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猪圆环病毒2型orf4基因编码蛋白的体外表达

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中国兽医科学 2008年第10期38卷 837-841页

作者：李增魁陈婷飞李益飞周继勇青海大学农牧学院青海西宁810003 浙江大学动物科学院浙江杭州310029

为了探讨猪圆环病毒2型(PCV-2)orf4基因结构及其所编码蛋白在PK15细胞中的表达特性,以PCV-2杭州株病毒DNA为模板进行PCR,结果扩增出了orf4基因,并分别构建了pGEX-4T-1-orf4原核表达载体和pEGFP-C2-orf4真核表达载体。序列分析、SDS-PAG... 详细信息

为了探讨猪圆环病毒2型(PCV-2)orf4基因结构及其所编码蛋白在PK15细胞中的表达特性,以PCV-2杭州株病毒DNA为模板进行PCR,结果扩增出了orf4基因,并分别构建了pGEX-4T-1-orf4原核表达载体和pEGFP-C2-orf4真核表达载体。序列分析、SDS-PAGE分析和Western-blot检测表明,PCV-2 orf4基因长180 bp,共编码60个氨基酸;其编码蛋白在大肠杆菌中以包涵体形式存在,分子质量大小约为6.685 ku。真核PK15细胞的转染试验显示,orf4重组蛋白在PK15细胞的细胞核和细胞浆中均有表达,但对其有一定的毒性。

关键词：猪圆环病毒2型 orf4基因原核表达真核表达纯化

猪圆环病毒Ⅱ型 orf3、orf4、orf5编码产物的体外表达

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猪圆环病毒Ⅱ型 ORF3、ORF4、ORF5编码产物的体外表达

作者：李增魁浙江大学

学位级别：硕士

PCV-2属于圆环病毒科(Circoviridae)，可引起猪断奶后多系统衰竭综合症(PMWS)，给世界养猪业造成相当大的经济损失。到目前为止，对该病的致病机理还不完全清楚。PCV-2有11个阅读框，目前已知orf1编码与病毒复制相关的Rep蛋白，而orf2... 详细信息

PCV-2属于圆环病毒科(Circoviridae)，可引起猪断奶后多系统衰竭综合症(PMWS)，给世界养猪业造成相当大的经济损失。到目前为止，对该病的致病机理还不完全清楚。PCV-2有11个阅读框，目前已知orf1编码与病毒复制相关的Rep蛋白，而orf2则因其编码的蛋白具有良好的免疫反应性而成为一个研究热点，但针对其他阅读框的研究却很少。本研究通过PCR扩增，以PCV-2-HZ0201为模板成功克隆了PCV-2-orf3，orf4基因，以PCV-2美国株为模板克隆了orf5基因，并成功构建了orf3，orf4，orf5基因的原核表达载体，得到了orf3，orf4的纯化蛋白，并利用绿色荧光蛋白(EGFP)对上述三种基因编码的重组蛋白进行了真核PK-15细胞定位观察，为进一步研究这些蛋白打下了基础。具体结果如下： 1．根据PCV-2核酸序列设计合成特异性引物，采用融合PCR技术对影响PCV-2 orf3在***中表达的稀有密码子进行改造，构建了pGEX-4T-1-orf3表达载体，同时我们也构建了PCV-2 orf4、orf5基因的原核表达系统。 ***-PAGE电泳和Western blot分析表明，PCV-2 orf3、orf4和orf5基因编码产物在***中成功表达，并可被抗GST多抗特异识别，其分子量分别为37.7、32.5和35kDa。同时，改造后的orf3基因成功表达也证明稀有密码子是影响外源基因在***中表达的重要因素。 3．重组蛋白PCV-2 orf3和orf4经超声波裂解后SDS-PAGE电泳分析，这两种重组蛋白在***中以包涵体形式存在，包涵体蛋白虽经溶解变性及复性处理，用Hitrap亲和柱纯化蛋白仍没有得到纯化蛋白，说明PCV-2 orf3、orf4的编码蛋白与GST融合后可能改变了原有GST蛋白的空间构象，影响与亲和琼脂糖凝胶的结合。我们用割胶法纯化重组PCV-2 orf3和orf4蛋白用于制备其单克隆抗体。 4．为研究PCV-2 orf3，orf4，orf5基因编码产物在真核PK-15细胞中的表达和定位，构建了pEGFP-orf3、pEGFP-orf4、pEGFP-orf5真核表达载体，共聚焦荧光显微镜观察证实这三种重组基因所编码蛋白都能在真核细胞表达，被转染细胞呈现萎缩和凋亡，指示重组PCV-2 orf3、orf4、orf5蛋白对PK-15细胞有一定毒性;从细胞定位的角度看，这三种重组蛋白在PK-15细胞的细胞核和细胞浆内都出现了绿色荧光。

关键词：猪圆环病毒(PCV-2) orf3基因 orf4基因 orf5基因原核表达真核表达纯化

猪圆环病毒II型orf4表达缺失株的构建及其功能研究

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猪圆环病毒II型ORF4表达缺失株的构建及其功能研究

作者：高章照浙江理工大学

学位级别：硕士

目的猪圆环病毒II型(PCV2)作为断奶仔猪多系统衰竭综合症(PMWS)的主要病原，对养猪业造成重大经济损失。同时，PCV2可能存在人畜共患病原的潜在威胁，但PCV2的致病机制目前仍不十分清楚。在PCV2分子致病机理研究中，已有3个开放阅读框(O... 详细信息

目的猪圆环病毒II型(PCV2)作为断奶仔猪多系统衰竭综合症(PMWS)的主要病原，对养猪业造成重大经济损失。同时，PCV2可能存在人畜共患病原的潜在威胁，但PCV2的致病机制目前仍不十分清楚。在PCV2分子致病机理研究中，已有3个开放阅读框(orfs)的功能得到验证：orf1表达Rep和Rep’两个复制相关蛋白，参与病毒复制;orf2表达病毒蛋白外壳;orf3编码蛋白参与病毒介导的细胞凋亡。orf4重叠于orf3内，其对于病毒致病机制的功能尚不清楚。本研究通过构建PCV2orf4表达缺失突变病毒，研究该蛋白于病毒复制和介导细胞凋亡的作用。同时，在本课题组前期工作确定orf3/orf4发生转录并获得相关3’ poly(A)加尾位点的基础上，对orf3/orf4转录产物的5’端起始位点进行确认，为orf4基因功能研究奠定基础，为研究PCV2致病机理提供新的研究方法和理论依据。方法首先，在课题组已获得PCV2基因组全长序列的基础上，对序列进行分析，选择病毒突变位点。通过起始密码子突变和引入无义突变使突变后的阅读框转录产物在蛋白翻译过程中提前终止，从而无法产生有效蛋白。依据PCR定点突变试剂盒原理构建突变体质粒，经酶切回收病毒基因组片段，在自环化反应后转染PK-15宿主细胞以产生突变病毒。产生的病毒通过检测体外复制能力、RNA剪接和外壳蛋白的形成，最终确定重组及突变病毒的完整性和感染力。构建了荧光定量检测体系，并利用该体系检测等拷贝数野生型、重组野生型和突变型病毒感染细胞后病毒DNA拷贝数和orf1、orf3、orf4mRNA表达量差异，分析orf4蛋白缺失对病毒复制的影响。在病毒感染细胞凋亡分析中，通过caspase家族活性检测，检测重组野生型和突变型病毒在病毒介导细胞凋亡功能上的差异。最后，利用5’ RACE技术对orf4基因mRNA5’末端转录起始位点进行鉴定。结果(1)成功构建了具有体外感染能力的重组野生型和突变型病毒，并且突变病毒的突变位点在连续传代第十五代病毒中仍然存在。(2)成功构建了可用于病毒滴度及多个orf mRNA表达量测定的荧光定量检测体系，定量范围为2.53×102.53×107拷贝数之间(R2>0.99)。(3)通过检测等滴度野生型、重组野生型和突变型病毒感染细胞后病毒拷贝数和mRNA表达量上的变化，发现orf4与病毒复制能力无关。同时各mRNA表达量检测中发现，orf4蛋白缺失不影响orf4mRNA表达。orf4蛋白的缺失提高了orf3的mRNA表达水平而参与病毒介导的细胞凋亡。同时，该蛋白缺失使病毒在感染周期中有更高效的复制活性，表现为orf1的高表达。(4)检测了重组野生型和突变型病毒在介导细胞凋亡的作用，发现orf4缺失使病毒介导细胞凋亡能力提高。(5)通过5’ RACE技术检测到一个nt593位置的5’端位点，并通过PCR方法将其对应于nt246位置poly(A)加尾位点，该转录产物为orf4所有。

关键词：猪圆环病毒II型(PCV2) orf4基因病毒复制细胞凋亡 5’RACE

猪繁殖与呼吸综合征病毒BD株的分离及GP4基因的克隆

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广东畜牧兽医科技 2011年第3期36卷 33-35页

作者：王金凤张会民袁万哲孙继国河北农业大学动物科技学院河北保定071001

从河北保定分离到一株疑似猪繁殖与呼吸综合征病毒,接种Marc-145细胞,经过两代盲传后,出现细胞病变,经鉴定为PRRSV,命名为BD株。根据GenBank公布的PRRSV JXA1株orf4基因的核苷酸序列,设计并合成一对特异性引物,用RT-PCR方法扩增完整orf... 详细信息

从河北保定分离到一株疑似猪繁殖与呼吸综合征病毒,接种Marc-145细胞,经过两代盲传后,出现细胞病变,经鉴定为PRRSV,命名为BD株。根据GenBank公布的PRRSV JXA1株orf4基因的核苷酸序列,设计并合成一对特异性引物,用RT-PCR方法扩增完整orf4基因,将扩增产物连接到pMD19-T载体并转化克隆菌,将阳性重组质粒PMD-GP4进行测序分析。应用DNA St ar软件,将测序结果与国内外已发表毒株的orf4基因进行序列比较,并绘制系统进化树。结果表明,BD株与JXA1、HB-3株遗传关系均较近。这为研制防治PRRSV的新型疫苗及诊断方法奠定了基础。

关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒 BD株 orf4基因

猪圆环病毒Ⅱ型河南地方株orf4的克隆及原核表达

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河南科技学院学报（自然科学版） 2014年第4期42卷 52-55,61页

作者：郑鸣王老七边传周王永芬河南牧业经济学院生物工程系河南郑州450011

根据GenBank数据库中猪圆环病毒Ⅱ型的基因组序列设计引物,采用PCR技术从病料基因组DNA中扩增出PCVⅡ河南地方株orf4基因,全长180 bp,编码59个氨基酸.将该基因克隆至载体pGEX-4T-3中形成pGEX-4T-3-orf4表达载体.经PCR、酶切和测序鉴定后... 详细信息

根据GenBank数据库中猪圆环病毒Ⅱ型的基因组序列设计引物,采用PCR技术从病料基因组DNA中扩增出PCVⅡ河南地方株orf4基因,全长180 bp,编码59个氨基酸.将该基因克隆至载体pGEX-4T-3中形成pGEX-4T-3-orf4表达载体.经PCR、酶切和测序鉴定后,转化表达菌株BL21(DE3)诱导表达.SDS-PAGE结果显示:orf4能够在大肠杆菌中表达,产物的分子量约为32 kD,且以包涵体形式存在.Western Blot检测结果显示,纯化后的orf4蛋白能够与鼠抗6×His标签单克隆抗体发生特异性反应,为进一步研究PCVⅡorf4蛋白的特性与功能奠定了基础.

关键词：猪圆环病毒Ⅱ型 orf4基因原核表达