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猪附红细胞体orf4基因片段的人工合成及基因表达

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中国人兽共患病学报 2011年第4期27卷 287-290页

作者：周栋陈甜甜刘建柱成子强张利刘海涛张璐刘永夏柴同杰山东农业大学山东省动物生物技术与疫病防治重点实验室泰安271018

目的本研究通过人工合成猪附红细胞体orf4基因,使其在大肠杆菌中高效表达。方法选择GenBank注册的AJ504999序列的orf4基因,应用Graphical Codon Usage Analyser选择大肠杆菌偏爱的密码子,改变基因的transl_table,设计并合成3对寡核苷酸... 详细信息

目的本研究通过人工合成猪附红细胞体orf4基因,使其在大肠杆菌中高效表达。方法选择GenBank注册的AJ504999序列的orf4基因,应用Graphical Codon Usage Analyser选择大肠杆菌偏爱的密码子,改变基因的transl_table,设计并合成3对寡核苷酸链,用PCR-based accurate synthesis（PAS）法进行人工合成。经测序正确后,连接到表达载体PET28a,获得重组表达质粒PET28a/orf4,导入大肠杆菌BL21（DE3）,在30℃,IPTG终浓度1mmol/L的条件下诱导表达,经SDS-PAGE分析,在11 kDa附近出现目的片段。结果结果表明orf4基因在大肠杆菌中能够得到高效的表达,通过生物信息学软件分析表明,该蛋白存在19个配基结合位点;在21~22位氨基酸可能存在信号肽裂解位点;为胞内蛋白,没有糖基化位点。结论 orf4基因能够在大肠杆菌中表达,推测其在***蛋白质的形成,***的生物功能方面有着重要的作用。

关键词：猪附红细胞体 orf4 全基因合成表达

鲤疱疹病毒Ⅱ型orf4基因的克隆、表达与免疫学检测方法

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淡水渔业 2017年第1期47卷 61-65页

作者：周勇范玉顶徐进马杰江南刘文枝曾令兵中国水产科学研究院长江水产研究所武汉430223

根据鲤疱疹病毒II型(Cyprinid herpesvirus Ⅱ,Cy HV-2)orf 4基因序列(Gen Bank:JQ815364.1)设计特异性引物,PCR扩增得到orf 4基因编码框全长序列1 041 bp,将其克隆至原核表达载体p ET-32a(+)中,构建了重组原核表达载体p ET-32a-orf 4。... 详细信息

根据鲤疱疹病毒II型(Cyprinid herpesvirus Ⅱ,Cy HV-2)orf 4基因序列(Gen Bank:JQ815364.1)设计特异性引物,PCR扩增得到orf 4基因编码框全长序列1 041 bp,将其克隆至原核表达载体p ET-32a(+)中,构建了重组原核表达载体p ET-32a-orf 4。将p ET-32a-orf 4重组载体转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导得到融合表达的重组蛋白,融合表达的重组蛋白主要以包涵体的形式存在,其分子质量约为57 ku,与预期大小一致。将纯化的重组蛋白免疫日本大耳兔,制备了多克隆抗体,ELISA检测抗体效价大于1∶50 000,Western blot检测显示该抗体可以特异性识别重组蛋白。间接免疫荧光检测结果表明:该多克隆抗体可与由Cy HV-2感染引起细胞病变的异育银鲫脑组织细胞(GICB)发生特异性的结合。

关键词：鲤疱疹病毒Ⅱ型 orf4 原核表达多克隆抗体免疫荧光检测

2株猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲型分离株orf4～7基因的克隆与序列分析

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中国兽医学报 2013年第11期33卷 1623-1626页

作者：黄梅清车勇良陈少莺江斌王隆柏陈仕龙福建省农业科学院畜牧兽医研究所福建福州350013 福建省畜禽疫病防治工程技术研究中心福建福州350013

欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)FJ0602和FJ0603株的orf4～7基因进行了分段克隆、序列测定及同源性比较。结果显示,FJ0602和FJ0603株与LV核苷酸同源性为95.2%和95.3%,与VR2332核苷酸同源性为67.1%和66.9%,证实FJ0602和FJ0603株均为欧洲型PRRSV;与欧洲型弱毒疫苗株Amervac PRRSV有高度同源性,达到98.6%以上,提示分离毒PRRSV FJ0602和FJ0603株可能由疫苗株演化而来。FJ0602和FJ0603之间的核苷酸同源性为99.6%,表明这2毒株亲缘关系很近,很可能来源于同一毒株。

关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲型 orf4 7 序列分析

猪圆环病毒2型orf4基因的原核表达及多克隆抗体的制备

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浙江农业学报 2014年第1期26卷 34-39页

作者：王净修高章照姜永厚吴海港饶品彬全滟平徐辉浙江理工大学生命科学学院浙江杭州310018 浙江省动物疫病预防控制中心浙江杭州310020

猪圆环病毒2型（PCV2）是引起断奶仔猪多系统衰竭综合征（PMWS）的主要病原，orf4是PCV2中继orf1，orf2，orf3之后的第四大开放阅读框。本研究以提取的PCV2基因组为模板经PCR扩增获得orf4基因（386～565 nt），并克隆到pGEX-4T-1表达载... 详细信息

猪圆环病毒2型（PCV2）是引起断奶仔猪多系统衰竭综合征（PMWS）的主要病原，orf4是PCV2中继orf1，orf2，orf3之后的第四大开放阅读框。本研究以提取的PCV2基因组为模板经PCR扩增获得orf4基因（386～565 nt），并克隆到pGEX-4T-1表达载体上，构建pGEX -4T-orf4表达载体。经PCR和测序鉴定后，将重组质粒转化受体菌BL21诱导表达并进行目的蛋白GST-orf4纯化，然后用纯化的蛋白免疫新西兰兔，在免疫期间采血并用间接ELISA对多抗血清进行效价测定。 SDS-PAGE电泳检测结果表明，重组质粒成功表达了目的蛋白。 ELISA检测结果显示抗体效价达到1∶12800以上。 Western blot分析表明orf4融合蛋白具有很好的免疫原性，获得的抗体可以和大肠杆菌表达的GST-orf4融合蛋白特异性反应。

关键词：猪圆环病毒2型 orf4 原核表达多克隆抗体

黄河三角洲地区PRRSV的分离鉴定及orf4、orf5基因遗传特性分析

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动物医学进展 2012年第6期33卷 37-41页

作者：吴忆春山东滨州职业学院生物工程学院山东滨州256603

采集黄河三角洲地区某猪场发生高热症死亡的仔猪病料,处理后接种Marc-145细胞,传代2代以后出现明显细胞病变,其病毒TCID50为10-4.625/mL,采用PCR检测细胞培养物中伪狂犬病病毒、猪瘟病毒、猪圆环病毒,均为阴性。采用第2代细胞培养物人... 详细信息

采集黄河三角洲地区某猪场发生高热症死亡的仔猪病料,处理后接种Marc-145细胞,传代2代以后出现明显细胞病变,其病毒TCID50为10-4.625/mL,采用PCR检测细胞培养物中伪狂犬病病毒、猪瘟病毒、猪圆环病毒,均为阴性。采用第2代细胞培养物人工感染仔猪,仔猪出现高热、咳嗽、发绀、耳朵发紫、死亡等临床表现,剖检发病猪可见明显的间质性肺炎表现,采集肺、脾、肾和淋巴结等组织进行PCR检验,均能检测到PRRSV,初步认为分离到一株高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒,命名为HSJ-1102株。对该分离株orf4、orf5基因进行扩增与克隆测序,序列分析表明,该分离株orf4基因序列与JXA1、Ch1-a等毒株的同源性较高,在97.4%～99.3%之间,与VR2332等毒株同源性低于90%;分离株orf5基因序列与JXA1等毒株同源性为97%～99.8%,与Ch1-a,VR2332等毒株同源性较低,分别为92.5%和86.4%。

关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒分离鉴定 orf4 orf5

猪繁殖与呼吸综合征病毒orf4/orf5基因区间的反向遗传操作:插入外源序列特性研究

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中国动物传染病学报 2012年第6期20卷 16-22页

作者：丛雁方张可煜高飞韦祖樟郑浩童光志袁世山郑海红中国农业科学院上海兽医研究所动物传染病研究室上海200232 中国农业科学院上海兽医研究所动物药学研究室上海200232

猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)orf4/orf5基因间隔区有10个核苷酸(nucleotide,nt),为了探索orf4/orf5基因间隔区作为外源基因插入靶点的可行性,本研究通过突变PCR技术,获得一系列orf4/orf5间在不同位置插入不同碱基数及特定序列的突变体,随后进行了病毒拯救和复制分析。结果表明,在orf4/5的10 nts间隔序列之前至少可插入13 nts;在间隔序列之后只能允许3 nts的插入;间隔序列之间能允许至少18 nts的插入,但允许插入的序列具有特异性,由此,暗示orf4/5允许插入的外源序列与插入位置有关。本研究获得的诸多突变病毒为进一步研制PRRSV基因标识疫苗奠定了基础。

关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒 orf4 orf5基因间隔区外源序列病毒感染性

猪圆环病毒Ⅱ型orf4真核表达载体构建及其抗体制备

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中国农学通报 2014年第2期30卷 60-64页

作者：孟凡伟王俊单晶晶周双海李雅慧高晓波北京农学院动物科学技术学院北京102206

为构建猪圆环病毒II型(PCV2)orf4基因的真核表达载体,并制备orf4抗体。用PCR方法扩增PCV2 orf4基因,将其克隆入真核表达载体pCDNA3.1(+)或pEGFP-C1,成功构建出重组质粒pCDNA-orf4、pEGFP-orf4。重组质粒pEGFP-orf4转染PK15细胞后,pEGFP-orf4蛋白在细胞中明显表达,荧光信号主要定位于细胞核内。重组质粒pCDNA-orf4接种BALB/c小鼠后,接种小鼠血清能与PCV2发生特异性免疫反应,经4次接种后抗体效价均达到1:26以上,表明诱导产生了PCV2 orf4抗体。研究结果表明,构建了2种PCV2 orf4真核表达载体,并制备了PCV2 orf4抗体,为PCV2orf4基因功能研究奠定了基础。

关键词：猪圆环病毒II型 orf4 真核表达载体 orf4抗体

山东地区猪繁殖与呼吸综合征病毒的分离鉴定及orf4、orf5基因遗传特性分析

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山东地区猪繁殖与呼吸综合征病毒的分离鉴定及ORF4、ORF5基因遗传...

大蒜X病毒逆转录环介导等温扩增检测方法的建立

中国畜牧兽医学会兽医公共卫生学分会第三次学术研讨会

作者：唐娜曲光刚王金良苗立中肖跃强张倩沈志强山东省滨州畜牧兽医研究院兽医生物技术重点实验室山东绿都生物科技有限公司

采集2011年山东某猪场发生高热死亡的仔猪血液,处理后接种MARC-145细胞,传代4代以后出现稳定的细胞病变,其病毒TCID50为10-4.2/mL,采用RT-PCR扩增细胞培养物中猪繁殖与呼吸综合征病毒orf7基因,出现明显阳性条带,结合PRRSV特异性抗血清... 详细信息

采集2011年山东某猪场发生高热死亡的仔猪血液,处理后接种MARC-145细胞,传代4代以后出现稳定的细胞病变,其病毒TCID50为10-4.2/mL,采用RT-PCR扩增细胞培养物中猪繁殖与呼吸综合征病毒orf7基因,出现明显阳性条带,结合PRRSV特异性抗血清中和试验,初步认为分离到一株猪繁殖与呼吸综合征病毒,命名为SDBZ11株。对该分离株orf4,orf5基因进行扩增与克隆测序,序列分析表明,分离株orf5基因序列与JXA1等毒株同源性为97.2%～99.3%,与CH1-a、经典美洲株VR2332株的同源性分别是94.5%、87.9%;分离株orf4基因序列与JXA1等高致病性毒株的同源性较高,在96.5%～99.7%之间,与VR2332的同源性低于90%。

关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒分离鉴定 orf4 orf5

来源： cnki会议评论

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cnki会议

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浙江农业学报 2013年第6期25卷 1326-1331页

作者：赵桐李长红周前进陈先锋陈炯陈剑平宁波大学生物化学与分子生物学实验室浙江宁波315211 宁波检验检疫科学技术研究院浙江宁波315012 浙江省农业科学院农业部植物保护和生物技术重点实验室浙江杭州310021

采用逆转录环介导等温扩增技术(RT-LAMP),建立一种便捷、灵敏的大蒜X病毒(Garlic virus X,GarVX)的快速检测方法。根据GarVX orf4序列的保守区设计6条特异性引物,分别识别该保守区的8个位点,在反转录酶和Bst DNA聚合酶的作用下对靶序列... 详细信息

采用逆转录环介导等温扩增技术(RT-LAMP),建立一种便捷、灵敏的大蒜X病毒(Garlic virus X,GarVX)的快速检测方法。根据GarVX orf4序列的保守区设计6条特异性引物,分别识别该保守区的8个位点,在反转录酶和Bst DNA聚合酶的作用下对靶序列进行扩增反应。通过条件优化,在65℃恒温条件下温浴60 min可成功检测GarVX。特异性检测结果表明,该方法可特异性检出GarVX,对大蒜A病毒(Garlic virus A,GarVA)、大蒜D病毒(Garlic virus D,GarVD)、大蒜E病毒(Garlic virus E,GarVE)等的检测均为阴性,且检测灵敏度高,最低检出限为5 pg·μL-1,是RT-PCR方法的10倍。试验结果表明,RT-LAMP检测方法可快速、特异、灵敏地检测GarVX,并适合现场快速检测。

关键词：大蒜X病毒 orf4 逆转录环介导等温扩增