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The deubiquitinase otud1 inhibits colonic inflammation by suppressing RIPK1-mediated NF-κB signaling

Cellular & Molecular Immunology 2022年第2期19卷 276-289页

作者： Bo Wu Lihua Qiang Yong Zhang Yesheng Fu Mengyuan Zhao Zehui Lei Zhe Lu Yan-Ge Wei Hongmiao Dai Yingwei Ge Mingqiu Liu Xuemei Zhou Zhiqiang Peng Hongchang Li Chun-Ping Cui Jing Wang Hui Zheng Cui Hua Liu Lingqiang Zhang State Key Laboratory of Proteomics National Center for Protein Sciences(Beijing)Beijing Institute of LifeomicsBeijing100850China CAS Key Laboratory of Pathogenic Microbiology and Immunology Institute of MicrobiologyChinese Academy of SciencesBeijing100101China Savaid Medical School University of Chinese Academy of SciencesBeijing101408China International Institute of Infection and Immunity Institutes of Biology and Medical SciencesSoochow UniversitySuzhouJiangsuChina

The E3 ubiquitin ligase(E3)-mediated ubiquitination and deubiquitinase(DUB)-mediated deubiquitination processes are closely associated with the occurrence and development of colonic inflammation.Ovarian tumor deubiquitinase 1(otud1)is involved in immunoregulatory functions linked to infectious diseases.However,the effect of otud1 on intestinal immune responses during colonic inflammatory disorders such as inflammatory bowel disease(IBD)remains unclear.Here,we show that loss of otud1 in mice contributes to the pathogenesis of dextran sulfate sodium(DSS)-induced colitis via excessive release of proinflammatory cytokines.In addition,bone marrow transplantation experiments revealed that otud1 in hematopoietic cells plays a dominant role in protection against colitis.Mechanistically,otud1 physically interacts with receptor-interacting serine/threonine-protein kinase 1(RIPK1)and selectively cleaves K63-linked polyubiquitin chains from RIPK1 to inhibit the recruitment of NF-κB essential modulator(NEMO).Moreover,the expression of otud1 in mucosa samples from ulcerative colitis(UC)patients was lower than that in mucosa samples from healthy controls.Furthermore,we demonstrate that the UC-associated otud1 G430V mutation abolishes the ability of otud1 to inhibit RIPK1-mediated NF-κB activation and intestinal inflammation.Taken together,our study unveils a previously unexplored role of otud1 in moderating intestinal inflammation by inhibiting RIPK1-mediated NF-κB activation,suggesting that the otud1-RIPK1 axis could be a potential target for the treatment of IBD.

关键词： otud1 RIPK1 NF-κB IBD

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otud1通过调节RIP2泛素化修饰抑制缺血脑损伤的炎症反应

OTUD1通过调节RIP2泛素化修饰抑制缺血脑损伤的炎症反应

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作者：郑胜男山东大学

学位级别：硕士

脑卒中作为全球范围内的第二大死亡原因,包括缺血性脑卒中和出血性脑卒中,其中缺血性脑卒中为主要类型。目前脑缺血的治疗主要通过静脉溶栓和机械取栓,但仅少数患者受益,因此深入探究脑缺血的病理机制、寻找新的治疗靶点,具有重要的理... 详细信息

脑卒中作为全球范围内的第二大死亡原因,包括缺血性脑卒中和出血性脑卒中,其中缺血性脑卒中为主要类型。目前脑缺血的治疗主要通过静脉溶栓和机械取栓,但仅少数患者受益,因此深入探究脑缺血的病理机制、寻找新的治疗靶点,具有重要的理论意义和实际应用价值。脑缺血病理过程复杂,固有免疫介导的炎症反应在缺血脑损伤病理机制中发挥重要作用。受体相互作用蛋白激酶 2（Receptor-interacting protein kinase 2,RIP2）是 NOD1/2信号转导途径中关键的丝氨酸/苏氨酸/酪氨酸蛋白激酶,是调节炎症过程的关键分子。我们实验室之前的研究发现NOD2介导的炎症反应参与缺血脑损伤,提示我们调控RIP2的活性可以作为治疗脑缺血的潜在靶点。泛素化是RIP2非常重要的翻译后修饰,otud1作为OTU去泛素酶家族的成员之一,是一种干扰素刺激基因,广泛参与固有免疫。然而,otud1是否影响RIP2的泛素水平进而调节脑缺血后的免疫炎症反应参与脑缺血的病理进程值得我们深入探讨。在本课题中我们以otud1对RIP2的调控为核心,通过大脑中动脉栓塞（Middle cerebral artery occlusion,MCAO）及氧糖剥夺（Oxygen and glucose deprivation,OGD）两种模型分别在体内和体外探讨otud1/RIP2在脑缺血中的作用和机制。首先我们发现,RIP2的蛋白水平在脑缺血后的小胶质细胞和星形胶质细胞中明显升高,使用RIP2抑制剂能够明显减轻脑缺血后的炎症以及脑缺血损伤,提示RIP2介导的炎症反应在脑缺血中发挥重要作用。然后通过建立体内体外缺血模型,我们发现在脑缺血之后,otud1的蛋白水平也明显升高,进一步探究其作用机制发现,otud1能够与RIP2相互结合,并去除RIP2的K63多聚泛素链,利用otud1基因敲除小鼠建立MCAO模型,发现敲除otud1后缺血脑损伤加重,同时伴有RIP2泛素化水平增加及炎症增强。以上结果说明otud1通过抑制RIP2泛素化介导的NF-κB激活,减轻脑缺血损伤。综上所述,我们的研究证明otud1通过去除RIP2 K63泛素化修饰,减轻缺血脑损伤引起的炎症反应,保护缺血脑损伤,为脑缺血的治疗提供了潜在的药物作用靶点。

关键词：脑缺血 RIP2 otud1 泛素化修饰炎症

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otud1通过调控P16增强三阴性乳腺癌细胞对多柔比星化疗敏感性的研究

OTUD1通过调控P16增强三阴性乳腺癌细胞对多柔比星化疗敏感性的研...

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作者：周涛浙江省医学科学院

学位级别：硕士

背景乳腺癌(Breast cancer,BC)是全世界女性中最常见的癌症,也是导致全球女性死亡的主要原因之一。三阴性乳腺癌(Triple negative breast cancer,TNBC)由于其高度的异质性是乳腺癌最易转移复发并且预后最差的亚型。由于缺乏相应的治疗受... 详细信息

背景乳腺癌(Breast cancer,BC)是全世界女性中最常见的癌症,也是导致全球女性死亡的主要原因之一。三阴性乳腺癌(Triple negative breast cancer,TNBC)由于其高度的异质性是乳腺癌最易转移复发并且预后最差的亚型。由于缺乏相应的治疗受体,极少数TNBC患者从内分泌治疗或Her2靶向治疗中获益。因此,化疗仍然是TNBC治疗的主要治疗方式,例如以多柔比星(Doxorubicin,Dox)为代表的蒽环类经典化疗药物。然而,接受化疗的TNBC患者表现出频繁的化疗耐药性,导致化疗效果欠佳以及预后不良。目前,关于TNBC产生化疗耐药性的发生发展机制尚未完全阐明,化疗耐药以及后续引发的一系列并发症更是成为综合治疗面临的一个巨大挑战。因此,寻找能够增强TNBC化疗敏感性的潜在治疗靶点,对于提高患者的预后具有极其重要的临床意义。越来越多的证据表明,去泛素化酶(Deubiquitinating enzymes,DUBs)通过对蛋白的去泛素化修饰调节细胞的增殖、分化、凋亡和肿瘤进展。含OTU结构域蛋白1(OTU Domain-Containing Protein 1,otud1)是去泛素化酶OTU家族的成员。最近的研究发现去泛素化酶otud1作为多种癌症的肿瘤抑制因子发挥作用。otud1在多种肿瘤中的表达水平显著下调,通过抑制与肿瘤恶性进展相关的信号通路进而参与调控肿瘤细胞的增殖转移、氧化应激以及化疗耐药等过程。虽然己有多项研究提示otud1参与调控恶性肿瘤的发生发展,但otud1在TNBC化疗耐药中发挥的作用及机制尚未明确。目的本研究中,我们旨在分析otud1在TNBC中的表达水平并探索它在TNBC化疗耐药中的作用及分子调控机制,为寻找TNBC靶向治疗新靶点以及改善患者预后提供新的策略。方法1.利用生物信息学分析otud1在乳腺癌中的表达水平以及预后。2.利用慢病毒转染MDA-MB-231和BT549两种TNBC细胞系,构建otud1稳过表达和敲低的TNBC细胞株。3.利用CCK-8细胞增殖实验、克隆形成实验检测otud1是否参与调控TNBC细胞的增殖能力。4.利用CCK-8细胞活力实验、流氏细胞术、Ki67染色、TUNEL染色分析otud1是否参与调控TNBC细胞对多柔比星的敏感性。5.利用免疫沉淀联合质谱分析otud1潜在的相互作用蛋白,利用蛋白质免疫共沉淀进一步明确otud1与P16的相互作用关系,利用免疫组织化学染色和Western blot分析otud1和P16在TNBC组织中的表达水平以及两者的相关性。6.利用瞬时转染实验、Western blot实验、CCK-8细胞增殖与活力实验以及流式细胞术检测P16是否能够逆转otud1对TNBC细胞Dox敏感性的调控。7.利用裸鼠荷瘤模型进一步评估otud1体内调控TNBC对多柔比星敏感性的作用。结果1.otud1在乳腺癌中的表达水平及预后特征:通过TCGA数据库、GSE61304、GSE76250、GSE22820和免疫组化分析发现,与正常乳腺组织相比,otud1在乳腺癌组织中低表达并且TNBC组织中显著低表达。生存分析表明otud1低表达与患者的无病生存率(DFS)、无进展生存率(PFS)、总生存率(OS)、无复发生存率相关(RFS)呈显著负相关,otud1高表达与具有新辅助化疗史的乳腺癌患者的无复发生存率呈显著正相关。2.otud1抑制TNBC细胞增殖并增强TNBC细胞对DOX的化疗敏感性:RTq PCR和Western blot检测结果显示otud1在TNBC细胞中成功敲低或过表达。体外功能学实验结果表明,过表达otud1显著抑制TNBC细胞的增殖,克隆形成能力并增强DOX对TNBC细胞的细胞毒性作用,增强多柔比星诱导的细胞凋亡并上调凋亡相关蛋白Cleaved-caspase 3、Cleaved-caspase 9的水平。相反,敲低otud1显著促进TNBC细胞的增殖,克隆形成能力,抑制DOX对TNBC细胞的细胞毒性作用,抑制多柔比星诱导的细胞凋亡并下调凋亡相关蛋白Cleaved-caspase 3、Cleavedcaspase 9的水平。3.otud1增强体内TNBC细胞对DOX敏感性:同时给予生理盐水或同时给予化疗药物DOX后,otud1过表达组裸鼠移植瘤的体积瘤重均低于对照组,Ki67染色强度较低且TUNEL阳性细胞率较高。并且在otud1过表达联合化疗药物DOX组中,裸鼠移植瘤的体积瘤重在四个组别最低,Ki67染色强度最弱,TUNEL阳性细胞率最高。4.otud1-P16轴可能作为调控TNBC细胞对DOX敏感性的关键信号轴:免疫沉淀联合质谱分析表明P16可能是otud1潜在的互作蛋白,免疫共沉淀进一步验证otud1与P16相互作用。此外,TNBC组织标本免疫组化结果显示otud1与P16的蛋白表达水平呈正相关。Western blot

关键词：化疗敏感性 P16 多柔比星凋亡 otud1

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去泛素化酶otud1通过稳定NRF2减轻肝脏缺血再灌注损伤

去泛素化酶OTUD1通过稳定NRF2减轻肝脏缺血再灌注损伤

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作者：陈子涵华中科技大学

学位级别：硕士

肝脏缺血再灌注(ischemia-reperfusion,I/R)损伤是肝脏手术中影响术后死亡率的常见并发症。再灌注阶段会产生大量活性氧导致氧化应激,造成组织损伤。泛素蛋白酶体系统是常见的蛋白质翻译后修饰系统,可参与调控细胞生命活动。探究肝脏I/... 详细信息

肝脏缺血再灌注(ischemia-reperfusion,I/R)损伤是肝脏手术中影响术后死亡率的常见并发症。再灌注阶段会产生大量活性氧导致氧化应激,造成组织损伤。泛素蛋白酶体系统是常见的蛋白质翻译后修饰系统,可参与调控细胞生命活动。探究肝脏I/R中关键抗氧化蛋白的泛素化与去泛素化的动态修饰机制至关重要。核因子E2相关因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2,NRF2)通过与DNA上的抗氧化反应元件结合,靶向调控下游基因表达从而发挥抗氧化作用。NRF2的泛素化机制已有研究,但在肝脏I/R中,NRF2的去泛素化机制尚未阐明。本课题通过转录组测序发现去泛素化酶卵巢肿瘤结构域蛋白酶1(ovarian tumor domain-containing protein 1,otud1)在小鼠肝脏I/R中显著升高,且双荧光素酶报告基因实验显示otud1上调NRF2转录活性,故推测otud1通过去泛素化NRF2、激活NRF2信号通路调控肝脏I/R。为此,本文对肝脏I/R过程中otud1去泛素化NRF2的功能及机制展开研究。本课题首先证明otud1在小鼠肝脏I/R模型及肝细胞缺氧复氧(hypoxiareoxygenation,H/R)模型中显著上调。随后通过血清转氨酶水平、苏木精-伊红染色、TUNEL等实验发现敲除otud1可加重肝脏I/R及肝细胞H/R诱导的损伤,过表达otud1则减轻缺血再灌注引起的肝组织及肝细胞损伤。之后通过免疫共沉淀、双荧光素酶报告基因实验、竞争性IP等实验发现otud1可以激活NRF2的转录活性,并通过其去泛素化酶活性及ETGE基序剪切NRF2上的泛素链从而调节NRF2。最后,在敲除NRF2的L02细胞系中过表达otud1,通过流式、Western Blot实验证明otud1的保护作用依赖于NRF2。综上所述,在小鼠肝脏I/R损伤中,otud1显著上调,稳定NRF2的蛋白表达,并激活NRF2下游抗氧化基因,从而抑制细胞凋亡、炎症及氧化应激,减轻肝脏I/R损伤。

关键词：肝脏缺血再灌注损伤去泛素化酶 otud1 NRF2 氧化应激

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去泛素化酶otud1通过促进Parkin降解参与帕金森病

去泛素化酶OTUD1通过促进Parkin降解参与帕金森病

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作者：吴梦婷山东大学

学位级别：硕士

帕金森病（Parkinson’s Disease,PD）是一种由于中脑黑质致密部多巴胺能神经元发生进行性丢失而导致的神经退行性疾病,其发病机制目前尚不明确,大量的研究表明帕金森病是基因和环境共同作用的结果。根据发病机制不同可以将PD分为家族... 详细信息

帕金森病（Parkinson’s Disease,PD）是一种由于中脑黑质致密部多巴胺能神经元发生进行性丢失而导致的神经退行性疾病,其发病机制目前尚不明确,大量的研究表明帕金森病是基因和环境共同作用的结果。根据发病机制不同可以将PD分为家族性PD和散发性PD。其中,编码E3泛素连接酶Parkin的基因parkin发生异常突变是导致常染色体隐性遗传性PD最常见的原因,由于Parkin介导的线粒体自噬在维持线粒体稳态中发挥极大的作用,因此,除了参与家族性PD的发病机制,Parkin蛋白功能异常还会导致散发性PD的发生。Parkin的泛素化水平与自身的活性及稳定性关系密切,泛素化修饰是一个可逆的过程,Parkin上连接的泛素链也能够被去泛素化酶水解移除,目前关于“去泛素化酶参与调控Parkin功能或稳定性”的报道甚少,因此,我们首先从OTU家族中筛选出了作用于Parkin的去泛素化酶otud1,发现otud1通过与Parkin相互结合并依赖自身的酶活性对Parkin进行去泛素化,负调Parkin的蛋白水平,同时减少Parkin向受损线粒体的招募。进一步研究发现,otud1主要通过去除Parkin上连接的多聚泛素链,促进该分子通过自噬溶酶体途径降解,从而降低Parkin的蛋白水平。此外,我们进一步在体内实验中证实了 otud1缺失能够减轻MPTP诱导的小鼠PD模型中多巴胺能神经元的损伤,改善小鼠的运动能力,这可能与上调Parkin的蛋白水平有关。综上所述,本课题研究阐明了去泛素化酶otud1作为Parkin的重要调节蛋白,通过去泛素化修饰作用调控Parkin蛋白的稳定性,影响线粒体稳态并最终参与帕金森病的发生与发展。该研究丰富了 Parkin蛋白稳定性的调节机制,为揭示帕金森病的发病机制提供了新的思路,otud1也因此成为临床防治帕金森病的又一新的潜在靶点。

关键词：帕金森病 otud1 Parkin 去泛素化线粒体功能障碍

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第一部分：otud1在食管癌耐药过程中的功能及分子机制研究第二部分：长链非编码RNA LOC101927476在卵巢癌转移中的功能及机制研究

第一部分：OTUD1在食管癌耐药过程中的功能及分子机制研究第二部...

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作者：赵鹏飞北京协和医学院

学位级别：硕士

食管癌属于较为常见的消化道肿瘤之一,其发病率和死亡率在亚洲地区位居前列,而化疗耐药的产生是导致食管癌预后较差的一个重要因素。越来越多的研究表明,蛋白质翻译后修饰在肿瘤发展过程中扮演着重要角色。泛素化修饰属于蛋白质翻译后... 详细信息

食管癌属于较为常见的消化道肿瘤之一,其发病率和死亡率在亚洲地区位居前列,而化疗耐药的产生是导致食管癌预后较差的一个重要因素。越来越多的研究表明,蛋白质翻译后修饰在肿瘤发展过程中扮演着重要角色。泛素化修饰属于蛋白质翻译后修饰的一种,泛素连接酶通过三步级联反应将不同类型的泛素链连接到底物上,来调控底物蛋白的稳定性或生理活性。去泛素化酶可以水解底物分子上不同的泛素链,逆转泛素化修饰的过程。通过裸鼠皮下成瘤实验筛选以及耐药细胞系的验证,我们发现去泛素化酶otud1与食管鳞状细胞癌的化疗耐药有着密切的关系。通过对122例食管癌病人的样本分析,我们发现otud1的低表达与不良预后有显著的相关性。功能缺失和获得实验表明,过表达野生型otud1（otud1wt）能够显著抑制食管鳞癌细胞KYSE30和KYSE180的细胞活性,并且显著提高了KYSE30和KYSE180细胞对顺铂处理的敏感性,而过表达突变体otud1（otud1C320A）则不具备这些效果。敲降otud1显著抑制了 KYSE150和YES2细胞对顺铂处理的敏感性,但是并不影响其增殖能力。进一步研究表明otud1通过促进食管鳞癌细胞的凋亡来影响其细胞活性,并且这种凋亡不依赖于caspase级联信号的激活。裸鼠皮下成瘤实验表明,otud1wt能够在体内抑制肿瘤细胞的生长,同时,在给与顺铂处理后,与对照组以及过表达otud1C320A组的小鼠相比,过表达otud1wt组的小鼠表现出更好地治疗效果。为了进一步探究otud1促进细胞凋亡的机制,我们通过质谱寻找到了与otud1有相互作用的蛋白AIF,并且发现otud1wt能够促进AIF的核转位,而otud1C320A则不具备这种功能。因此我们推测可能otud1通过促进AIF进入细胞核,进而导致了食管癌细胞的凋亡。综上所述,我们筛选出食管鳞状细胞癌耐药相关去泛素化酶otud1,且发现otud1通过促进AIF的核转位降低食管癌细胞对顺铂的耐药性,并促进食管癌细胞的凋亡,为解决食管癌化疗耐药提供了新的思路。卵巢癌是常见的妇科肿瘤之一,其发病率在女性生殖系统恶性肿瘤中排名第三,但是致死率居妇科恶性肿瘤之首。由于卵巢体积较小且所处位置特殊,常规的妇科体检很难发现早期卵巢病变,加之卵巢癌患者在早期并无明显症状,因此,约有70%的卵巢癌患者在确诊时已经进展至晚期。卵巢癌的发生与发展与多种因素有关,其具体机制目前尚不明确。长链非编码RNA（Long non-coding RNA,LncRNA）是一类长度大于200个核苷酸且不具备编码蛋白能力的一类小分子RNA。越来越多的研究表明LncRNA在包括肿瘤在内的多种疾病中发挥着至关重要的作用,但是LncRNA在卵巢癌发生与发展中的作用机制仍不明确。在本研究中,我们在5对卵巢癌原发瘤与对应的转移瘤进行转录组测序,发现LncRNALOC101927476在卵巢癌转移灶中表达显著低于原发灶,首先,我们在22例患者中验证,结果显示,有20例患者的转移灶中LOC101927476的表达量低于原发灶。然后,我们在细胞水平研究了 LOC101927476对卵巢癌细胞表型的影响,结果显示,LOC101927476抑制了卵巢癌细胞的侵袭和迁移能力,并且对卵巢癌细胞的体外增殖有明显的抑制作用。机制上,我们发现LOC101927476与锌指转录因子GATA4存在高度的表达正相关性,并且LOC101927476能够促进GATA4的mRNA转录,因此我们推测LOC101927476可能通过调节GATA4的表达来影响卵巢癌的恶性表型。

关键词：食管鳞状细胞癌 otud1 AIF 化疗耐药卵巢癌长链非编码RNA LOC101927476 侵袭迁移

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去泛素化酶otud1通过PI3K/AKT通路抑制肺腺癌细胞的增殖和侵袭迁移

去泛素化酶OTUD1通过PI3K/AKT通路抑制肺腺癌细胞的增殖和侵袭迁移

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作者：周熙佳山东大学

学位级别：硕士

目的:蛋白质的泛素化和去泛素化的过程广泛存在于人体的各种分子反应中,并与多种疾病的发生发展相关。去泛素化酶（deubiquitinating enzymes,DUBs）是一种蛋白质去泛素化反应中的关键酶,可从各种底物上裂解小分子泛素（ubiquitin,Ub）... 详细信息

目的:蛋白质的泛素化和去泛素化的过程广泛存在于人体的各种分子反应中,并与多种疾病的发生发展相关。去泛素化酶（deubiquitinating enzymes,DUBs）是一种蛋白质去泛素化反应中的关键酶,可从各种底物上裂解小分子泛素（ubiquitin,Ub）以保持蛋白质稳定性。卵巢肿瘤含域蛋白酶-1（ovarian tumor domain-containing protease-1,otud1）是 DUBs 的一种,其在肺腺癌（lung adenocarcinoma,LUAD）中的作用机制尚不清楚。本研究通过生物信息学的方法筛选在LUAD组织中差异表达的DUBs,通过免疫组化实验对筛选出的差异表达分子otud1的表达情况进行验证,并通过细胞功能实验和裸鼠成瘤实验明确otud1在LUAD中的生物学功能和分子机制,进而研究otud1是否可以作为LUAD诊断的标志物和靶向治疗的潜在靶点。方法:1.候选DUBs的筛选:差异表达的DUBs由GEO数据库的测序数据集筛选得出,使用Oncomine和GEPIA在线生信分析网站验证otud1在LUAD中的差异表达情况,并使用Kaplan-Meierplotter数据库对otud1的预后价值进行评估。2.验证otud1在LUAD组织中的表达:通过免疫组化方法检测92例LUAD患者癌组织和88例对应的癌旁组织中otud1的表达情况,同时根据研究对象的临床病理资料评估otud1的临床意义。3.细胞功能实验:以pcdna3.1（+）为载体,设计otud1过表达质粒,使用lipo3000为转染试剂,在A549和H1299细胞系中进行otud1过表达。设计3条小干扰RNA序列,使用RNAiMAX为转染试剂,在H1975细胞系中进行otud1敲减。otud1的过表达和敲减效率由WB实验检测。通过Transwell侵袭迁移实验,划痕实验和CCK-8增殖实验研究otud1在LUAD细胞中的功能。4.PI3K/AKT信号通路功能验证:分别在A549,H1299和H1975细胞系中加入PI3K-IN-1抑制PI3K/AKT通路,观察细胞中PI3K,p-AKT和otud1的表达量,验证PI3K/AKT通路是否抑制成功;同时通过CCK-8增殖实验和Transwell实验研究抑制PI3K/AKT通路后LUAD细胞的增殖和转移的是否发生改变。5.研究otud1在LUAD中的作用机制:分别在H1299和H1975细胞系中进行otud1的过表达和敲减,提取蛋白质后,通过WB实验研究与对照组相比,改变otud1的表达后细胞中PI3K,p-AKT分子的表达量的改变,研究otud1对PI3K/AKT信号通路的影响。6.otud1作用机制的验证:以单纯过表达或敲减otud1处理的细胞为对照组,以过表达或敲减otud1后抑制PI3K/AKT信号通路的细胞为实验组,设计恢复试验（rescue实验）,通过CCK-8增殖实验和Transwell实验研究过表达或敲减otud1后,再抑制PI3K/AKT信号通路,是否会使细胞的增殖和转移发生改变或恢复。7.小鼠成瘤实验验证otud1对LUAD肿瘤生长的作用:构建过表达otud1的慢病毒,分别用NC和过表达otud1的慢病毒转染A549细胞。选择裸鼠进行实验,观察实验组和对照组成瘤的大小,处死小鼠后测量成瘤的质量,并进行统计分析,判断两组小鼠肿瘤的生长是否具有一定的差异。结果:1.使用GEO2R分析GSE19804和GSE27262两个数据集的差异表达基因,并取交集,发现otud1在两个数据集中均存在明显低表达,初步筛选出otud1作为候选分子进行研究。2.使用Oncomine和GEPIA在线分析工具进行生信分析,验证了 otud1在LUAD组织中明显低表达,并通过Kaplan-Meierplotter数据库分析得知,otud1的低表达与患者的不良预后有关,具有一定的临床意义。3.通过对92例肺腺癌患者癌组织和88例对应的癌旁组织进行免疫组化实验,证明otud1在肺腺癌患者癌组织中存在明显低表达（P＜0.01）,符合生信分析预测结果。但otud1表达情况与患者的其他临床病理特征,如年龄,性别,TNM分期,ALK突变情况等无明显关联。4.CCK-8增殖实验表明,过表达otud1后,A549细胞和H1299细胞的增殖均出现了明显的抑制,以培养48h和72h后表现更为明显。在敲减otud1后,H1975细胞的增殖出现了明显的增强,以培养48h和72h后表现更为明显。5.划痕实验和Transwell实验表明,过表达otud1后,A549细胞和H1299细胞的侵袭和迁移均出现了明显的抑制。在敲减otud1后,H1975细胞的侵袭和迁移出现了明显的增强。6.分别在A549,H1299和H1975细胞系中加入PI3K-IN-1抑制剂,抑制PI3K/AKT信号通路,通过WB实验验证,细胞中otud1的表

关键词： otud1 去泛素化酶肺腺癌 PI3K/AKT信号通路

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去泛素化酶otud1通过稳定Notch2蛋白激活CD4 T细胞促进aGVHD发生发展

去泛素化酶OTUD1通过稳定Notch2蛋白激活CD4 T细胞促进aGVHD发生...

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第十四届全国免疫学学术大会

作者：程巧王栋徐杨吴德沛苏州大学附属第一医院

目的:探究去泛素化酶otud1在异基因造血干细胞移植后aGVHD中的作用及机制。方法:体外分选CD4 T细胞,研究otud1在T细胞激活、增殖和异基因反应中的作用;构建小鼠aGVHD模型,探究供体otud1缺失在小鼠aGVHD中的作用及免疫细胞表型变化;采用... 详细信息

目的:探究去泛素化酶otud1在异基因造血干细胞移植后aGVHD中的作用及机制。方法:体外分选CD4 T细胞,研究otud1在T细胞激活、增殖和异基因反应中的作用;构建小鼠aGVHD模型,探究供体otud1缺失在小鼠aGVHD中的作用及免疫细胞表型变化;采用蛋白组学测序和质谱筛选otud1底物蛋白;采用免疫共沉淀和confocal等方法检测otud1与Notch2共定位以及对Notch2蛋白和泛素水平的影响;构建Notch2胞外段、跨末段和胞内段质粒,采用Mapping方法研究otud1调节Notch2的哪个结构域;采用Real-time qPCR方法检测临床患者移植前后外周血中otud1和Notch2下游靶基因(Hes1,Hes5,Hey2,HeyL)的表达;构建小鼠GVL模型,研究靶向otud1抑制aGVHD的同时对GVL效应的影响。结果:靶向otud1抑制CD4 T细胞激活、增殖和异基因反应;供体otud1缺失显著改善小鼠aGVHD的发病程度,延长生存周期;供体otud1缺失抑制aGVHD小鼠体内T细胞的激活和分化;otud1缺失严重破坏激活的CD4 T细胞中Notch2蛋白稳定性及其下游的TCR信号转导;otud1与Notch2蛋白结合,调节Notch2泛素化修饰且依赖于其去泛素化酶活性;otud1与Notch2蛋白的胞内段结合并稳定胞内段蛋白;患者otud1的表达水平能有效预测移植后aGVHD的发病率和总体生存率,otud1在移植后患者体内的表达水平与Notch2下游的靶基因Hes1,Hes5呈正相关;靶向敲除otud1在抑制aGVHD的同时也能保留GVL效应。讨论与结论:去泛素化酶otud1通过稳定Notch2蛋白激活CD4 T细胞介导异基因反应从而加重aGVHD的发生发展,同时并不影响GVL效应。去泛素化酶otud1的表达水平能有效预测移植后患者aGVHD发病率和总体生存率,且与Notch2下游靶基因呈正相关。靶向otud1为临床防治aGVHD提供新的治疗策略。

关键词：造血干细胞移植 aGVHD 泛素化修饰 otud1 Notch2 T细胞激活

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去泛素化酶otud1在宿主抗肿瘤免疫中的功能研究

去泛素化酶OTUD1在宿主抗肿瘤免疫中的功能研究

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第十四届全国免疫学学术大会

作者：宋佳吕丹北京大学医学部基础医学院

作为生物体所必需的微量元素,铁离子参与了细胞的增殖、代谢和分化。铁死亡是一种铁依赖性的调节性细胞死亡形式,其主要特征是脂质过氧化物的过度积累。铁死亡与神经系统疾病、急性肾损伤等多种疾病相关。此外,铁死亡也有助于肿瘤的免... 详细信息

作为生物体所必需的微量元素,铁离子参与了细胞的增殖、代谢和分化。铁死亡是一种铁依赖性的调节性细胞死亡形式,其主要特征是脂质过氧化物的过度积累。铁死亡与神经系统疾病、急性肾损伤等多种疾病相关。此外,铁死亡也有助于肿瘤的免疫清除。目前已经发现多种氧化还原酶参与铁死亡的生物学过程,但是其关键调节因子——铁离子的代谢机制,目前尚未完全明晰。本课题组通过大数据筛选,鉴定到了去泛素化酶otud1在结肠癌组织中特异性下调表达,临床信息分析结果显示,otud1的低表达与肿瘤患者不良的预后相联系。体内实验表明,过表达otud1能够显著抑制肿瘤的大小,并延长荷瘤小鼠的生存时间。机制研究表明,otud1能够直接结合铁反应元件结合蛋白2(IREB2),并通过去除IREB2 K48连接的泛素化修饰增强其稳定性,进而激活其下游铁离子转运受体(TFRC)的表达。TFRC的表达上调进一步导致细胞内铁离子聚集、ROS水平增高以及细胞对铁死亡的敏感性增加。此外,otud1的存在促进了损伤相关分子模式(DAMPs)的释放,从而招募更多免疫细胞,提高宿主抗肿瘤免疫应答的能力,促进肿瘤细胞的免疫清除作用。相反,otud1的缺失限制了肿瘤反应性T细胞的聚集,并加剧了结肠癌的进展。我们的研究结果表明,otud1在铁转运中起促进作用,并强调了otud1-IREB2-TFRC信号轴在宿主抗肿瘤免疫中的重要性。本项研究为全面阐明肠癌细胞免疫逃逸过程提供了一种全新的机制,同时也为肠癌的免疫治疗提供了潜在的新型药物靶点。

关键词： otud1 铁死亡铁离子转运肿瘤免疫逃逸

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去泛素化酶otud1在自身免疫性疾病中的功能与作用分析

去泛素化酶OTUD1在自身免疫性疾病中的功能与作用分析

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第十三届全国免疫学学术大会

作者：吕丹宋佳北京大学医学部

自身免疫性疾病常伴有固有免疫系统调控紊乱、干扰素表达上调的表现。尽管适量干扰素具有维持人体的免疫稳态、抵抗病毒感染的作用,然而,大量干扰素的产生则可以加重炎症反应,对人体造成免疫性损伤。本课题组通过大数据高通量分析,鉴定... 详细信息

自身免疫性疾病常伴有固有免疫系统调控紊乱、干扰素表达上调的表现。尽管适量干扰素具有维持人体的免疫稳态、抵抗病毒感染的作用,然而,大量干扰素的产生则可以加重炎症反应,对人体造成免疫性损伤。本课题组通过大数据高通量分析,鉴定到了具有免疫调节功能的otud1分子,并发现该基因在自身免疫性疾病患者体内发生高频突变,突变后的otud1则丧失原有的免疫抑制功能。转录因子IRF3作为固有免疫应答的核心分子,其转录活性调控机制的研究一直是免疫学领域的热点。我们发现otud1作为IRF3的去泛素化酶,在炎症状态下上调表达,特异性抑制IRF3的K63型多泛素化修饰,从而抑制IRF3的核定位和转录活性,最终缓解体内过强的炎症反应、降低人体发生自身免疫性疾病的风险。此外,我们的研究还发现,参与调控免疫细胞发育与分化的转录因子FOXO3,对otud1在炎症中上调表达发挥着必不可少的作用。本课题组的发现阐释了一种新的调控固有免疫反应机制,拓展了人们对自身免疫性疾病发病机制的认识,此项研究也为自身免疫性疾病的诊断和小分子化合物治疗提供了新的靶点。

关键词： otud1 自身免疫性疾病 IRF3

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