子活性的影响

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肝癌细胞中甲基化及Sp1对OY-TES-1启动子活性的影响

作者：石蕾广西医科大学

学位级别：硕士

目的:预测癌-睾丸抗原oy-tes-1基因的启动子区域,筛选出oy-tes-1启动子相对核心区域,了解转录因子Sp1对oy-tes-1基因启动子的调控作用,以及甲基化对oy-tes-1启动子的活性影响。方法:(1)运用多种生物信息学在线软件,获取oy-tes-1基因的... 详细信息

目的:预测癌-睾丸抗原oy-tes-1基因的启动子区域,筛选出oy-tes-1启动子相对核心区域,了解转录因子Sp1对oy-tes-1基因启动子的调控作用,以及甲基化对oy-tes-1启动子的活性影响。方法:(1)运用多种生物信息学在线软件,获取oy-tes-1基因的全长序列以及5’上游序列,预测oy-tes-1启动子大致区域;(2)通过荧光素酶报告基因载体活性(Luciferase)检测,筛选出oy-tes-1启动子相对核心区域,确认oy-tes-1启动子上的Sp1位点,并分析Sp1对oy-tes-1启动子的调控作用;在此基础上进一步用染色质免疫共沉淀(ChIP-PCR)方法了解Sp1是否能与oy-tes-1启动子直接结合,从而了解转录因子Sp1对oy-tes-1的调控方式;(3)用甲基化转移酶(***)处理oy-tes-1启动子核心区域报告基因载体,比较甲基化干预前后oy-tes-1启动子的活性改变。结果:(1)根据多种生物信息学分析结果,设计并合成4段oy-tes-1截短启动子报告基因载体,分别检测荧光素酶报告基因载体活性,结果显示oy-tes-1启动子-184bp～+67bp的截段活性最强,被认为是相对核心启动子区域;(2)根据荧光素酶报告基因载体活性结果显示,转录因子Sp1对oy-tes-1启动子的调控存在一定的抑制作用。染色质免疫共沉淀则证实Sp1能直接结合于oy-tes-1启动子区域,提示转录因子Sp1能够直接调控oy-tes-1启动子的转录;(3)oy-tes-1启动子经甲基化转移酶处理后,其启动子活性呈明显下降,提示甲基化状态对oy-tes-1启动子的活性有重要影响。结论:oy-tes-1基因启动子的相对核心区域位于-184bp～+67bp;转录因子Sp1对oy-tes-1启动子的调控具有一定的抑制作用,启动子甲基化能显著抑制oy-tes-1启动子活性。

关键词：癌-睾丸抗原 Sp1 oy-tes-1 启动子甲基化