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生物化学与生物物理进展 2009年第6期36卷 709-714页

作者：向波王理易梅欧阳珏李夏雨张祖萍李小玲李桂源中南大学肿瘤研究所长沙410078 中南大学湘雅医院皮肤科长沙410078

NOR1基因是新的鼻咽癌相关基因,该基因在鼻咽癌细胞系HNE1和鼻咽癌组织中表达下调.在鼻咽癌细胞HNE1中恢复NOR1基因表达抑制了鼻咽癌细胞的生长和增殖能力.为了探讨NOR1基因的生物学功能,以NOR1基因为诱饵运用酵母双杂交技术在人胎脑文... 详细信息

NOR1基因是新的鼻咽癌相关基因,该基因在鼻咽癌细胞系HNE1和鼻咽癌组织中表达下调.在鼻咽癌细胞HNE1中恢复NOR1基因表达抑制了鼻咽癌细胞的生长和增殖能力.为了探讨NOR1基因的生物学功能,以NOR1基因为诱饵运用酵母双杂交技术在人胎脑文库中筛选其交互作用蛋白,挑选阳性克隆,进行DNA序列分析和同源检索,阳性克隆编码7个不同的蛋白质,其中一个阳性克隆编码线粒体ATP合成酶亚基oscp蛋白.瞬时转染pCMV-myc-NOR1质粒进入鼻咽癌5-8F细胞,通过密度梯度离心法分离线粒体蛋白,Western blot检测表明myc-NOR1蛋白分布于线粒体与胞浆.免疫荧光检测表明在鼻咽正常上皮细胞NP69中内源性NOR1蛋白与线粒体存在明显共定位.随后采用特异性酵母双杂交、免疫荧光共定位、免疫共沉淀技术证实了NOR1与oscp在线粒体内存在交互作用.提示,NOR1是一个新的线粒体蛋白,可能通过结合oscp蛋白调控细胞能量代谢,为深入探讨其功能提供了重要线索.

关键词： NOR1 酵母双杂交 oscp 蛋白质相互作用

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一种开放式电子政务身份认证模型的研究

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控制工程 2017年第6期24卷 1230-1236页

作者：卜质琼郑波尽广东技术师范学院管理学院广州510665 中南民族大学计算机学院武汉430074

为解决传统电子政务身份认证模型所存在的诸如可实施性差、验证结果缺乏证明、低可信度等问题,设计一种开放式的电子政务身份认证模型,该模型中CA(Certificate Authority)中心独立进行2个验证服务,把传统的OCSP(Online Certificate Stat... 详细信息

为解决传统电子政务身份认证模型所存在的诸如可实施性差、验证结果缺乏证明、低可信度等问题,设计一种开放式的电子政务身份认证模型,该模型中CA(Certificate Authority)中心独立进行2个验证服务,把传统的OCSP(Online Certificate Status Protocol)应答机制更改成提供身份证明文件的方式,能够较好地解决上述缺陷。利用云信任评估模型,量化评估这2种认证模型,验证提出的开放式身份认证模型的信任度有了较大提升。此外,对该模型进行原型实现,重点优化了其性能,实验表明该模型具备较好的实用价值。

关键词：电子政务 CA中心 oscp 验证服务云信任

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大鼠寡霉素敏感相关蛋白的克隆及原核表达载体的构建

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作者：范海鸣天津医科大学

学位级别：硕士

目的:心肌梗死已经成为严重危害人类健康的主要心血管疾病之一。心肌梗死早期心肌缺血预适应主要通过改善心肌细胞的能量代谢对心肌产生保护作用。ATP合酶是细胞能量代谢中最重要的酶,寡霉素敏感相关蛋白(oligomycinsensitivity-conferr... 详细信息

目的:心肌梗死已经成为严重危害人类健康的主要心血管疾病之一。心肌梗死早期心肌缺血预适应主要通过改善心肌细胞的能量代谢对心肌产生保护作用。ATP合酶是细胞能量代谢中最重要的酶,寡霉素敏感相关蛋白(oligomycinsensitivity-conferring protein,oscp)作为ATP合酶上受到寡霉素调节的部位,直接参与能量代谢的调节。因此,通过对oscp敏感部位基因转录及表达调控的研究可能为从调节能量代谢角度研究预适应心肌保护作用的机制提供新的方向。故本实验旨在通过克隆大鼠oscp基因全长cDNA,并构建重组原核表达载体,为后续oscp蛋白表达、活性鉴定及抗体制备等方面的研究工作奠定基础。方法:本实验采用RT-PCR等分子生物学技术对oscp基因进行了扩增和克隆方面的研究,具体如下: 1.提取大鼠脑组织总RNA:采用一步法从新鲜大鼠脑组织中提取总RNA。紫外分光光度计测量其在260 nm和280 nm波长的光密度,计算A/A比值确定总RNA的纯度;根据测定的A值计算RNA的浓度;甲醛变性琼脂糖凝胶电泳鉴定总RNA的完整性。 ***-PCR:根据GeneBank中大鼠oscp基因序列,采用国际通用的分子生物学软件Primer 5.0和Oligo 4.01分别设计上、下游引物: 上游引物为:5′-AGGATCCATGGCCGCACCAGCAAC-3′ 下游引物为:5′-AGTCGACTCAGAGCAGATCCCGCATG-3′ 其中上游引物中引入了限制性内切酶BamH I的识别位点GGATCC,下游引物中引入了限制性内切酶Sal I的识别位点GTCGAC。引物的合成由上海生工生物公司完成,用于RT-PCR反应。采用Oligo(dT)为逆转录引物,以mRNA为模板,在逆转录酶的作用下合成与mRNA互补的单链DNA。用Pfu DNA聚合酶进行PCR扩增目的基因oscp,以增加扩增基因的保真性。扩增产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳鉴定。 3.重组克隆载体的构建及鉴定:将PCR产物回收纯化后,将其与克隆载体pTA2进行连接。将连接产物转化感受态细菌*** DH5α。扩增转化后的细菌,碱裂解法提取质粒,用EcoR I进行酶切鉴定及PCR鉴定,筛选出阳性重组质粒。进行基因序列测定,测序结果用Gene Runner、BLAST软件进行分析。 4.重组表达载体的构建及鉴定:重组质粒pTA2-oscp经BamH I和Sal I双酶切后进行纯化,将回收的目的片段oscp与经同样酶切和纯化的原核表达载体pQE30-Xa片段用T DNA连接酶连接。将连接产物转化感受态细菌*** DH5α。扩增转化后的细菌,碱裂解法提取质粒,用BamH I和Sal I进行双酶切鉴定及PCR鉴定,筛选出阳性重组质粒。进行基因序列测定,测序结果用Gene Runner、BLAST软件进行分析。结果:本实验对总RNA、RT-PCR产物、重组克隆载体和重组表达载体均进行了检测和鉴定,如下: 1.总RNA的纯度、浓度及完整性检测:总RNA的OD/OD为1.87,纯度较好;RNA浓度为2989.8μg/ml;甲醛变性琼脂糖凝胶电泳结果表明所提总RNA完整性较好。 2.目的基因片段的RT-PCR扩增:RT-PCR产物经1.2%的琼脂糖凝胶电泳,在约700 bp处出现一清晰的特异性条带,与已发表的oscp基因序列大小相同。 3.重组克隆载体的鉴定:重组质粒pTA2-oscp经EcoR I单酶切鉴定,得到约3000 bp的线性片段和约700 bp的插入片段,结果与预期设计大小相符;重组质粒pTA2-oscp经PCR鉴定,得到约700 bp的PCR产物,结果与预期设计大小相符;选取阳性重组质粒进行测序,测序结果与GeneBank数据库进行比较分析,显示与已公布的大鼠oscp基因序列同源性为100%。 4.重组表达载体的鉴定:pQE30-Xa-oscp经BamH I、Sal I双酶切鉴定,得到约为3500 bp和约700 bp的两条线性片段,结果与预期设计大小相符;pQE30-Xa-oscp经PCR鉴定,得到约700 bp的PCR产物,结果与预期设计大小相符;选取阳性重组质粒进行测序,测序结果与GeneBank数据库进行比较分析,显示与已公布的大鼠oscp基因序列同源性为100%。结论:本实验成功克隆了大鼠oscp基因全长cDNA序列,并构建了重组克隆载体pTA2-oscp和重组原核表达载体pQE30-Xa-oscp。

关键词： oscp 重组oscp原核表达载体 ATP合酶能量代谢心肌缺血预适应

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大鼠寡霉素敏感相关蛋白的克隆及真核表达载体的构建

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作者：张建红天津医科大学

学位级别：硕士

目的: 心血管疾病由于其发病率和病死率很高,已成为危害人类健康的头号杀手,而细胞能量代谢障碍又是引发心血管疾病的重要原因,寻求有效治疗细胞能量代谢障碍的药物,是当前研究的热点。寡霉素敏感相关蛋白(oligomycinsensitivity-confer... 详细信息

目的: 心血管疾病由于其发病率和病死率很高,已成为危害人类健康的头号杀手,而细胞能量代谢障碍又是引发心血管疾病的重要原因,寻求有效治疗细胞能量代谢障碍的药物,是当前研究的热点。寡霉素敏感相关蛋白(oligomycinsensitivity-conferring protein,oscp)作为ATP合酶的一个重要亚基,在细胞能量代谢中发挥着重要作用。缺血预适应(ischemic preconditioning,IPC)对缺血心肌的保护作用与ATP合酶活性的升高有密切关系。本实验采用基因工程的方法克隆ATP合酶中的oscp基因,并构建其真核表达载体,这为以后对该基因在真核细胞中过表达、蛋白活性的检测以及研究oscp在细胞能量代谢、IPC中的作用奠定了基础。方法: 1.扩增大鼠oscp基因:首先取SD大鼠脑组织50 mg左右,依照Trizol试剂说明书中步骤提取总RNA。根据oscp基因的开放阅读框设计合成一对引物。用RT-PCR方法扩增出编码oscp基因的全长序列,分离纯化PCR产物。 2.构建重组克隆载体pTA2-oscp:将PCR产物与pTA2克隆载体连接,连接产物转化入*** JM109感受态细菌,摇菌扩增,提取质粒DNA,用EcoR I进行酶切鉴定,筛选出阳性重组质粒进行DNA序列测定,测序结果用GeneRunner软件分析。 3.构建重组表达载体pEGFP-N-oscp:重组质粒pTA2-oscp和真核表达载体pEGFP-N分别经BglⅡ/EcoR I酶切,然后通过T连接酶连接,转化入***5α感受态细菌,摇菌扩增,提取质粒DNA。经BglⅡ/EcoR I酶切鉴定,筛选出阳性重组质粒进行DNA序列测定,测序结果用Gene Runner软件分析。结果: ***基因的的RT-PCR扩增:总RNA的OD/OD为1.87,纯度符合实验要求;甲醛变性琼脂糖凝胶电泳结果表明所提总RNA的完整性好;琼脂糖凝胶电泳结果显示RT-PCR产物的长度约为700 bp,与预期结果相符。 2.重组克隆载体pTA2-oscp的鉴定:重组克隆载体pTA2-oscp经EcoR I限制性内切酶鉴定,得到约3000 bp的线性片段和约700 bp的插入片段,与预期结果相符;选取阳性克隆载体进行测序,与已公布的大鼠oscp基因序列比较分析,同源性为100%。证明pTA2-oscp重组克隆载体构建成功。 3.重组表达载体pEGFP-N-oscp的鉴定:重组表达载体pEGFP-N-oscp经BglⅡ/EcoR I双酶切得到约为4700 bp的线性片段和约700 bp的插入片段,与预期结果相符;选取阳性重组表达载体进行测序分析,与已公布的大鼠oscp基因序列比较,同源性为100%。证明重组表达载体pEGFP-N-oscp构建成功。结论: 1.通过RT-PCR扩增出了大鼠oscp基因。 2.重组克隆载体pTA2-oscp构建成功。 3.重组真核表达载体pEGFP-N-oscp构建成功。

关键词： oscp 重组oscp真核表达载体 ATP合酶能量代谢心肌缺血预适应

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